Dieses Protokoll ermöglicht es uns, die Anzahl der Neuronen in adulten dorsalen Wurzelganglienkulturen der erwachsenen Maus zu erhöhen. Dies könnte helfen, den Beitrag neuronaler Zellen zu einer bestimmten Reaktion zu bestimmen. Wir haben einen Immunpanning-Schritt zu einem grundlegenden DRG-Kulturprotokoll hinzugefügt.
Der Hauptvorteil besteht darin, gegen nicht-neuronale Zellen zu selektieren. Wenn Sie mit primären DRG-Kulturen noch nicht vertraut sind, ist es am besten, Dissektionen zu üben, um so viele DRGs wie möglich zu erhalten und so viel wie möglich von den Nerven zu kürzen. Saugen Sie zunächst das Poly-D-Lysin an, das zum Beschichten der Kulturplatte verwendet wird, und waschen Sie die Platte dreimal mit Gewebekulturwasser.
Kippen Sie den Deckel auf und lassen Sie die Oberfläche vollständig trocknen. Tragen Sie so viel Laminin auf die Platte auf, dass der Boden jeder Vertiefung bedeckt ist, und legen Sie sie bei 37 Grad Celsius in einen Inkubator. Spülen Sie die zuvor vorbereiteten Pfannenschalen aus CD45, PDGFR-beta und O4 mit D-PBS.
Für die CD45-Schale fügen Sie 5 Milliliter 0,2%BSA und 20 Mikroliter CD45-Primärantikörper hinzu. Für die PDGFR-beta-Schale fügen Sie 15,2 Mikroliter PDGFR-beta zu den 5 Millilitern einer 0,2%igen BSA-haltigen Platte hinzu. Fügen Sie für die O4-Schale 2 Milliliter O4-Hybridom zu 3 Millilitern 0,2 % BSA und weitere 100 Mikroliter 4 % BSA hinzu, um sicherzustellen, dass die endgültige BSA-Konzentration bei 0,2 % bleibtAls nächstes durchbluten Sie die euthanasierte Maus mit 30 Millilitern eiskalter Kochsalzlösung.
Beobachten Sie die Farbveränderung der Leber, um die Durchblutung zu gewährleisten. Stecken Sie die Vorder- und Hinterpfoten auf eine Styroporstufe und verwenden Sie eine saubere Rasierklinge, um die Wirbelsäule von hinten freizulegen. Führen Sie eine Laminektomie durch, indem Sie auf beiden Seiten der dorsalen Wirbelsäule etwa halbtiefe Schnitte machen und die dorsale Hälfte der Wirbelsäule entfernen, um das Rückenmark freizulegen.
Durchtrennen Sie entweder vorsichtig die Nerven und entfernen Sie das Rückenmark oder schieben Sie das Rückenmark vorsichtig zur Seite, um die Integrität der Nerven zu erhalten. Verwenden Sie unter einem Präpariermikroskop die Spinalnervenwurzeln, um alle dorsalen Wurzelganglien (DRGs) auf beiden Seiten der Wirbelsäule zu finden und zu entfernen. Schneiden Sie die Nerventrümmer von jedem DRG ab, wenn es entfernt wird, da mehr Nerventrümmer in der Kultur zu einem schlechten Überleben führen können.
Sammeln Sie die DRGs in 15 Millilitern HBSS in einem konischen Röhrchen auf Eis und lassen Sie sie am Boden absetzen. Saugen Sie mit einer Pipette den größten Teil des HBSS aus den DRGs ab und lassen Sie etwa 100 Mikroliter Flüssigkeit im Röhrchen, um einen Verlust des Gewebes zu vermeiden. Dreimal mit 1 Milliliter HBSS waschen und 5 Milliliter der zuvor aufgetauten STEMxyme-Lösung in das Gewebe geben.
Decken Sie den Deckel mit einer transparenten Folie ab und lassen Sie das Röhrchen eine Stunde lang in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad auf der Seite schwimmen. Nach der Inkubation mit dem Enzym geben Sie 1 Milliliter low-ovomucoid inhibitorische Lösung in das Röhrchen. Verreiben Sie die Zellen vorsichtig mit einer P1000-Pipette 10 bis 15 Mal und lassen Sie die Gewebestücke absetzen.
Übertragen Sie dann die oberen 2 bis 3 Milliliter der Lösung, die dissoziierte Zellen enthält, in eine frische Lösung mit niedrigem Ovomucoid und wiederholen Sie den Vorgang, bis das Gewebe vollständig dissoziiert ist und keine sichtbaren Stücke mehr übrig sind. Zentrifugieren Sie das Röhrchen 10 Minuten lang bei 300 x g bei Raumtemperatur. Nachdem Sie den Überstand mit einer Pipette entfernt haben, wie bereits gezeigt, resuspendieren Sie das Zellpellet in 1 Milliliter Schwenkpuffer und pipettieren Sie vorsichtig, um es zu mischen.
Befeuchten Sie ein 70-Mikrometer-Zellsieb mit 1 Milliliter Schwenkpuffer über einem konischen 50-Milliliter-Rohr und filtrieren Sie dann die Zelllösung durch das Zellsieb. Waschen Sie das Röhrchen mit 1 Milliliter Schwenkpuffer und passieren Sie es durch das Sieb. Für die Zellschichtung fügen Sie 2 Milliliter 15%BSA hinzu und beschichten Sie vorsichtig die Seiten des geschlossenen Röhrchens.
Um die Myelinreste zu entfernen, schichten Sie die Zellsuspension vorsichtig Milliliter für Milliliter, indem Sie sie gegen die Seite des Röhrchens auf das BSA-Kissen pipettieren. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 300 x g für 10 Minuten bei Raumtemperatur mit langsamer Beschleunigung und Verzögerung. Die mittlere Myelinschicht zeigt Flocken aus weißem Material.
Entfernen Sie mit einer P1000-Pipette die klare Flüssigkeit darauf, die Myelinphase dazwischen und die BSA, jeweils einen Milliliter, wobei etwa 100 Mikroliter übrig bleiben, um das Pellet nicht zu stören. Für die Antigengewinnung fügen Sie 5 Milliliter Schwenkpuffer hinzu und inkubieren das Röhrchen 30 bis 45 Minuten lang in einem Inkubator bei 37 Grad Celsius und 10 % Kohlendioxid. Waschen Sie als Nächstes die inkubierte CD45-Schale dreimal mit D-PBS und gießen Sie die letzte Spülung ab.
Gießen Sie dann die Zellsuspension in die CD45-Schale. Inkubieren Sie die Schale 20 Minuten lang bei Raumtemperatur und schwenken Sie sie vorsichtig in 10-Minuten-Intervallen, damit die Zellen gleichberechtigten Zugang zum Antikörper erhalten. Schütteln Sie die CD45-Schale vorsichtig und stützen Sie sie schräg ab.
Pipettieren Sie vorsichtig 1 Milliliter der Zellsuspension über die Schale, um ungebundene Zellen zu sammeln. Anschließend in die PDGFR-beta-Schale, die zuvor dreimal mit D-PBS gewaschen wurde, überführen und inkubieren. Übertragen Sie die ungebundenen Zellen aus der PDGFR-beta-Schale in die O4-Schale, wie bereits gezeigt, und inkubieren Sie die Platte.
Nach der Inkubation wird die Zellsuspension in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen überführt und 10 Minuten lang bei 300 x g zentrifugiert. Resuspendieren Sie die Zellen im gewünschten Volumen und verdünnen Sie sie im Verhältnis 1:1 mit Trypanblau, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu gewährleisten. Zählen Sie mit einem Hämozytometer die mittleren bis großen Zellen.
Entfernen Sie das Laminin und beschichten Sie die Zellen sofort mit der gewünschten Dichte, ohne sie vor dem Inkubieren der Platte trocknen zu lassen. Die fixierten, ganzen und immunpanierten DRG-Kulturen wurden mit beta3-Tubulin für Neurone und DAPI für alle Kerne gefärbt. Es wurde festgestellt, dass ganze DRG-Kulturen eine Färbung von etwa 42,36 % Beta3-Tubulin aufwiesen, und in immunpanierten DRG-Kulturen wurde eine Färbung von etwa 71,44 % beta3-Tubulin festgestellt, was eine signifikante Zunahme der neuronalen Anreicherung durch Immunpanning zeigt.
Es ist sehr wichtig, das Gewebe mit Sorgfalt zu behandeln. Der schonende Umgang mit DRGs, das Trimmen überschüssiger Nerven und die Achtsamkeit, dass Gewebe und Kultur nicht bewegt werden oder verloren gehen, sind von entscheidender Bedeutung.
