Questo protocollo descrive la generazione di grasso termogenico vascolarizzato e funzionale tridimensionale da frammenti microvascolari o MVF. Le attuali strategie per l'ingegneria del tessuto adiposo termogenico sono complesse e non descrivono completamente le sue proprietà multicellulari e funzionali. Gli MVF sono un'unica fonte di cellule che consentono la vascolarizzazione e la formazione del tessuto adiposo.
Essendo un semplice metodo di sola fonte per creare imitazioni biologiche del grasso beige, gli MVF hanno un potenziale significativo per promuovere la comprensione o lo sviluppo di trattamenti per l'obesità e le malattie metaboliche. Porre l'animale opportunamente rasato ed eutanasia trattato con etanolo al 70% in posizione supina e iniziare l'isolamento del grasso inguinale. Sollevare la pelle sotto il pene con un paio di forbici ed eseguire l'incisione, partendo dal centro e tagliando lateralmente, formando una forma a V, prima di passare al retro dell'animale per accedere all'intero deposito di grasso.
Durante il taglio, assicurarsi la separazione della pelle dal grasso tagliando il tessuto della fascia interconnessa. Una volta che la fascia è stata tagliata in modo appropriato, assicurarsi che il grasso inguinale da entrambi i lati, che si estende dall'inguine verso la parte posteriore, sia visibile. Quindi, rimuovere il grasso dai due lati in tubi conici separati contenenti 10 millilitri di BSA in PBS, con una concentrazione di un milligrammo per millilitro.
Per raccogliere il grasso dell'epididimo, tagliare la pelle addominale, seguita da un taglio accurato attraverso lo strato sottile che circonda i testicoli. Tirare delicatamente il tessuto adiposo con una pinza e ritagliarlo con le forbici, evitando la dissezione di tutti i principali vasi sanguigni visibili. Ora, posizionare il grasso rimosso in un tubo conico da 50 millilitri contenente 10 millilitri di un milligrammo per millilitro di BSA in PBS.
Per isolare il grasso sottocutaneo posteriore, girare il ratto incline e utilizzare grandi forbici per tagliare la pelle spessa della schiena fino al cuoio capelluto, facendo attenzione a non tagliare troppo in profondità sotto la pelle. Tagliare la fascia che collega la pelle al tessuto. Differenziare il grasso sottocutaneo, situato nella regione intrascapolare, dal grasso bruno situato più vicino alla colonna vertebrale prima di isolare e posizionare il grasso sottocutaneo in un tubo conico da 50 millilitri contenente 10 millilitri di un milligrammo per millilitro di BSA in PBS.
Mentre si lavora all'interno di una biocappa, utilizzare una pinza per posizionare il grasso asportato in una capsula di Petri standard da 100 millilitri contenente 0,5 millilitri di un milligrammo per millilitro di BSA in PBS. Rimuovere eventuali vasi sanguigni visibili, muscoli o tessuto estraneo dal grasso. Usando le forbici, tritare il grasso per 10 minuti e controllare la presenza di grumi aggiungendo un po 'di BSA.
Continuare a tritare, se necessario, prima di trasferire la sospensione di grasso tritato in un pallone sterile da 250 millilitri con una pipetta da 10 millilitri. Portare il volume nel pallone fino a 20 millilitri aggiungendo abbastanza BSA in PBS. Ora aggiungi BSA in PBS alla collagenasi e omogeneizza la soluzione agitandola delicatamente prima di filtrarla sterile attraverso un filtro in rete di nylon da 0,22 micron.
Aggiungere immediatamente la quantità necessaria di soluzione di collagenasi alla sospensione di grasso tritato e digerire il grasso agitando il pallone con un movimento circolare a bagnomaria a 37 gradi Celsius per il periodo di tempo appropriato. Trasferire il grasso digerito in un tubo conico da 50 millilitri etichettato grasso digerito o grasso tritato. Centrifugare il tubo a 400 G per quattro minuti per far girare i frammenti microvascolari, o MVF, in un pellet rosso.
Decantare delicatamente il surnatante in un tubo conico da 50 millilitri etichettato come rifiuto senza disturbare il pellet. Quindi, aggiungere 10 millilitri di un milligrammo per millilitro BSA in PBS al tubo contenente il pellet e mescolare la sospensione di pellet pipettandola delicatamente su e giù due volte senza interrompere i frammenti. Ora, prendi lo schermo da 500 micron pre-imbevuto di una piastra di Petri sterile contenente cinque millilitri di un milligrammo per millilitro di BSA in PBS e posizionalo sopra il supporto dello schermo di plastica tenuto su una nuova capsula di Petri.
Pipettare 10 millilitri di sospensione dal tubo di pellet digerito sullo schermo in cerchi concentrici. Lavare il filtro con altri cinque millilitri di un milligrammo per millilitro di BSA in PBS e scartarlo, mantenendo il filtrato all'interno della capsula di Petri. Quindi posizionare lo schermo da 37 micron pre-imbevuto sopra il supporto dello schermo di plastica su una nuova capsula di Petri.
Utilizzando una nuova pipetta, trasferire il filtrato dalla prima filtrazione sullo schermo in cerchi concentrici. Come descritto in precedenza, lavare lo schermo con BSA in PBS e, questa volta, eliminare il filtrato mantenendo lo schermo da 37 micron. Far scorrere lo schermo da 37 micron in una nuova capsula di Petri contenente cinque millilitri di un milligrammo per millilitro di BSA in PBS.
Rimuovere i frammenti picchiettando delicatamente il piatto contro un supporto conico, senza versare alcun liquido. Risciacquare il filtro con altri cinque millilitri di BSA in PBS. Quindi, trasferire il liquido dalla piastra di Petri in un tubo conico sterile da 50 millilitri.
Risciacquare lo schermo da 37 micron più volte, aggiungendo il lavaggio al tubo conico fino a quando il volume totale raccolto è da 15 a 20 millilitri. Eliminare lo schermo dopo il risciacquo finale. Tagliare l'estremità di una punta di pipetta da 20 microlitri usando le forbici.
Agitare delicatamente il tubo contenente il liquido prima di prelevare due aliquote da 20 microlitri utilizzando la punta della pipetta tagliata e pipettare ciascuna delle aliquote in una capsula di Petri pulita da 35 millimetri. Contare il numero di frammenti nel campione in ogni capsula di Petri usando un microscopio ottico standard e, usando la formula menzionata nel manoscritto, ottenere il numero totale di frammenti microvascolari isolati. Ruotare il liquido rimanente nel tubo conico da 50 millilitri a 400 G per quattro minuti per raccogliere l'MVF.
Dopo la centrifuga, decantare la maggior parte del surnatante dal tubo conico e utilizzare una pipetta per rimuovere il piccolo volume di liquido rimasto sul bordo del tubo. Quindi, aggiungere trombina nei pozzetti designati per la colata di gel. Tagliare l'estremità di una punta di pipetta da 200 microlitri e, utilizzandola, risospendere delicatamente gli MVF nel fibrinogeno per ottenere la densità finale desiderata.
Pipettare la sospensione nella soluzione di trombina nel pozzetto e omogeneizzare rapidamente la miscela pipettando su e giù. Una volta che tutti i gel sono stati colati, posizionare la piastra del pozzetto in un incubatore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per circa 15 minuti per consentire la reticolazione del gel. I lipidi e gli adipociti differenziati sono stati osservati mediante microscopia confocale degli idrogel utilizzando BODIPY come colorante lipidico.
La coltura di tessuto adiposo non vascolarizzato utilizzando mezzi adipogeni bianchi adipogenici o beige ha portato alla formazione di tessuto adiposo bianco o beige non vascolarizzato, rispettivamente, da MVF di derivazione magra e diabetica derivata da roditori. Allo stesso modo, la coltura di tessuto adiposo vascolarizzato utilizzando mezzi adipogeni adipogenici bianchi o beige ha portato alla formazione di tessuto adiposo bianco o beige vascolarizzato rispettivamente, dagli MVF derivati dai roditori. Anche il tessuto adiposo bianco e beige non vascolarizzato ottenuto da MVF umani è stato osservato mediante microscopia confocale.
La capacità degli MVF di differenziarsi in tessuto adiposo beige è stata confermata geneticamente utilizzando RT-qPCR. MVF di roditori magri e diabetici esposti a terreni adipogeni bianchi diretti o adipogeni beige sono stati valutati per adipogenesi, termogenesi e angiogenesi. L'espressione del disaccoppiamento della proteina 1, come previsto, era significativamente più alta nel tessuto adipogeno beige.
Una tendenza simile è stata osservata negli MVF di roditori esposti a terreni adipogeni bianchi indiretti o adipogenici beige, nonché negli MVF umani esposti a mezzi adipogeni bianchi diretti o adipogenici beige. Infine, dalla bioenergetica mitocondriale, era evidente che funzionalmente, il tessuto adiposo beige aveva un tasso di consumo di ossigeno caratteristicamente più elevato, o OCR, livello in tutti i casi. La digestione enzimatica del tessuto adiposo dovrebbe essere ottimizzata per riprodurre costantemente MVF di dimensioni e qualità simili.
Dopo la digestione, gli MVF devono essere maneggiati delicatamente, con particolare attenzione per evitare un'ulteriore rottura dei frammenti. Questa tecnica ha contribuito a promuovere l'equilibrio della crescita dei vasi e la differenziazione degli adipociti, dimostrando di dipendere dai fattori introdotti.
