Bu protokol, mikrovasküler fragmanlardan veya MVF'lerden üç boyutlu vaskülarize ve fonksiyonel termojenik yağın oluşumunu tanımlar. termojenik yağ dokusunun mühendisliği için mevcut stratejiler karmaşıktır ve çok hücreli ve fonksiyonel özelliklerini tam olarak tasvir etmemektedir. MVF'ler vaskülarizasyon ve yağ dokusu oluşumunu sağlayan tek bir hücre kaynağıdır.
Bej yağın biyolojik taklitlerini oluşturmak için basit bir tek kaynaklı yöntem olan MVF'ler, obezite ve metabolik hastalıklara yönelik tedavilerin anlaşılmasını veya geliştirilmesini teşvik etmek için önemli bir potansiyele sahiptir. % 70 etanol ile muamele edilmiş uygun şekilde traş edilmiş ve ötenazi edilmiş hayvanı sırtüstü pozisyonda yerleştirin ve kasık yağının izolasyonuna başlayın. Cildi penisin altına bir çift makasla kaldırın ve tüm yağ birikintisine erişmek için hayvanın arka tarafına ilmek atmadan önce, merkezden başlayıp yanal olarak keserek, bir V şekli oluşturarak insizyonu gerçekleştirin.
Kesim yaparken, birbirine bağlı fasya dokusunu keserek cildin yağdan ayrılmasını sağlayın. Fasya uygun şekilde kesildikten sonra, kasıklardan arkaya doğru uzanan her iki taraftan da kasık yağının görülebildiğinden emin olun. Daha sonra, PBS'de 10 mililitre BSA içeren ve mililitre başına bir miligram konsantrasyonuna sahip ayrı konik tüplerde yağı iki taraftan çıkarın.
Epididim yağını toplamak için, karın derisini kesin, ardından testisleri çevreleyen ince tabakayı dikkatlice kesin. Forseps kullanarak yağ dokusunu yavaşça çekin ve herhangi bir büyük görünür kan damarının diseksiyonundan kaçınırken makas kullanarak kesin. Şimdi, çıkarılan yağı PBS'de mililitre BSA başına 10 mililitre bir miligram içeren 50 mililitrelik bir konik tüpe yerleştirin.
Posterior subkutan yağını izole etmek için, sıçanı eğilimli hale getirin ve sırtın kalın derisini kafa derisine kadar kesmek için büyük makas kullanın, cildin altında çok derin kesmemeye dikkat edin. Cildi dokuya bağlayan fasyayı kesin. İntraskapular bölgede bulunan subkutan yağını, PBS'de mililitre BSA başına 10 mililitre bir miligram içeren 50 mililitrelik bir konik tüpe izole etmeden ve yerleştirmeden önce omurgaya daha yakın bulunan kahverengi yağdan ayırt edin.
Bir biyodavlumbazın içinde çalışırken, eksize edilen yağı PBS'de mililitre BSA başına 0.5 mililitre bir miligram içeren standart bir 100 mililitre Petri kabına yerleştirmek için forseps kullanın. Görünür kan damarlarını, kasları veya yabancı dokuları yağdan çıkarın. Makas kullanarak, yağı 10 dakika boyunca kıyın ve biraz daha BSA ekleyerek topakları kontrol edin.
Gerekirse, kıyılmış yağ süspansiyonunu 10 mililitrelik pipetle steril 250 mililitrelik bir şişeye aktarmadan önce kıymaya devam edin. PBS'ye yeterli BSA ekleyerek şişedeki hacmi 20 mililitreye kadar çıkarın. Şimdi BSA'yı PBS'ye kollajenaza ekleyin ve çözeltiyi 0,22 mikronluk naylon bir net filtreden steril olarak filtrelemeden önce hafifçe çalkalayarak homojenize edin.
Hemen gerekli miktarda kollajenaz çözeltisini kıyılmış yağ süspansiyonuna ekleyin ve şişeyi uygun bir süre boyunca 37 santigrat derecede bir su banyosunda dairesel bir hareketle sallayarak yağı sindirin. Sindirilmiş yağı, sindirilmiş yağ veya kıyılmış yağ etiketli 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Mikrovasküler parçaları veya MVF'leri kırmızı bir pelet haline getirmek için tüpü dört dakika boyunca 400 G'de santrifüj edin.
Süpernatantı pelet rahatsız etmeden atık etiketli 50 mililitrelik konik bir tüpe yavaşça boşaltın. Daha sonra, pelet içeren tüpe PBS'de mililitre BSA başına 10 mililitre bir miligram ekleyin ve pelet süspansiyonunu, parçaları bozmadan hafifçe yukarı ve aşağı iki kez pipetleyerek karıştırın. Şimdi, PBS'de mililitre BSA başına beş mililitre bir miligram içeren steril bir Petri kabına önceden batırılmış 500 mikronluk ekranı alın ve yeni bir Petri kabında tutulan plastik ekran tutucunun üzerine yerleştirin.
Pipet, sindirilmiş pelet tüpünden eşmerkezli daireler halinde ekrana 10 mililitre süspansiyon. Filtreyi PBS'de mililitre BSA başına beş mililitre ilave bir miligram ile yıkayın ve Petri kabının içindeki filtratı korurken atın. Ardından, önceden ıslatılmış 37 mikronluk ekranı yeni bir Petri kabı üzerindeki plastik ekran tutucunun üzerine yerleştirin.
Yeni bir pipet kullanarak, filtratı ilk filtrasyondan eşmerkezli daireler halinde ekrana aktarın. Daha önce açıklandığı gibi, ekranı PBS'de BSA ile yıkayın ve bu sefer 37 mikronluk ekranı korurken filtreyi atın. 37 mikronluk ekranı, PBS'de mililitre BSA başına beş mililitre bir miligram içeren yeni bir Petri kabına kaydırın.
Herhangi bir sıvı dökmeden, çanağı konik bir tutucuya hafifçe vurarak parçaları yerinden çıkarın. Filtreyi PBS'de ilave beş mililitre BSA ile durulayın. Daha sonra, sıvıyı Petri kabından steril 50 mililitrelik bir konik tüpe aktarın.
37 mikronluk ekranı birkaç kez daha durulayın, toplanan toplam hacim 15 ila 20 mililitre olana kadar yıkamayı konik tüpe ekleyin. Son durulamadan sonra ekranı atın. 20 mikrolitrelik pipet ucunun ucunu makas kullanarak kesin.
Kesilmiş pipet ucunu kullanarak 20 mikrolitrelik iki alikot çekmeden önce sıvıyı içeren tüpü yavaşça çalkalayın ve alikotların her birini temiz bir 35 milimetrelik Petri kabına pipetin. Standart bir ışık mikroskobu kullanarak her Petri kabındaki numunedeki fragman sayısını sayın ve makalede belirtilen formülü kullanarak, izole edilmiş mikrovasküler fragmanların toplam sayısını elde edin. MVF'yi toplamak için 50 mililitrelik konik tüpte kalan sıvıyı dört dakika boyunca 400 G'de döndürün.
Eğirme işleminden sonra, süpernatantın çoğunu konik tüpten boşaltın ve tüpün kenarında kalan küçük hacimli sıvıyı çıkarmak için bir pipet kullanın. Daha sonra, jelleri dökmek için belirlenen kuyucuklara trombin ekleyin. 200 mikrolitrelik pipet ucunun ucunu kesin ve bunu kullanarak, istenen son yoğunluğu elde etmek için MVF'leri fibrinojen içinde nazikçe askıya alın.
Süspansiyonu kuyucuktaki trombin çözeltisine pipetleyin ve yukarı ve aşağı pipetleyerek karışımı hızlı bir şekilde homojenize edin. Tüm jeller döküldükten sonra, jelin çapraz bağlanmasına izin vermek için kuyu plakasını 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte yaklaşık 15 dakika boyunca bir inkübatöre yerleştirin. Lipidler ve farklılaşmış adipositler, lipid boyası olarak BODIPY kullanılarak hidrojellerin konfokal mikroskopi görüntülemesi ile gözlendi.
Beyaz adipojenik veya bej adipojenik medya kullanılarak vaskülarize edilmemiş yağ dokusunun kültürlenmesi, hem yağsız hem de diyabetik kemirgen kaynaklı MVF'lerden sırasıyla vaskülarize olmayan beyaz veya bej yağ dokusunun oluşmasına neden olmuştur. Benzer şekilde, beyaz adipojenik veya bej adipojenik medya kullanılarak vaskülarize yağ dokusunun kültürlenmesi, kemirgen kaynaklı MVF'lerden sırasıyla vaskülarize beyaz veya bej yağ dokusunun oluşmasına neden olmuştur.
MVF'lerin bej yağ dokusuna farklılaşma kabiliyeti RT-qPCR kullanılarak genetik olarak doğrulandı. Doğrudan beyaz adipojenik veya bej adipojenik ortama maruz kalan yağsız ve diyabetik Kemirgen MVF'ler adipogenez, termojenez ve anjiyogenez açısından değerlendirildi. Beklendiği gibi çözülen protein 1'in ekspresyonu, bej adipojenik dokuda anlamlı derecede yüksekti.
Benzer bir eğilim, dolaylı beyaz adipojenik veya bej adipojenik ortama maruz kalan kemirgen MVF'lerde ve ayrıca doğrudan beyaz adipojenik veya bej adipojenik ortama maruz kalan insan MVF'lerinde gözlenmiştir. Son olarak, mitokondriyal biyoenerjetik olarak, fonksiyonel olarak, bej yağ dokusunun her durumda karakteristik olarak daha yüksek oksijen tüketim oranına veya OCR seviyesine sahip olduğu açıktı. Yağ dokusunun enzimatik sindirimi, benzer boyut ve kalitede MVF'leri tutarlı bir şekilde çoğaltmak için optimize edilmelidir.
Sindirim sonrası, MVF'ler, parçaların daha fazla parçalanmasını önlemek için özel bir özenle nazikçe ele alınmalıdır. Bu teknik, tanıtılan faktörlere bağlı olduğu kanıtlanan damar büyümesi ve adiposit farklılaşması dengesini daha da ileri götürmeye yardımcı oldu.
