Наш протокол описывает надежную систему измерения сократительной способности в первичных кардиомиоцитах взрослого человека. Наша система представляет собой неинвазивный метод оптической записи со средней пропускной способностью, который непрерывно измеряет сократительную способность нескольких клеток параллельно и позволяет отслеживать эффекты лекарств в режиме реального времени. Наши методы способствуют открытию новых молекул с наиболее желательным профилем для коррекции сердечной недостаточности.
Он также обеспечивает доклинический подход для прогнозирования рисков сократимости, индуцированных лекарственными препаратами. Для начала поместите по одной стеклянной крышке в каждую лунку восьмилуночного планшета для культивирования. Приготовьте пять микрограммов на миллилитр ламинина, добавив 800 микролитров человеческого рекомбинантного ламинина 521 к 7,2 миллилитрам раствора В и хорошо перемешайте.
Добавьте 200 микролитров разбавленного раствора ламинина в центр покровного стекла. Накройте тарелку крышкой и поставьте в холодильник с температурой четыре градуса по Цельсию. Разбавьте диметилсульфоксид или ДМСО в 1000 раз в растворе С, чтобы получить 0,1%-ный раствор ДМСО.
Чтобы испытать соединение при одном, 10, 100 и 1000-кратном терапевтическом воздействии 0,001 микромоляра, растворите соединение в ДМСО в концентрации один миллимоляр. Последовательно разбавляйте раствор испытуемого соединения ДМСО ДМСО для получения еще трех бульонов. Наконец, разбавьте каждую испытуемую массу 1000 старых в 50 миллилитрах раствора С для получения окончательных тестовых концентраций.
Добавляют раствор средства и растворы конечных микромолярных концентраций соединения в шприцы объемом 50 миллилитров. Подсоедините шприцы к системе гравитационного потока, затем заправьте систему гравитационного потока. Извлеките из холодильника восьмилуночную пластину с ламинированным покрытием и поместите одну крышку в чистую камеру записи.
Верните тарелку в холодильник до следующей обшивки. Отсасывайте раствор Б из увеличенного флакона до достижения наименьшего объема без потери клеток. Затем дозируют 200 микролитров клеточного раствора в камеру регистрирующего микроскопа, установленную на столике инвертированного микроскопа, и дают клеткам осесть на защитном листе в течение пяти минут.
Затем откройте поле зрения микроскопа и определите, достаточна ли плотность клеток для начала эксперимента. После нанесения покрытия уравновешивайте клетки в течение пяти минут, непрерывно профилируя их раствором С с помощью системы перфузии гравитационного потока. Правильно отрегулируйте всасывание, включите блок контроля температуры и нагревательную пластину и установите их на 35 градусов по Цельсию.
Затем на стимуляторе поля с парой платиновых проводов, размещенных на противоположных сторонах камеры, стимулируют клетки надпороговым напряжением на частоте в один герц. Установите амплитуду стимулирующего импульса на один вольт и увеличивайте ее до тех пор, пока кардиомиоциты не начнут генерировать циклы сокращения-расслабления. Выберите здоровые клетки с палочковидной морфологией и четкими бороздками, затем отрегулируйте поле зрения и сосредоточьтесь на том, чтобы привлечь в поле зрения как можно больше сокращающихся клеток.
Далее отображаются оцифрованные изображения клеток в рамках программного обеспечения регистрации оптической сократимости. При выборе области интереса или ROI избегайте областей, находящихся вне фокуса, и областей, близких к краю ячеек. Начните эксперимент, чтобы оценить эффекты соединения.
Программное обеспечение для сбора данных будет управлять сбором данных. Автоматическое отображение и маркировка концентраций теста и времени обработки. Применяют тестовые концентрации, если сокращение остается на стабильной амплитуде в течение всего базового периода транспортного средства.
Дисквалифицировать ячейки, отображающие разгон или рандаун. Выполняйте автономный анализ с помощью аналитического программного обеспечения и специально созданного макроса для усреднения данных. Программное обеспечение рассчитывает и сообщает различные показатели на основе данных динамики саркомеров, полученных с помощью программного обеспечения для сбора данных.
Количественно оценить влияние исследуемого соединения на среднюю амплитуду сократимости по отношению к конкретному исходному состоянию контроля носителей каждого кардиомиоцита. Выразите средние результаты в виде среднего значения плюс/минус СЭМ и постройте график, показывающий влияние концентрации испытуемого соединения на амплитуду сократимости. Затем подгоните кривую отклика концентрации к уравнению холма, чтобы получить значения IC50 и EC50.
Затем определите послесокращение как спонтанное вторичное переходное сокращение кардиомиоцита, которое происходит перед следующим регулярным сокращением и вызывает аномальное и несинхронизированное сокращение. Определите сбой схватки как неспособность электрического раздражителя вызвать сокращение. Визуализируйте краткосрочную изменчивость, или STV, и альтернаны на графиках Пуанкаре изменчивости амплитуды сокращения.
Рассчитайте STV с учетом последних 20 переходных процессов каждого периода концентрации контрольного и испытуемого изделий. Затем определяют чередования как повторяющиеся, чередующиеся короткие и длинные переходные процессы амплитуды сократимости. Чтобы рассчитать частоту случаев проаритмии, нормализуйте значения STV к контрольному значению носителя каждой клетки, постройте график послесокращения, сбоя сокращения, STV и альтернанов и выразите их в процентах от частоты встречаемости клеток, проявляющих каждый из сигналов.
Завершите многопараметрическое механистическое профилирование расчетом времени до пика, затухания до 30%, затем 90% релаксации, времени до 90% релаксации, базовой длины саркомера, времени до 50% пика, высоты пика, длины саркомера при пиковой сократимости, максимальной скорости сжатия и максимальной скорости релаксации. Затем выразите эти параметры относительно конкретного исходного контрольного состояния каждого кардиомиоцита и отобразите их на графиках концентрационного ответа. В этом исследовании показана валидация измерения сократимости кардиомиоцитов человека, а также эффект бета-адренергической стимуляции.
Спонтанных переходных процессов сократимости в кардиомиоцитах человека не выявлено, а на внешнюю электрическую стимуляцию кардиомиоциты реагируют циклами сократимости-релаксации, а также на изопротеренол – бета-адренергический агонист. Изопротеренол вызывает увеличение сократимости в зависимости от концентрации, а также охарактеризовано его влияние на кинетику переходной сократимости. После измерения сократимости мы можем провести измерение переходного процесса кальция с помощью флуоресцентного индикатора.
Такие данные помогают определить, требует ли изменение сократительной способности в динамике кальция. Наш метод прокладывает путь для исследователей-кардиологов к лучшему пониманию физиологии и фармакологии кардиомиоцитов человека, установлению структуры, активности и взаимоотношений новых лекарств, а также изучению механизма их действия.
