Protokolümüz, yetişkin insan primer kardiyomiyositlerinde kontraktiliteyi ölçmek için güvenilir bir sistemi tanımlamaktadır. Sistemimiz, paralel olarak birden fazla hücreden kontraktiliteyi sürekli olarak ölçen ve ilaç etkilerinin gerçek zamanlı olarak izlenmesini sağlayan orta verimli, non-invaziv bir optik kayıt yöntemidir. Yöntemlerimiz, kalp yetmezliğinin düzeltilmesi için en çok istenen profile sahip yeni moleküllerin keşfini desteklemektedir.
Ayrıca, ilaca bağlı kasılma risklerini tahmin etmek için klinik öncesi bir yaklaşım sağlar. Başlamak için, sekiz oyuklu bir kültür plakasının her bir oyuğuna tek bir cam kapak fişi yerleştirin. 7.2 mililitre B çözeltisine 800 mikrolitre insan rekombinant laminin 521 stoğu ekleyerek mililitre laminin başına beş mikrogram hazırlayın ve iyice karıştırın.
Kapak kaymasının ortasına 200 mikrolitre seyreltilmiş laminin çözeltisi ekleyin. Plakayı örtün ve dört santigrat derecelik bir buzdolabına koyun. % 0.1'lik bir DMSO araç çözeltisi yapmak için dimetil sülfoksit veya DMSO 1000 kat C çözeltisi içinde seyreltin.
Bileşiği, 0.001 mikromolar terapötik maruziyetinin bir, 10, 100 ve 1000 katında test etmek için, bileşiği DMSO'da bir milimolar konsantrasyonda çözün. Üç stok daha üretmek için DMSO test bileşiği çözeltisini DMSO ile seri olarak seyreltin. Son olarak, nihai test konsantrasyonlarını elde etmek için her bir test bileşiği stoğunu 1000 yaşındaki 50 mililitre C çözeltisinde seyreltin.
Araç çözeltisini ve bileşiğin son mikromolar konsantrasyonlarının çözeltilerini 50 mililitrelik şırıngalara ekleyin. Şırıngaları yerçekimi akış sistemine bağlayın, ardından yerçekimi akış sistemini hazırlayın. Laminat kaplı bir kapak fişi içeren sekiz oyuklu bir plakayı buzdolabından çıkarın ve bir kapak fişini temiz bir kayıt odasına yerleştirin.
Plakayı bir sonraki kaplamaya kadar buzdolabına geri koyun. Hücreleri kaybetmeden en küçük hacme ulaşmak için yükseltilmiş flakondan çözelti B'yi aspire edin. Daha sonra 200 mikrolitre hücre solüsyonunu ters çevrilmiş bir mikroskop tablasına monte edilmiş kayıt mikroskobu odasına dağıtın ve hücrelerin beş dakika boyunca kapak kaymasına yerleşmesine izin verin.
Ardından, mikroskopta görüş alanını açın ve hücre yoğunluğunun deneysel çalışmanın başlaması için yeterli olup olmadığını belirleyin. Kaplama yapıldıktan sonra, yerçekimi akışı perfüzyon sistemini kullanarak hücreleri C çözeltisi ile sürekli olarak perfüze ederek beş dakika boyunca dengeleyin. Emişi doğru şekilde ayarlayın, sıcaklık kontrol kutusunu ve bir ısıtma plakasını açın ve 35 santigrat derece verecek şekilde ayarlayın.
Daha sonra, odanın zıt taraflarına yerleştirilmiş bir çift platin telli bir alan stimülatöründe, hücreleri bir hertz pacing frekansında eşik üstü voltajla uyarın. Uyarıcı nabzın genliğini bir volta ayarlayın ve kardiyomiyositler kasılma-gevşeme döngüleri oluşturmaya başlayana kadar artırın. Çubuk şeklinde morfolojiye ve net çizgilere sahip sağlıklı hücreleri seçin, ardından görüş alanını ayarlayın ve mümkün olduğunca çok sayıda kasılan hücreyi görünür hale getirmeye odaklanın.
Daha sonra, optik kasılma kayıt sisteminin toplama yazılımı içindeki hücrelerin sayısallaştırılmış görüntüleri görüntülendi. İlgilenilen bölgeyi veya ROI'leri seçerken, odak dışı alanlardan ve hücrelerin kenarına yakın alanlardan kaçının. Bileşiğin etkilerini değerlendirmek için deneyi başlatın.
Edinme yazılımı, veri toplamayı yönetecektir. Test konsantrasyonlarının ve işlem süresinin otomatik olarak görüntülenmesi ve etiketlenmesi. Kasılma, temel araç periyodunun tamamı boyunca sabit bir genlikte kalırsa test konsantrasyonları uygulayın.
Bir özet veya özet görüntüleyen hücreleri diskalifiye edin. Verilerin ortalamasını almak için analiz yazılımını ve özel yapım bir makroyu kullanarak çevrimdışı analiz gerçekleştirin. Yazılım, edinim yazılımı tarafından üretilen sarkomer dinamiği verilerinden çeşitli metrikleri hesaplar ve raporlar.
Her bir kardiyomiyositin spesifik temel araç kontrol koşuluna göre ortalama kasılma genliği üzerindeki test bileşiğinin etkilerini ölçün. Ortalama sonuçları ortalama artı/eksi SEM olarak ifade edin ve test bileşiğinin kasılma genliği üzerindeki konsantrasyon etkisini gösteren bir grafik oluşturun. Ardından, IC50 ve EC50 değerlerini türetmek için konsantrasyon tepki eğrisini tepe denklemine uydurun.
Daha sonra, art kasılmayı, bir sonraki düzenli kasılmadan önce meydana gelen ve anormal ve senkronize olmayan bir kasılma üreten kardiyomiyositin spontan ikincil kasılma geçici olarak tanımlayın. Büzülme başarısızlığını, elektriksel uyaranın bir kasılmayı indükleyememesi olarak tanımlayın. Kısa vadeli değişkenliği veya STV'yi ve kasılma genliği değişkenliğinin Poincare grafiklerindeki alternansları görselleştirin.
STV'yi her kontrol ve test ürünü konsantrasyon periyodunun son 20 geçici akımı ile hesaplayın. Daha sonra alternansları tekrarlayan, dönüşümlü kısa ve uzun kasılma genliği geçici akımları olarak tanımlayın. Pro-aritmi insidansını hesaplamak için, STV değerlerini her hücrenin araç kontrol değerine normalleştirin, kasılma sonrası, kasılma başarısızlığı, STV ve alternansları çizin ve bunları her bir sinyali sergileyen hücrelerin insidansının yüzdesi olarak ifade edin.
Zirveye kadar geçen süre, %30'a kadar bozunma, ardından %90'a gevşeme, %90'a kadar gevşeme süresi, temel sarkomer uzunluğu, %50 zirveye kadar geçen süre, tepe yüksekliği, en yüksek kasılmada sarkomer uzunluğu, maksimum kasılma hızı ve maksimum gevşeme hızı hesaplamasıyla çok parametrik mekanik profillemeyi tamamlayın. Daha sonra bu parametreleri her bir kardiyomiyositin spesifik temel kontrol koşuluna göre ifade edin ve bunları konsantrasyon yanıtı grafiklerinde grafiklendirin. Bu çalışma, insan kardiyomiyosit kontraktilite ölçümünün, doğrulamanın ve beta-adrenerjik stimülasyonun etkisini göstermektedir.
İnsan kardiyomiyositlerinde spontan kasılma geçişleri yoktu ve kardiyomiyositler, kasılma-gevşeme döngüleri ile dış elektriksel stimülasyona ve ayrıca bir beta-adrenerjik agonist olan izoproterenol'e yanıt verir. İzoproterenol, kontraktilitede konsantrasyona bağlı bir artış üretir ve geçici kontraktilite kinetiği üzerindeki etkileri de karakterize edilmiştir. Kontraktilitenin ölçümünü takiben, bir floresan indikatör ile kalsiyum geçici ölçümünü yapabiliriz.
Bu tür veriler, kasılmadaki değişikliğin kalsiyum dinamiğinde değişiklik gerektirip gerektirmediğini belirlemeye yardımcı olur. Yöntemimiz, kardiyak araştırmacıların insan kardiyomiyositlerinin fizyolojisi ve farmakolojisi hakkında daha iyi bir anlayış geliştirmeleri, yeni ilaçların yapısını, aktivitesini ve ilişkilerini kurmalarını ve etki mekanizmalarını keşfetmelerini sağlar.
