Bu protokol, yetişkin fare dorsal kök gangliyon kültürlerinde nöron sayısını arttırmamızı sağlar. Bu, nöronal hücrelerin belirli bir cevaba katkısını belirlemeye yardımcı olabilir. Temel DRG kültür protokolüne bir immünopanning adımı ekledik.
Başlıca avantajı, nöronal olmayan hücrelere karşı seçim yapmaktır. Birincil DRG kültürlerinde yeniyseniz, mümkün olduğunca çok DRG elde etmek için diseksiyon uygulamak ve sinirin mümkün olduğunca çoğunu kesmek en iyisidir. Başlamak için, kültür plakasını kaplamak için kullanılan poli-D-lizini aspire edin ve plakayı doku kültürü suyuyla üç kez yıkayın.
Kapağı eğerek açın ve yüzeyin tamamen kurumasını bekleyin. Her bir kuyucuğun tabanını kaplamak için plakaya yeterli laminin uygulayın ve 37 santigrat derecede bir inkübatöre yerleştirin. Önceden hazırlanmış CD45, PDGFR-beta ve O4 tava kaplarını D-PBS ile yıkayın.
CD45 kabı için, 5 mililitre% 0.2 BSA ve 20 mikrolitre CD45 primer antikoru ekleyin. PDGFR-beta kabı için,% 0.2 BSA içeren 5 mililitre plakaya 15.2 mikrolitre PDGFR-beta ekleyin. O4 kabı için, nihai BSA konsantrasyonunun% 0.2'de kalmasını sağlamak için 3 mililitre% 0.2 BSA'ya 2 mililitre O4 hibridoma ve ilave 100 mikrolitre% 4 BSA ekleyin Daha sonra, ötenazi fareyi 30 mililitre% 0.9 buz gibi soğuk salin ile perfüze edin.
Perfüzyonu sağlamak için karaciğerin rengindeki değişimi gözlemleyin. Ön ve arka pençeleri strafor bir aşamaya sabitleyin ve omurgayı arkadan açığa çıkarmak için temiz bir tıraş bıçağı kullanın. Dorsal omuriliğin her iki tarafında yaklaşık yarıya kadar derin kesikler yaparak, omuriliği açığa çıkarmak için kolonun dorsal yarısını çıkararak laminektomi yapın.
Ya sinirleri yavaşça kesin ve omuriliği çıkarın ya da sinir bütünlüğünü koruyarak kordonu yavaşça yana doğru itin. Bir diseksiyon mikroskobu altında, omurganın her iki tarafındaki tüm dorsal kök gangliyonlarını veya DRG'leri bulmak ve çıkarmak için spinal sinir köklerini kullanın. Sinir kalıntılarını çıkarıldığı gibi her DRG'den ayırın, çünkü kültürdeki daha fazla sinir enkazı zayıf sağkalıma neden olabilir.
DRG'leri buz üzerinde konik bir tüpte 15 mililitre HBSS'de toplayın ve dibe çökelmelerini sağlayın. Bir pipet kullanarak, HBSS'nin çoğunu DRG'lerden aspire edin ve dokuyu kaybetmemek için tüpte yaklaşık 100 mikrolitre sıvı bırakın. 1 mililitre HBSS ile üç kez yıkayın ve dokuya 5 mililitre önceden çözülmüş çalışan STEMxyme çözeltisi ekleyin.
Kapağı şeffaf bir filmle örtün ve tüpü bir saat boyunca 37 santigrat derecelik bir su banyosunda yan tarafında yüzdürün. Enzim ile inkübasyondan sonra, tüpe 1 mililitre düşük ovomukoid inhibitör çözeltisi ekleyin. Hücreleri bir P1000 pipeti ile 10 ila 15 kez hafifçe üçe koyun ve doku parçalarının yerleşmesine izin verin.
Daha sonra, ayrışmış hücreler içeren çözeltinin üst 2 ila 3 mililitresini taze düşük ovomukoid çözeltiye aktarın ve doku tamamen ayrışana ve görünür parçalar kalmayana kadar tekrarlayın. Tüpü oda sıcaklığında 300 x g'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Daha önce gösterildiği gibi, bir pipet kullanarak süpernatantı çıkardıktan sonra, hücre peletini 1 mililitre kaydırma tamponunda yeniden askıya alın ve karıştırmak için hafifçe pipet yapın.
70 mikrometrelik bir hücre süzgecini 50 mililitrelik bir konik tüp üzerinde 1 mililitre kaydırma tamponu ile önceden ıslatın ve ardından hücre çözeltisini hücre süzgecinden filtreleyin. Tüpü 1 mililitre kaydırma tamponu ile yıkayın ve süzgeçten geçirin. Hücre katmanlaması için, 2 mililitre% 15 BSA ekleyin ve kapalı tüpün kenarlarını yavaşça kaplayın.
Miyelin kalıntılarını gidermek için, hücre süspansiyonunu, BSA yastığının üstüne, tüpün yan tarafına pipetleyerek her seferinde bir mililitre dikkatlice katmanlayın. Tüpü 300 x g'de oda sıcaklığında 10 dakika boyunca santrifüjleyin, yavaş hızlanma ve yavaşlama ile. Orta miyelin tabakası beyaz malzeme pullarını gösterir.
Bir P1000 pipet kullanarak, üstteki berrak sıvıyı, aradaki miyelin fazını ve BSA'yı, her seferinde bir mililitre çıkarın ve peletleri rahatsız etmemek için yaklaşık 100 mikrolitre bırakın. Antijen alımı için, 5 mililitre kaydırma tamponu ekleyin ve tüpü 30 ila 45 dakika boyunca 37 santigrat derece ve% 10 karbondioksit inkübatöründe inkübe edin. Daha sonra, inkübe edilmiş CD45 kabını D-PBS ile üç kez yıkayın ve son durulamayı dökün.
Ardından hücre süspansiyonunu CD45 kabına dökün. Çanağı oda sıcaklığında 20 dakika boyunca inkübe edin, hücrelerin antikora eşit erişim kazanmasını sağlamak için 10 dakikalık aralıklarla hafifçe döndürün. CD45 kabını yavaşça sallayın ve bir açıyla destekleyin.
Bağlanmamış hücreleri toplamak için hücre süspansiyonunun 1 mililitresini çanak üzerinde dikkatlice pipetin. Ardından, daha önce D-PBS ile üç kez yıkanmış PDGFR-beta kabına aktarın ve inkübe edin. Bağlanmamış hücreleri PDGFR-beta kabından daha önce gösterildiği gibi O4 kabına aktarın ve plakayı inkübe edin.
İnkübasyondan sonra, hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik bir konik tüpe aktarın ve 10 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj. Hücreleri istenen hacimde yeniden askıya alın ve hücre canlılığı için tripan mavisi ile 1: 1 oranında seyreltin. Bir hemositometre kullanarak, orta ila büyük hücreleri sayın.
Laminini çıkarın ve plakayı inkübe etmeden önce kurumasına izin vermeden hücreleri hemen istenen yoğunlukta plakalayın. Sabit, bütün ve immünopanlanmış DRG kültürleri, nöronlar için beta3-tübülin ve tüm çekirdekler için DAPI ile boyandı. Tüm DRG kültürlerinde yaklaşık %42.36 beta3-tübülin boyaması, immünopanlı DRG kültürlerinde ise yaklaşık %71.44 beta3-tübülin boyaması saptandı ve bu da immünopanning ile nöronal zenginleşmede anlamlı bir artış olduğunu ortaya koydu.
Dokunun özenle tedavi edilmesi çok önemlidir. DRG'leri nazikçe ele almak, fazla siniri kesmek ve doku ve kültürü ajite etmemeye veya kaybetmemeye özen göstermek, farkında olmak için çok önemlidir.
