Larva Zebra Balıklarında Hedef Sinyalizasyon Yanıtlarının İzlenmesi - Z-REX Elektrofilik İlaçların ve Metabolitlerin Hassas Mekanizmalarının Maskesini Çıkarır

Ve böylece Z-REX'ten yararlanan araştırmacılar, Zebra balığı larvalarında yakın fizyolojik koşullara ilgi duyan belirli bir proteinle etkileşime giren belirli bir reaktif ligand'a yanıt olarak bireysel sinyal tepkilerinin nasıl değiştirildiğini sorgulayabilirler. Toplu doz reaktif küçük moleküller gibi konvansiyonel yöntemler, hedeflere ve toksisiteye neden olur ve ligand hedef özgüllüğü üzerinde hiçbir kontrol sağlamaz. Z-REX, belirli bir ligand hedef etkileşimini yüksek uzaysal zamansal hassasiyete sahip belirli bir fenotiple bağlayabilir.

Son zamanlarda, Z-REX tarafından keşfedilen ilişkili bir hedef ve yol olan reaktif metabolit HNE'nin, üçlü negatif meme kanserlerine karşı hassas izoforma özgü kinaz inhibitörlerinin geliştirilmesini nasıl sağladığını gösterdik. Embriyoları, taze% 10 Hank'in dengeli tuz çözeltisi veya HBSS ile doldurulmuş bir enjeksiyon plakasının oluklarına hizalayarak başlayın. İğne ucunu ortama batırın ve gerekirse, uçtaki hava kabarcıklarını gidermek için enjeksiyon darbeleri uygulayın Embriyoyu enjekte etmek için, koryon ve yumurta sarısı kesesine tek bir harekette nüfuz edin ve bir enjeksiyon darbesi uygulayın.

Diğer embriyoları enjekte ettikten sonra, bir fışkırtma şişesi kullanarak taze HBSS ortamı içeren yeni bir Petri kabına durulayın. Enjekte edilmeyen embriyoları başka bir plakada toplayın. Z-REX tedavi analizi yapmak için, enjekte edilen embriyoları 10 santimetrelik kaplara dağıtarak başlayın.

Kırmızı ışıklı karanlık bir odada, ortamı REX probunun bir mikromolarlı olsun veya olmasın 30 mililitre% 10 HBSS ile değiştirin. Embriyoları karanlıkta 28.5 santigrat derecede inkübe edin. Döllenmeden 30 saat sonra, medyayı karanlıkta değiştirin.

İnkübasyon ve ortam değişimini iki kez tekrarladıktan sonra, embriyoları her 30 saniyede bir dönen önceden ısıtılmış bir UV lambasından ışığa maruz bırakın. Fenotipik bir tahlil yapmak için, döllenmemiş veya ölü embriyoları anestezi uygulanan embriyoları içeren plakadan çıkarın. Keskin forseps kullanarak, embriyoların koryonunu çıkarın.

Embriyoları %10 HBSS besiyeri ile hazırlanan %2'lik agaroz plakasına monte edin ve stereomikroskop altında gözlemleyin. Her balığın nötrofil ve makrofaj sayısını saymak için ImageJ'yi kullanın. Serbest El Seçimi'ni seçin ve tüm balığın etrafında dönün, ardından floresan hücreleri saymak için Maxima'yı Bul seçeneğini belirleyin Bu çalışmada, Z-REX ile tedavi edilen embriyolar nötrofil ve makrofaj kaybı göstermiştir.

Bu etki tedavi edilmeyen gruplarda yoktu. Apoptoz sinyal yolu Halo-P2A-Keap1 grubunda tetiklenmedi ve değişmemiş makrofaj ve nötrofil seviyelerine neden oldu. Benzer sonuçlar, HNE'ye cevap vermeyen Halo-TEV-Keap1 mutantında da gözlenmiştir.

Transkripsiyonel ve gerçek zamanlı kantitatif PCR analizleri, Z-REX sonrası immün ile ilişkili genlerin aşağı regülasyonunu ve antioksidan genlerin upregülasyonunu göstermiştir. İmmünofloresan boyama, P2A-split-construct'ın, benzer ekspresyon seviyelerinin göstergesi olan TeV-fusion-construct'tan iki kat daha fazla HA etiketine sahip olduğunu gösterdi. Vahşi tip ve mutant tip Halo-TeV-Keap1'in ekspresyon seviyeleri de benzerdi.

Z-REX ile tedavi edilen transgenik nötrofil muhabir hattında, nötrofillerin ve aktif kaspaz 3'ün kolokalizasyonu da gözlendi. En önemli şey, belgelerinizin doğru şekilde ayarlanmasıdır. Sınırlama, sonuçlarınızı gerçekten iyileştirecektir.

Localis-REX olarak bilinen bir ilaç tarama platformuna bir fikir olan Z-REX'i benimsedik. Şimdiye kadar başka hiçbir teknik bu kadar yerel, spesifik ve reaktif ligand veya hedef haritalaması başaramamıştır. Meme kanseri tedavisine yönelik elektrofilik ilaç adayları geliştirmemize yardımcı olmuştur.

Kanser, immünoloji, yaşlanma vb. birçok alanda lokalize sinyalizasyonun artan önemi göz önüne alındığında, lokalize reaktif ligand tarafından yönlendirilen olayları haritalayabilen tek araç olan Z-Rex, çok sayıda alana yardımcı olmayı vaat ediyor.