Yazarlar, José Luis Ramos-Balderas'a teknik desteği için teşekkür etmek istiyor. Bu çalışma, CONACYT'den (fordecyt-pronace-303027) PLL'ye aşağıdaki hibe ile desteklenmiştir. OM-P ve EO-M, CONACIST'ten (sırasıyla 736162 ve 481437) bir burs aldı. MCM-M, CONACIST'ten burs aldı (Estancias Posdoctorales por México 2022 (3)).

Burada açıklanan tüm hayvan deneyleri, Meksika Ulusal Özerk Üniversitesi, Hücresel Fizyoloji Enstitüsü'nün Hayvan Kullanımı İç Komitesi (CICUAL) tarafından onaylanmıştır.
NOT: Tüm protokolün akış şeması Şekil 1'de gösterilmiştir.
1. Farelerin muhafazası
<ol><li>12 saatlik aydınlık / karanlık döngülerde sabit sıcaklık ve neme sahip hayvan tesislerinde barındırılan, suya ve yiyeceğe libitum erişimi olan 8-10 haftalık, dişi veya erkek fare gruplarını kullanın. NOT: Bu protokol, daha önce açıklandığı gibi C57BL/6 arka planında IL-9 muhabir fare suşu kullanır4; Bununla birlikte, diğer IL-9 muhabir suşları 6,7,8 ve hücre içi IL-9 boyama ile değişken sonuçlar 9 kullanılabilir.</li>
</ol>2. Farelerin enfeksiyonu
<ol><li>Farelerin arkasını vücudun ortasından enfeksiyondan 1 gün önce kuyruğun tabanına yakın bir yere tıraş edin. Anestezik kullanımı gerekli değildir.</li>
	<li>Subkutan olarak her fareyi, daha önce tarif edildiği gibi, alt sırtta 100 μL fosfat tamponlu salin (PBS)10'da 200 canlı üçüncü aşama N. brasiliensis larvası (L3) ile aşılayın veya kontrol olarak tek başına 100 μL PBS enjekte edin. Hayvanları enfeksiyon sonrası 4. gün, 7. gün veya 10. günde kurban edin.</li>
</ol>3. Akciğer, ince bağırsak, mediastinal ve mezenterik lenf nodlarının izolasyonu
<ol><li>Servikal çıkık ile fareyi ötenazileştirin. Fareyi sırtına yerleştirin ve% 70 etanol püskürtün. Makas kullanarak orta hat kesisi yapın ve karın ve torasik bölgeleri ortaya çıkarmak için cildi açın. NOT: İzofluran alternatif ötanazi yöntemi12 olarak kullanılabilir. CO2 akciğer dokusu hasarına ve kanamaya yol açtığı için karbondioksit odaları önerilmez13.</li>
	<li>Mediastinal lenf nodlarının ve akciğerlerin izolasyonu<ol><li>Sternumda bir kesi yapın ve kaburgaları ve torasik kasları çıkarmak için "V" şeklinde kesin. Torasik kavite açığa çıktıktan sonra, mediastinal lenf düğümlerini yemek borusunun yanında, kalbin altında bulun (bakınız Ek Şekil 1).</li>
		<li>Mediastinal lenf nodlarını çıkarın ve bunları 12 kuyucuklu bir kültür plakasında 1 mL R-10 ortamında (Tablo 1) toplayın. İşlenene kadar ışıktan korunarak buz üzerinde tutun. NOT: Bu deneylerde kullanılan muhabir farelerden gelen floresan sinyalinin azalmasını önlemek için numuneler ışıktan korunmalıdır.</li>
		<li>Akciğerleri çıkarın ve fare başına 12 kuyucuklu bir kültür plakasında 1 mL R-10 ortamında toplayın. İşlenene kadar ışıktan korunarak buz üzerinde tutun.</li>
	</ol></li>
	<li>Mezenterik lenf nodu zincirlerinin ve ince bağırsakların izolasyonu<ol><li>Peritoneal boşluğu açığa çıkarın ve kolon boyunca mezenterik lenf nodu (MLN) zincirini açığa çıkarmak için ince bağırsağı dikkatlice sağa hareket ettirin.</li>
		<li>Forseps kullanarak, MLN'yi çıkarın, bir kağıt havlu üzerinde yavaşça yuvarlayın ve yağı çekin.</li>
		<li>MLN'yi 12 kuyucuklu bir kültür plakasında 1 mL R-10 ortamına aktarın. İşlenene kadar ışıktan korunarak buz üzerinde tutun.</li>
		<li>İnce bağırsağı pilor sfinkterin hemen altında ve çekumun üstünde kesin. Forseps yardımıyla bağırsağı yavaşça dışarı çekin, bağlı mezenter ve yağ dokusunu çıkarın.</li>
		<li>İnce bağırsağı bir kağıt havluya yerleştirin ve PBS ile cömertçe nemlendirin. Peyer'in yamalarını ince bağırsaktan makasla çıkarın. NOT: Canlılığı korumak için, kalan yağ dokusunu çıkarın ve tüm işlem boyunca PBS ile ince bağırsağı nemli tutun.</li>
		<li>İnce bağırsağı makas kullanarak uzunlamasına kesin ve dışkı içeriğini ve mukusları çıkarmak için forsepsleri açık bağırsak üzerinde yavaşça kaydırın.</li>
		<li>İnce bağırsağı forsepslerle tutun ve birkaç kez dikkatlice batırarak buz üzerinde 5 mL PBS içinde yıkayın. İki kez tekrarlayın.</li>
		<li>İnce bağırsağı kısa parçalara ayırın (yaklaşık 5 mm) ve% 2 FBS ile 10 mL HBSS14 içeren 50 mL'lik bir konik tüp içinde toplayın (Tablo 1). Hemen intraepitelyal ve lamina propria hücrelerini izole etmeye devam edin.</li>
	</ol></li>
</ol>4. İnce bağırsak, akciğer ve lenf düğümlerinden tek hücreli süspansiyonların hazırlanması
NOT: İnce bağırsaklardan tek hücreli süspansiyonlar hazırlarken kişi başına maksimum altı farenin işlenmesi son derece önemlidir, çünkü hücre canlılığı daha uzun işlem süreleriyle önemli ölçüde azalır. Bu yöntem Heligmosomoides polygyrus enfeksiyon faresi model5'ten uyarlanmıştır.
<ol><li>Sallanan inkübatör, R-20 ortam, HBSS ve HBSS-2 mM EDTA'yı (Tablo 1) 37 ° C'de önceden ısıtın.</li>
	<li>Örnek başına 10 mL ince bağırsak sindirim ortamı (Tablo 1) hazırlayın.</li>
	<li>Bağırsak parçalarını 3.3.8 adımından elle kuvvetlice sallayın.</li>
	<li>Her numuneyi bir cam huni üzerinde naylon bir ağdan (yaklaşık 10 cm x 10 cm) süzün. Numuneyi, ağın üzerine 10 mL önceden ısıtılmış HBSS ekleyerek yıkayın ve akışı atın. Bir kez daha tekrarlayın. NOT: Her numune için yeni bir ağ kullanın ve prosedür boyunca yeniden kullanın.</li>
	<li>Ağı huniden çıkarın ve numuneyi ağdan 10 mL sıcak HBSS-2 mM EDTA (adım 4.1) ile 50 mL konik bir tüp içinde toplayın. 37 ° C'de 10 dakika boyunca inkübe edin, 200 rpm'de sallayın.</li>
	<li>Maksimum hızda (3.200 rpm) 10 s vorteks yapın ve numuneyi bir cam huni üzerinde ağ ile filtreleyerek akışı 50 mL konik bir tüpte geri kazanın.</li>
	<li>4,5 ve 4,6 numaralı adımları iki kez tekrarlayın ve aynı 50 mL konik tüpteki akışı geri kazanın. İntraepitelyal hücreler bu 30 mL fraksiyonda bulunur. Kalan dokuyu kaydedin.</li>
	<li>İntraepitel hücrelerinden tek hücreli süspansiyon hazırlığı<ol><li>4.7. adımda geri kazanılan 30 mL'lik hücre süspansiyonunu, oda sıcaklığında (RT) 5 dakika boyunca 450 x g'de santrifüj yapın. Süper natantı atın.</li>
		<li>RT'de 5 dakika boyunca 5 mL PBS ekleyin ve 450 x g'de santrifüj yapın.</li>
		<li>Hücre peletini 3 mL RPMI% 10 FBS-20 μg / mL DNaz içinde yeniden askıya alın (Tablo 1). Hücre lekelenene kadar ışıktan korunarak buz üzerinde tutun.</li>
	</ol></li>
	<li>Lamina propria hücrelerinden tek hücreli süspansiyon hazırlığı<ol><li>Kalan ince bağırsak dokusunu, huni üzerindeki ağdan 10 mL'nin üzerine ılık HBSS dökerek adım 4.7'den yıkayın. Yıkamayı tekrarlayın. Dokuyu ağdan 10 mL ince bağırsak sindirim ortamı ile 50 mL'lik bir konik tüp içinde toplayın.</li>
		<li>37 ° C'de 30 dakika boyunca inkübe edin, 200 rpm'de sallayın. Her 5 dakikada bir 10 s maksimum hızda vorteks.</li>
		<li>Sindirim reaksiyonunu durdurmak için 10 mL FACS-EDTA tamponu ekleyin (Tablo 1) ve buzun üzerine yerleştirin.</li>
		<li>Her numuneyi serolojik bir pipet kullanarak 100 μm'lik bir hücre süzgecinden süzün ve süspansiyonu buz üzerine yerleştirilmiş 50 mL'lik konik bir tüpte geri kazanın.</li>
		<li>4 °C'de 6 dakika boyunca 600 x g'de santrifüj.</li>
		<li>Süper natantı atın. Hücre peletini 5 mL PBS ile yıkayın ve 4 ° C'de 6 dakika boyunca 600 x g'de santrifüj yapın.</li>
		<li>Süper natantı atın ve hücre peletini 1 mL RPMI% 10 FBS-20 μg / mL DNaz içinde yeniden askıya alın. Hücre lekelenene kadar ışıktan korunarak buz üzerinde tutun.</li>
	</ol></li>
	<li>Akciğerden tek hücreli süspansiyon hazırlığı NOT: Her akciğer ve ince bağırsak, uzun kullanım sürelerinden kaçınmak için iki kişi tarafından paralel olarak işlenmelidir, bu da düşük hücre canlılığına neden olur.<ol><li>İşlenen numune başına 4 mL akciğer sindirim ortamı (Tablo 1) hazırlayın.</li>
		<li>RPMI ortamını akciğerleri içeren kuyudan adım 3.2.3'ten çıkarın. Akciğeri ince makasla küçük parçalara ayırın.</li>
		<li>Akciğer parçalarını spatula ile 15 mL'lik bir konik tüpe aktarın. 4 mL akciğer sindirim ortamı ekleyin (Tablo 1).</li>
		<li>37 ° C'de 30 dakika boyunca inkübe edin, 250 rpm'de sallayın. İşiniz bittiğinde, her numune işlenene kadar buz üzerinde tutun.</li>
		<li>Her numuneyi, 6 delikli bir kültür plakasının tek bir kuyucuğuna yerleştirilmiş 100 μm'lik bir hücre süzgecinden süzün. Dokuyu bir şırınga pistonu ile ayırın.</li>
		<li>Her numuneyi 15 mL'lik bir konik tüpte geri kazanın ve 4 mL R-2 ortamı ekleyin (Tablo 1). Diğer numuneler işlenirken buz üzerinde tutun.</li>
		<li>4 °C'de 5 dakika boyunca 600 x g'de santrifüj. Süpernatantı atın ve hücre peletini 1 mL R-5 ortamında yeniden askıya alın (Tablo 1).</li>
		<li>Santrifüj yaparken, hematopoetik hücre fraksiyonu 15,16'yı zenginleştirmek için numune başına 4 mL% 27.5 yoğunluk-gradyan çözeltisi (Tablo 1) hazırlayın. Tek hücreli ayırma stratejisi, diğer benzer yoğunluk gradyan ortamlarına kıyasla daha verimli, uygun maliyetli ve daha az toksiktir17.</li>
		<li>Adım 4.10.7'den itibaren 1 mL'lik hücre süspansiyonuna 4 mL% 27.5 yoğunluk gradyanı çözeltisi ekleyin ve kuvvetlice çalkalayın.</li>
		<li>İki faz oluşturmak için karışık süspansiyonun üzerine yavaşça 1 mL R-5 ortamı (Tablo 1) ekleyin.</li>
		<li>RT'de 20 dakika boyunca 1.500 x g'de santrifüj, düşük hızlanma ve fren kapalı. İki faz arasında oluşan halkayı gözlemleyin.</li>
		<li>İki faz arasında oluşan halkayı 1 mL mikropipet ile geri kazanın ve 4 mL R-2 ortamında yeniden askıya alın.</li>
		<li>4 °C'de 5 dakika boyunca 450 x g'de santrifüj. Süper natantı atın. Hücre peletini 1 mL ACK tamponunda (Tablo 1) yeniden askıya alın ve RT'de 1 dakika inkübe edin.</li>
		<li>4 mL R-5 orta ve 4 °C'de 5 dakika boyunca 450 x g'de santrifüj yapın. Süpernatantı atın ve hücre peletini 1 mL R-10 ortamında yeniden askıya alın. Buz üzerinde tutun, akış sitometrisi için lekelenene kadar ışıktan koruyun.</li>
	</ol></li>
	<li>Lenf düğümlerinden tek hücreli süspansiyon preparatı<ol><li>Lenf düğümlerini 3.2.2 veya 3.3.3 adımlarından iki ağ parçası arasına 6 delikli bir kültür plakasından bir kuyucuk içine yerleştirin ve bir şırınga pistonu ile ayrışın.</li>
		<li>Hücre süspansiyonunu 1,5 mL'lik bir konik tüpte geri kazanın ve 4 ° C'de 5 dakika boyunca 450 x g'de santrifüj yapın.</li>
		<li>Süper natantı atın ve hücre peletini 1 mL R-10 ortamında yeniden askıya alın. Buz üzerinde tutun, akış sitometrisi için lekelenene kadar ışıktan koruyun. NOT: Kümeler görülebiliyorsa, numuneyi 100 μm'lik bir hücre süzgecinden süzün.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Akım sitometrisi için hücre boyama (Şekil 2 ve Şekil 3)
NOT: Lenf nodu hücre süspansiyonlarını 4 °C'de 5 dakika boyunca 450 x g'de 4.11.3 adımından santrifüj edin ve hücre peletini 500 μL FACS tamponunda yeniden askıya alın (Tablo 1).
<ol><li>ILC2'lerin tanımlanması için hücre boyama (Şekil 3 ve Ek Şekil 2) NOT: Bu boyama prosedürü, IL-9 eksprese eden ILC2 hücrelerinin tanımlanması için spesifiktir.<ol><li>Adım 4.10.14'ten akciğer örneği başına plaka 150 μL (yaklaşık 1.8 x 10 6 hücre) ve 4.11.3 adımından itibaren lenf nodu örneği başına 50 μL (sırasıyla mediastinalve mezenterik lenf nodu örnekleri için yaklaşık 0.7 x 10 6 ve 2.2 x 106 hücre) 96 kuyucuklu konik alt kültür plakasında. 100 μL FACS tamponu ekleyin ve 4 °C'de 5 dakika boyunca 450 x g'de santrifüj yapın.</li>
		<li>İnce bağırsak numunesi başına plaka 100 μL (intraepitelyal ve lamina propria örnekleri için sırasıyla yaklaşık 2.7 x 10 6 ve 0.6 x 10 6 hücre)96 kuyucuklu bir konik alt kültür plakasında 4.8.3ve 4.9.7 adımlarından. 150 μL FACS tamponu ekleyin ve 4 °C'de 5 dakika boyunca 450 x g'de santrifüj yapın.</li>
		<li>Süpernatanı atın ve her hücre peletini FACS tamponunda seyreltilmiş biyotinile antikor kokteylinin 50 μL'sinde (Tablo 2) yeniden askıya alın. Işıktan korunan 4 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin. NOT: İntraepitelyal ve lamina propria numuneleri için 20 μg/mL DNaz içeren FACS tamponu kullanın.</li>
		<li>150 μL FACS tamponu ekleyin. 4 °C'de 5 dakika boyunca 450 x g'de santrifüj.</li>
		<li>Süper natantı atın ve hücre peletini 200 μL FACS tamponunda yeniden askıya alın. Tekrar santrifüj yapın ve süpernatarı atın.</li>
		<li>Hücre peletini antikor/leke kokteylinin 50 μL'sinde yeniden askıya alın (Tablo 2) ve ışıktan korunan 4 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin.</li>
		<li>150 μL FACS tamponu ekleyin. 4 °C'de 5 dakika boyunca 450 x g'de santrifüj.</li>
		<li>Süper natantı atın ve hücre peletini 200 μL FACS tamponunda yeniden askıya alın. Tekrar santrifüj yapın ve süpernatarı atın. Yıkamayı tekrarlayın (adım 5.1.7) ve süpernatanı atın.</li>
		<li>Hücre peletini 300 μL FACS tamponunda yeniden askıya alın ve akış sitometrisi ile analiz edin.</li>
		<li>İnce bağırsak ve akciğer örnekleri için geçit stratejisini kullanın: lenfositler, tek hücreler, canlı hücreler, hematopoetik hücreler, CD90 + Soy hücreleri, ST2 + hücreleri ve IL-9 + hücreleri (Şekil 3A, B ve Ek Şekil 2A). Lenf nodu örnekleri için geçit stratejisini kullanın: canlı hücreler, tek hücreler, CD90 + Soy hücreleri, ST2 + hücreleri ve IL-9 + hücreleri (Ek Şekil 2B, C).</li>
	</ol></li>
	<li>IL-9 üreten lenfositlerin tanımlanması için hücre boyama (Şekil 2 ve Ek Şekil 3)<ol><li>Akciğer örneği başına 800 μL'yi adım 4.10.14'ten 1.5 mL'lik bir tüpe (yaklaşık 14.6 x 106 hücre) aktarın. 4 °C'de 5 dakika boyunca 450 x g'de santrifüj. Süper natantı atın.</li>
		<li>Lenf nodu örnekleri için, 4.11.3 adımından itibaren hücre süspansiyonunun 400 μL'lik plakası (mediastinal ve mezenterik lenf nodu örnekleri için sırasıyla yaklaşık 5.6 x 10 6ve 17.5 x 106 hücre) iki adımda 96 kuyucuklu konik bir alt plakada.<ol><li>Önce 200 μL aktarın, 4 ° C'de 5 dakika boyunca 450 x g'de santrifüj yapın ve süpernatanı atın.</li>
			<li>İlgili kuyuya 200 μL daha aktarın. 4 °C'de 5 dakika boyunca 450 x g'de santrifüj yapın ve süpernatanı atın.</li>
		</ol></li>
		<li>Hücre peletini antikor/leke kokteylinin 50-400 μL'sinde yeniden askıya alın (Tablo 3) ve ışıktan korunan 4 °C'de 30 dakika inkübe edin. NOT: Akciğer örnekleri 400 μL'de, mediastinal lenf nodu örnekleri 50 μL'de ve mezenterik lenf nodu örnekleri boyama kokteylinin 100 μL'sinde yeniden askıya alınmalıdır.</li>
		<li>Mediastinal lenf nodu örneklerine 150 μL FACS tamponu ve mezenterik lenf nodu örneklerine 100 μL ekleyin. 4 °C'de 5 dakika boyunca 450 x g'de santrifüj yapın ve süpernatanı atın.</li>
		<li>Akciğer ve lenf nodu örneklerini, peletleri sırasıyla 1 mL ve 200 μL FACS tamponunda yeniden askıya alarak yıkayın. 4 °C'de 5dakika boyunca 450 x g'de santrifüj. Supernatant'ı atın ve yıkamayı tekrarlayın.</li>
		<li>Akciğer örneklerini 600 μL FACS tamponunda yeniden askıya alın ve bunları akış sitometrisi ile analiz edin. Geçit stratejisini kullanın: lenfositler, tek hücreler, canlı hücreler, hematopoetik hücreler, CD4 + TCRβ + hücreleri ve IL-9 + hücreleri (Şekil 2A).</li>
		<li>Lenf nodu örneklerini 300 μL FACS tamponunda yeniden askıya alın ve akış sitometrisi ile analiz edin. Geçit stratejisini kullanın: lenfositler, tek hücreler, canlı hücreler, CD4 + TCRβ + hücreleri ve IL-9 + hücreleri (Şekil 2B ve Ek Şekil 3A).</li>
	</ol></li>
</ol>6. Tek hücreli süspansiyonlarda mutlak hücre sayısının belirlenmesi
<ol><li>4.8.3, 4.9.7, 4.10.14 ve 4.11.3 numaralı izolasyon adımlarından alınan numuneleri PBS ile 1:20 oranında (10 μL numune + 190 μL PBS) seyreltin.</li>
	<li>Adım 6.1'den itibaren seyreltilmiş her numunenin 10 μL'sini 10 μL Tripan Mavisi ile karıştırın. Bir hemositometreye 10 μL yükleyin ve her seyreltmeyi göz önünde bulundurarak canlı hücreleri sayın.</li>
	<li>Akış sitometrisi (canlılık boyası negatif hücreleri) ile belirlenen canlı hücrelerden gelen ilgili popülasyonun yüzdesini, izolasyondan sonra tek hücreli süspansiyondaki toplam canlı hücre sayısıyla çarparak ve bu sayıyı 100'e bölerek mutlak hücre sayılarını elde edin (Ek Şekil 4, Ek Şekil 5 ve Ek Şekil 6). Mutlak sayı = (Akış sitometrisi ile belirlenen canlı hücrelerden gelen ilgi popülasyonunun yüzdesi x Tek hücreli süspansiyondaki toplam canlı hücre sayısı)/100</li>
</ol>

<ol>
	<li>Centers for Disease Control and Prevention. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Parasites - Hookworm. , (2022).</li><li>Camberis, M., Le Gros, G., Urban, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+model+of+Nippostrongylus+brasiliensis+and+Heligmosomoides+polygyrus.">Animal model of Nippostrongylus brasiliensis and Heligmosomoides polygyrus.</a> Current Protocols in Immunology. , (2003).</li><li>Mearns, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-4-promoted+T+helper+2+responses+enhance+Nippostrongylus+brasiliensis-induced+pulmonary+pathology.">Interleukin-4-promoted T helper 2 responses enhance Nippostrongylus brasiliensis-induced pulmonary pathology.</a> Infection and Immunity. 76 (12), 5535-5542 (2008).</li><li>Licona-Limon, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Th9+cells+drive+host+immunity+against+gastrointestinal+worm+infection.">Th9 cells drive host immunity against gastrointestinal worm infection.</a> Immunity. 39 (4), 744-757 (2013).</li><li>Ferrer-Font, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-dimensional+analysis+of+intestinal+immune+cells+during+helminth+infection.">High-dimensional analysis of intestinal immune cells during helminth infection.</a> Elife. 9, 51678 (2020).</li><li>Kharwadkar, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+efficiency+of+multiple+IL9+reporter+alleles+Is+determined+by+cell+lineage.">Expression efficiency of multiple IL9 reporter alleles Is determined by cell lineage.</a> Immunohorizons. 4 (5), 282-291 (2020).</li><li>Wilhelm, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+IL-9+fate+reporter+demonstrates+the+induction+of+an+innate+IL-9+response+in+lung+inflammation.">An IL-9 fate reporter demonstrates the induction of an innate IL-9 response in lung inflammation.</a> Nature Immunology. 12 (11), 1071-1077 (2011).</li><li>Gerlach, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TH9+cells+that+express+the+transcription+factor+PU.1+drive+T+cell-mediated+colitis+via+IL-9+receptor+signaling+in+intestinal+epithelial+cells.">TH9 cells that express the transcription factor PU.1 drive T cell-mediated colitis via IL-9 receptor signaling in intestinal epithelial cells.</a> Nature Immunology. 15 (7), 676-686 (2014).</li><li>Olson, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paracrine+IL-2+is+required+for+optimal+type+2+effector+cytokine+production.">Paracrine IL-2 is required for optimal type 2 effector cytokine production.</a> Journal of Immunology. 198 (11), 4352-4359 (2017).</li><li>Cold Spring Harbor Protocols. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphate-buffered+saline+(PBS).">Phosphate-buffered saline (PBS).</a> Cold Spring Harbor Protocols. , (2006).</li><li>Pinto, M. E. S., Licona-Limon, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Th9+cells+and+parasitic+inflammation:+Use+of+Nippostrongylus+and+Schistosoma+models.">Th9 cells and parasitic inflammation: Use of Nippostrongylus and Schistosoma models.</a> Methods in Molecular Biology. 1585, 223-245 (2017).</li><li>Lawrance, C. C., Lucas, E. A., Clarke, S. L., Smith, B. J., Kuvibidila, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+isoflurane+and+CO2+inhalation+on+plasma+levels+of+inflammatory+markers+associated+with+collagen-induced+arthritis+in+DBA+mice.">Differential effects of isoflurane and CO2 inhalation on plasma levels of inflammatory markers associated with collagen-induced arthritis in DBA mice.</a> International Immunopharmacology. 9 (7-8), 807-809 (2009).</li><li>Boivin, G. P., Bottomley, M. A., Schiml, P. A., Goss, L., Grobe, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiologic,+behavioral,+and+histologic+responses+to+various+euthanasia+methods+in+C57BL/6Ntac+male+mice.">Physiologic, behavioral, and histologic responses to various euthanasia methods in C57BL/6Ntac male mice.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 56 (1), 69-78 (2017).</li><li>old Spring Harbor Protocols. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hank's+balanced+salt+solution+(HBSS)+without+phenol+red.">Hank's balanced salt solution (HBSS) without phenol red.</a> Cold Spring Harbor Protocols. , (2006).</li><li>Bielecki, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin-resident+innate+lymphoid+cells+converge+on+a+pathogenic+effector+state.">Skin-resident innate lymphoid cells converge on a pathogenic effector state.</a> Nature. 592 (7852), 128-132 (2021).</li><li>Sanjabi, S., Mosaheb, M. M., Flavell, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opposing+effects+of+TGF-beta+and+IL-15+cytokines+control+the+number+of+short-lived+effector+CD8++T+cells.">Opposing effects of TGF-beta and IL-15 cytokines control the number of short-lived effector CD8+ T cells.</a> Immunity. 31 (1), 131-144 (2009).</li><li>Liu, H., Li, M., Wang, Y., Piper, J., Jiang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+single-cell+encapsulation+efficiency+and+reliability+through+neutral+buoyancy+of+suspension.">Improving single-cell encapsulation efficiency and reliability through neutral buoyancy of suspension.</a> Micromachines. 11 (1), 94 (2020).</li><li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-25-responsive,+lineage-negative+KLRG1(hi)+cells+are+multipotential+'inflammatory'+type+2+innate+lymphoid+cells.">IL-25-responsive, lineage-negative KLRG1(hi) cells are multipotential 'inflammatory' type 2 innate lymphoid cells.</a> Nature Immunology. 16 (2), 161-169 (2015).</li><li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S1P-dependent+interorgan+trafficking+of+group+2+innate+lymphoid+cells+supports+host+defense.">S1P-dependent interorgan trafficking of group 2 innate lymphoid cells supports host defense.</a> Science. 359 (6371), 114-119 (2018).</li><li>Flamar, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-33+induces+the+enzyme+Tryptophan+hydroxylase+1+to+promote+inflammatory+group+2+innate+lymphoid+cell-mediated+immunity.">Interleukin-33 induces the enzyme Tryptophan hydroxylase 1 to promote inflammatory group 2 innate lymphoid cell-mediated immunity.</a> Immunity. 52 (4), 606-619 (2020).</li><li>Olgu&#237;n-Mart&#237;nez, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-33+and+the+PKA+pathway+regulate+ILC2+populations+expressing+IL-9+and+ST2.">IL-33 and the PKA pathway regulate ILC2 populations expressing IL-9 and ST2.</a> Frontiers in Immunology. 13, 787713 (2022).</li><li>Olguin-Martinez, E., Ruiz-Medina, B. E., Licona-Limon, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+molecular+markers+and+heterogeneity+in+type+2+innate+lymphoid+cells.">Tissue-specific molecular markers and heterogeneity in type 2 innate lymphoid cells.</a> Frontiers in Immunology. 12, 757967 (2021).</li><li>Noelle, R. J., Nowark, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+sources+and+immune+functions+of+interleukin-9.">Cellular sources and immune functions of interleukin-9.</a> Nature Reviews. Immunology. 10 (10), 683-687 (2010).</li></ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

İntestinal parazit-konakçı etkileşimlerinin ve helmint enfeksiyonuna karşı immün yanıtların tam olarak anlaşılması, doku yeniden şekillenmesi ve solucan kovulmasının indüksiyonu için anahtar olan farklı hücre popülasyonlarının ve efektör moleküllerinin tanımlanmasını ve analiz edilmesini gerektirir. Topraktan bulaşan helmint enfeksiyonları, dünyadaki gelişmekte olan ülkelerde büyük bir sorun teşkil etmektedir. Bununla birlikte, yakın zamana kadar, bu enfeksiyondan etkilenen ana organ olan ince bağırsakta bulunan nadir hücre popülasyonlarının analizine izin veren bir protokol mevcut değildi5. Bu protokol, N. brasiliensis enfeksiyonu sırasında akciğer, mediastinal ve mezenterik lenf nodlarındaki IL-9 eksprese eden lenfoid hücrelerin akış sitometrik analizine izin veren daha önce tanımlanmış yöntemleri kapsar ve bu popülasyonun ince bağırsakta ilk kez tanımlanmasının ek avantajı vardır.
Bu protokolün başarısı büyük ölçüde doku işleme sürelerine bağlıdır. Kişi başına aynı anda en fazla altı ince bağırsak örneğinin işlenmesi zorunludur. Farklı organlar işlenecekse, başka bir kişi tarafından paralel olarak yapılmasını öneririz. Nispeten düşük bir parazit yükü (200 L3 larva) kullanarak, bu protokol, lenfoid hücrelerin N. brasiliensis ile enfekte olmuş bağırsaktan izole edilmesine izin verirken, bu hücreleri diğer organlardan izole etme yeteneğini korur. Daha yüksek parazit yüklerinin kullanılması, ince bağırsaktan izole edilen hücrelerin kalitesini ve miktarını tehlikeye atar (veriler gösterilmemiştir); Bununla birlikte, diğer organlarda IL-9 eksprese eden lenfoid hücrelerin önemli bir artışına neden olabilir4. Bağırsak ve mezenterik lenf düğümlerini işlerken, yapışmış yağ dokusunun çıkarılması kritik öneme sahiptir, çünkü bunun yapılmaması hücre ölümünün artmasına neden olur. Veriler, enfeksiyonun doğal seyrinin ince bağırsaktan kurtarılan lenfoid hücrelerin mutlak sayısını olumsuz yönde etkilediği gözlemini desteklemektedir. Burada açıklanan çalışmalarda, IL-9 + ILC2 hücrelerinin frekansları tutarlı kalırken, mutlak sayılar her bağımsız deneyde yüksek değişkenlik göstermektedir. Bu nedenle, mutlak sayılardan çıkarılan sonuçlar yanlış olabilir ve kaçınılmalıdır. Ek olarak, dokularda IL-9 eksprese eden T hücrelerinin düşük sıklığı göz önüne alındığında, mümkün olan en yüksek sayıda hücrenin elde edilmesi ve boyanması önerilir.
Bu ILC2 analizinin bir sınırlaması, bu popülasyonu tanımlamak için ayrı bir belirteç kombinasyonunun kullanılmasıdır. İlgilenilen dokuya ve enfeksiyon evresine bağlı olarak, CD25, Klrg1 ve ST2 gibi ek belirteçler, ILC2 hücrelerinin22 daha ayrıntılı bir fenotipik karakterizasyonu için kullanılabilir. Burada sunulan protokolün INFER muhabiri fare suşu4'e dayandığını ve IL-9 eksprese eden hücrelerin tanımlanması için bir avantaj oluşturabileceğini kabul ediyoruz. Bununla birlikte, burada bulunan sonuçların, diğer fare muhabiri suşlarının kullanımı ve hücre içi IL-9 boyama 6,7,8,9 dahil olmak üzere alternatif stratejiler kullanılarak elde edilebileceğini umuyoruz. Konvansiyonel farelerin kullanılması ve intraepitelyal ve lamina propria hücrelerinde IL-9'un hücre içi boyanmasının yapılmasının, saptanabilir herhangi bir sinyalin kaybedilmesine ve elde edilen verilerin tehlikeye atılmasına neden olabileceğini belirtmek önemlidir (Ek Şekil 7). Bunun nedeni, ex vivo izole edilmesi ve sürdürülmesi zaten zor olan bir alt kümeyi boyamak için gereken uzun vadeli manipülasyon olabilir. Bu nedenle, işlem sürelerini azaltmak ve IL-9 ekspresyonunun in vivo olarak güvenilir bir analizini sağlamak için muhabir fare suşlarının kullanılmasını öneririz. Ayrıca, Th9 hücrelerinin IL-923'ü eksprese eden tek T hücresi olmadığı gerçeğini de kabul ediyoruz; ancak, bu parazitik modelde, diğer alt kümelerin bunu ifade etmesini beklemeyiz. Bununla birlikte, tarif edilen bağlamda diğer IL-9 eksprese eden alt kümelerin varlığını atmak için, transkripsiyonel belirteçlerin kullanımı ile birlikte tip 2 sitokinlerin tam bir karakterizasyonu mümkündür.
IL-9 eksprese eden lenfoid hücrelerin enfeksiyon sonrası 5. günden önce nicelleştirilmesi daha önce bildirilmiştir; ancak, çok düşük hücre frekansları ile sonuçlanır4. Bu çalışmadaki protokol, parazit klirensinin başlangıcına kadar N. brasiliensis enfeksiyonu kinetiğinin büyük bir bölümünü kapsamaktadır2. Bununla birlikte, bu çalışmadaki bazı hücre popülasyonlarının analiz edilen zaman dilimi içinde bazal seviyelere dönmediğini fark ettik, bu da çalışmanın, enfeksiyonun in vivo daha ileri bir aşamasında bu hücrelerin davranışı hakkında tam bir bakış açısına sahip olmak için genişletilmiş zaman noktalarından yararlanabileceğini düşündürmektedir. Ne olursa olsun, burada sunulan çalışmanın, parazit enfeksiyonu modellerinde IL-9 eksprese eden lenfoid hücreleri incelemek isteyen araştırmacılar için bir referans rehberi olarak hizmet edebileceğine ve spesifik hücre tiplerinin ilgili dokulardan tespiti için ideal enfeksiyon aşamasını seçmelerine izin verebileceğine inanıyoruz. Toplamda, burada açıklanan yöntemler, fizyolojik olarak ilgili bir parazit enfeksiyonu modeli sırasında IL-9'u eksprese eden T lenfositlerin ve ILC2 hücrelerinin fenotipini ve işlevini değerlendirmek, bu hücreler hakkındaki bilgimizi genişletmek ve potansiyel olarak diğer patolojik durumlarda onları anlamamızı geliştirmek için yararlı olacaktır.

Kancalı kurtlar, çoğunlukla az gelişmiş ülkelerdeki tropikal bölgelerde, dünya çapında yaklaşık 700 milyon insanı enfekte eden bağırsak parazitleridir. İnsanlarda en sık görülen kancalı kurt parazitleri olan Ancylostoma duodenale ve Necator americanus ile yüksek yoğunluklu enfeksiyonlar, gecikmiş büyüme ve zihinsel gelişime neden olabilecek anemi ve proteineksikliğine neden olur 1. N. americanus ve kemirgen paraziti Nippostrongylus brasiliensis, konakçılarında prototipik bir tip 2 immün yanıtı indükler ve yaşam döngülerinde benzerlikleri paylaşırlar. Bu nedenle, farelerin N. brasiliensis ile enfeksiyonu, insan kancalı kurt enfeksiyonları için en yaygın kullanılan modeldir. Evre 3 (L3) N. brasiliensis enfektif larvaları, enfeksiyondan sonraki ilk birkaç saat içinde deriden akciğere hareket eder. Akciğere girdikten sonra, L4 olurlar ve yutulmak, mideden geçmek ve 4-5 gün içinde yetişkin olmak için bağırsağa ulaşmak için trakeadan yukarı göç ederler (L5). Bağırsakta, L5 solucanları, parazit yaşam döngüsünü2 yeniden başlatmak için dışkıda atılan yumurtaları bırakır.
N. brasiliensis tarafından indüklenen immün yanıt, IL-4, IL-5, IL-9, IL-10 ve IL-13 dahil olmak üzere çeşitli tip 2 sitokinlerde bir artışın yanı sıra eozinofili, bazofili, kadeh ve mast hücresi hiperplazisi ve artmış IgG1 ve IgE üretimi ile karakterizedir. N. brasiliensis enfeksiyonu üzerine ortaya çıkan immün yanıtları tanımlamaya ve tanımlamaya çalışan çalışmaların çoğu, IL-4 veya IL-13'ün bu model3'teki rolüne odaklanmıştır. Bununla birlikte, IL-9 eksprese eden hücrelerin tanımlanması ve karakterizasyonu ve bu sitokinin işlevi, Licona-Limón ve ark., IL-9'un N. brasiliensis'e karşı bağışıklık tepkisinde kritik bir rol oynadığını gösteren ilk çalışmayı yayınlayana kadar büyük ölçüde göz ardı edilmiştir. Muhabir fareleri kullanan bu çalışma, T hücrelerini (çoğunlukla T yardımcı 9) ve tip 2 doğuştan gelen lenfoid hücreleri (ILC2'ler), enfeksiyon4 üzerine IL-9'u eksprese eden ana hücresel alt kümeler olarak tanımlamıştır.
Helmint ile enfekte akciğerlerden immün hücrelerin izolasyonu ve karakterizasyonu mümkündür ve kapsamlı bir şekilde rapor edilmiştir 3,4. Bununla birlikte, doğal doku yeniden şekillenmesi ve mukus üretimi nedeniyle, Ferrer-Font ve ark.5'in yakın zamanda yayınlanmasına kadar, enfekte bağırsakta bunu yapmanın teknik bir zorluk olduğu kanıtlanmıştır. Grup, Heligmosomoides poligyrus ile enfekte murin bağırsaklarından immün alt kümelerin tek hücreli süspansiyonlarını izole etmek ve analiz etmek için bir protokol özetledi. Buna dayanarak, şimdi N. brasiliensis ile enfekte olmuş bağırsaktan IL-9 eksprese eden lenfoid hücrelerin izolasyonu ve sitometrik analizi için bir protokol standartlaştırdık. Ek olarak, enfeksiyon boyunca farklı hücresel kaynaklardan ve anatomik konumlardan IL-9 kinetiği oluşturduk.
Bu enfeksiyonda yer alan farklı hücre popülasyonlarını karakterize etmek, parazite karşı bağışıklık tepkisinin ve konakçı ile etkileşiminin daha geniş bir şekilde anlaşılması için hayati öneme sahiptir. Bu kapsamlı protokol, IL-9 üreten hücreleri ilgilenilen hastalık aşamalarında istenen organlardan izole etmek ve analiz etmek için net bir yol sağlar ve bu hücrelerin N. brasiliensis enfeksiyonu ve genel olarak parazit enfeksiyonlarındaki rolü hakkındaki bilgilerin keskin bir şekilde iyileştirilmesini sağlar.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ACK buffer</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attune Nxt cytometer</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B220</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11c&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>117304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD19&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>115504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4 (BV421)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45.2</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>109846</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD90.2</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>105314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase D</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11088866001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse I</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18068015</td>
			<td>Specific activity: &#8805;10 000 units/mg&#160;&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Facs ARIA II sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Melody cell sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc-Block</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc&#949;RI</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13589885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26140079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo</td>
			<td>FlowJo</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometry analysis data software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gr-1</td>
			<td>Tonbo</td>
			<td>305931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-9</td>
			<td>biolegend</td>
			<td>514103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NK1.1&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>108704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon mesh</td>
			<td>&#160;&#8206; lba</td>
			<td>B07HYHHX5V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPrep Density Gradient Medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline&#160;</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Siglec F&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>155512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>405206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCR-&#946;&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>109203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCR-&#946; (PE/Cy7)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>109222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCR-&#947;&#948;&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>118103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ter119</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>116204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricine buffer&#160;</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zombie Aqua Fixable Viability Dye</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>423101</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a strategy for the study of il-9-producing lymphoid cells in the nippostrongylus brasiliensis infection model

IL-9, antitümör bağışıklığı, alerjik patolojilerin indüklenmesi ve parazitin atılmasında önemli bir rol oynadığı helmint enfeksiyonlarına karşı bağışıklık tepkisi dahil olmak üzere çeşitli süreçlerle ilişkili pleiotropik bir sitokindir. Nippostrongylus brasiliensis enfeksiyonunun murin modelinde, IL-9 esas olarak CD4 + T lenfositleri ve akciğer, ince bağırsak ve drenaj lenf düğümlerinde bulunan doğuştan gelen lenfoid hücreler tarafından üretilir. IL-9'un hücre içi boyanmasında yer alan teknik zorlukların yanı sıra hematopoetik hücrelerin enfeksiyon üzerine ince bağırsaktan izole edilmesinin karmaşıklığı göz önüne alındığında, bu modelde farklı lenfoid ve lenfoid olmayan dokularda IL-9 ekspresyonunu analiz etmek için kapsamlı ama basit bir protokole acil bir ihtiyaç vardır. Burada tarif edilen protokol, CD4 + T hücreleri tarafından üretilen IL-9'un kinetiğini ve enfeksiyon boyunca N. brasiliensis tarafından hedeflenen ana organlar olan akciğer ve ince bağırsaktaki doğuştan gelen lenfoid hücrelerin, ayrıca mediastinal ve mezenterik lenf düğümlerinin ana hatlarını çizmektedir. Ek olarak, hücre tipine ve ilgilenilen organa bağlı olarak enfeksiyon için gerekli larva sayısını detaylandırır. Bu protokol, N. brasiliensis enfeksiyon modelinde ilgi çekici spesifik hücrelere, organlara ve hastalık aşamalarına odaklanma fırsatı sunarak zamandan ve kaynaklardan tasarruf etmek için tahlillerin standardizasyonuna yardımcı olmayı amaçlamaktadır.

Farelere deri altından 200 L3 evre N. brasiliensis larvası veya sahte kontroller için PBS enjekte edildi. Bu protokolde kullanılan larva sayısı, canlı hücreleri akciğerlerden, lenfoid dokudan ve ince bağırsaktan izole etmek için ayarlandı, lenfoid dokulardaki ve akciğerlerdeki hücreleri tespit etmek için daha yüksek solucan yüklerinin kullanıldığı önceki raporların aksine, sadece4. Akciğerler, mediastinal lenf nodları, mezenterik lenf nodları ve ince bağırsak, lenfosit izolasyonu ve IL-9 üreten popülasyonların karakterizasyonu için enfeksiyon sonrası 0, 4, 7 ve 10. günlerde hasat edildi. Analiz edilen zaman noktası başına dokuz kontrol ve dört ila altı N. brasiliensis ile enfekte olmuş fare dahil olmak üzere iki veya daha fazla bağımsız deneyde toplam 27 fare kullanılmıştır. Bazal sayıları elde etmek için her deneye sahte enfekte kontroller dahil edildi. Bu protokolü kullanarak, IL-9 üreten CD4 + T hücreleri (bu modelde çoğunlukla Th9 hücreleri), nicelleştirme ve daha ileri analiz için akciğer, mezenterik ve mediastinal lenf düğümlerinden izole edilebilir.
Enfeksiyonun doğal seyrini takiben, ilk olarak akciğerlerde ve mediastinal lenf nodlarında bulunan IL-9 üreten CD4 + T lenfositlerin (Th9) frekanslarını değerlendirdik (Şekil 2A ve Ek Şekil 3A'da gösterilen geçiş stratejisi). Her iki organda da, Th9 frekansları 4. günden başlayarak artmış ve enfeksiyon sonrası 7. günde zirveye ulaşmıştır (Şekil 2C), Th9 mutlak sayılarında da gözlenen bir artış (Ek Şekil 4A, B). Mezenterik lenf nodlarında (Şekil 2B'de gösterilen geçit stratejisi), önceki raporlar 4'e uygun olarak, enfeksiyon sonrası 7. ve 10. günlerde Th9 hücrelerinin hem frekanslarında hem de mutlak sayılarında anlamlı bir artış olmuştur (Şekil 2C ve Ek Şekil 4C). İntraepitelyal ve lamina propria örneklerinde T hücrelerinin ve ILC2'lerin varlığı doğrulandı; Bununla birlikte, enfeksiyon boyunca bu bağırsak bölmelerinde Th9 hücresi gözlenmedi (Ek Şekil 3B, C).
Daha sonra enfekte farelerin lenfoid ve lenfoid olmayan dokularında IL-9 eksprese eden ILC2 hücrelerini değerlendirdik ( Şekil 3A, B ve Ek Şekil 2'de gösterilen geçit stratejisi). Enfeksiyon sonrası 7. günde akciğerlerde ILC2 eksprese eden ST2+ IL-9- ve ST2+ IL-9+ frekanslarında anlamlı bir artış gözlemledik (Şekil 3C). Aynı zamanda, mutlak sayıların analizi, enfeksiyon sonrası 7. günde sadece ST2 + IL-9 + popülasyonunda istatistiksel olarak anlamlı bir artış olduğunu ortaya koymuştur (Ek Şekil 5A). Mediastinal lenf nodlarında ( Ek Şekil 2B'de gösterilen geçit stratejisi), IL-9 eksprese eden ILC2 hücrelerinin (ST2 + IL-9+) sayısı enfeksiyon sonrası 10. günde önemli ölçüde artarken, ST2 + hücrelerinin mutlak sayısı 7. günden başlayıp enfeksiyon sonrası 10. güne kadar devam eden bir artış eğilimi göstermiştir (Ek Şekil 6A, C).
IL-9+ ILC2 hücreleri ayrıca ince bağırsağın lamina propriasında ve intraepitelyal kompartmanlarında da bulundu (Şekil 3B ve Ek Şekil 2A'da gösterilen geçit stratejisi). N. brasiliensis enfeksiyonu, lamina propriada 4. günde ST2 + IL-9 + hücrelerinin frekanslarında ve 7. ve 10. günlerde ST2-IL-9 + popülasyonlarında istatistiksel olarak anlamlı bir artışa neden olmuştur. İntraepitelyal kompartmanda, ST2+ IL9+ ve ST2-IL-9+ hücrelerinin frekanslarında enfeksiyon sonrası sırasıyla 7. gün ve 10. günde anlamlı bir değişiklik gözlenmiştir (Şekil 3C). Önemli olarak, nispeten düşük sayıda larva yüküyle bile, parazit ile enfeksiyon ince bağırsakta geniş hasara neden oldu; Bu nedenle, IL-9'u ifade eden ILC2'lerin mutlak sayılarının analizi teknik olarak mümkün değildir ve canlı hücrelerin düşük verimi nedeniyle bu popülasyonun doğru bir şekilde ölçülmesini engellemektedir (Ek Şekil 5B, C). Öte yandan, mezenterik lenf nodlarının analizi (Ek Şekil 2C'de gösterilen geçit stratejisi), dahaönce bildirildiği gibi, enfeksiyon sonrası 10. günde ST2 + IL-9-, ST2 + IL-9 + ve ST2- IL-9 + ILC2 hücrelerinin mutlak sayılarında anlamlı bir artış olduğunu ortaya koymuştur (Ek Şekil 6D). Bu arada, enfeksiyon boyunca bu popülasyonların frekanslarında hiçbir fark gözlenmedi (Ek Şekil 6B). ST2 ve IL-9 eksprese eden hücrelerin bu çeşitli alt kümeleri, in vivo olarak potansiyel olarak farklı rollere sahip ilgi çekici popülasyonlardır ve yakın zamanda tanımlandığı gibi doğal ve enflamatuar ILC2'lere karşılık gelebilir 18,19,20,21. Bununla birlikte, bunun gelecekteki çalışmalarda ele alınması gerekmektedir.
Özetle, bu protokolü IL-9 eksprese eden hücrelerin N. brasiliensis ile enfekte olmuş bağırsaktan geri kazanılması için ayarladık, ancak yine de akciğer ve lenfoid dokuda tespit edebildik. Bağışıklık hücrelerini parazitle enfekte olmuş bağırsaklardan almanın teknik olarak zor olduğu kanıtlanmıştır. Burada, enfeksiyon için kullanılan ayarlanmış sayıda larva, IL-9 + popülasyonunun iyileşmesine izin veren bağırsak dokusu bütünlüğünün iyileşmesine neden oldu. Bildiğimiz kadarıyla, bu, N. brasiliensis enfeksiyonu sırasında bağırsaktaki IL-9 eksprese eden hücrelerin analizi için özel olarak geliştirilen ilk protokoldür. Bununla birlikte, diğer bağışıklık hücreleri de bu adımları izleyerek izole edilebilir. Burada sunulan veriler, ince bağırsaktaki dokuda yerleşik IL-9 eksprese eden hücrelerin çoğunun ILC2'ler olduğunu göstermektedir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64075/64075fig01.jpg"> Şekil 1: Açıklanan protokolün akış şeması. Farklı organları işlemek için kullanılan ana adımları ve beklenen IL-9-eksprese eden hücre alt kümelerini içeren şematik diyagram. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/64075/64075fig01large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64075/64075fig02.jpg"> Şekil 2: Th9 hücreleri, N. brasiliensis enfeksiyonu boyunca akciğerlerde, mediastinal ve mezenterik lenf nodlarında bulunur. (A) akciğerlerden ve (B) mezenterik lenf nodlarından Th9 hücre tanımlaması için kullanılan temsili akım sitometri analizi ve geçit stratejisi. Her organdan alınan tek hücreli süspansiyonlar, hematopoetik hücrelerin tanımlanması için floresan olarak etiketlenmiş anti-CD45 ve CD4 + T lenfositlerin tanımlanması için anti-T-hücre reseptörü (TCR) β ve anti-CD4 ile sabitlenebilir bir canlılık boyası ile boyandı. GFP + sinyali, mevcut Th9 hücrelerinin yüzdesini gösterir. İlk kapı, lenfoid hücrelerin klasik morfolojisi ile yan saçılma (SSC)-A/ileri saçılma (FSC)-A özelliklerini gösterir. Tek hücreli olaylar seçildi, ardından canlı hücreler ve ardından CD45+ hücreleri geldi. Bu popülasyonda, GFP + hücrelerinin Th9 hücreleri olarak tanımlandığı TCR-β ve CD4 çift pozitif hücrelere odaklandık. Lenf düğümlerinin boyanması anti-CD45 antikorunu içermiyordu, çünkü tüm popülasyonun pozitif olması bekleniyordu. (C) Enfeksiyon sonrası belirtilen zamanlarda akciğerlerde, mediastinal ve mezenterik lenf nodlarında bulunan Th9 hücrelerinin frekansları. Veriler, zaman noktası başına üç bağımsız deneyden, grup başına analiz edilen bir veya iki farenin ortalama ± SEM'ini temsil eder; Eşleşmemiş T-testi; *p≤ 0,05, **p≤ 0,001, ***p≤ 0,0001. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/64075/64075fig02large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64075/64075fig03.jpg"> Şekil 3: IL-9 üreten ILC2 hücreleri lenfoid olmayan organlarda bulunur. (A) akciğer ve (B) ince bağırsak lamina propriasından IL-9+ ILC2 hücrelerinin tanımlanmasında kullanılan temsili akım sitometri analizi ve geçit stratejisi. Her organdan tek hücreli süspansiyonlar, soy hücrelerini (anti-B220, anti-CD11b, anti-FcεRI, anti-TCR-β, anti-TCR-γδ, anti-Siglec F, anti-CD4, anti-CD11c, anti-Gr-1, anti-CD8, anti-CD19, anti-NK1.1 ve anti-Ter119) ve Fc-Block'u tanımlamak için biyotinile antikorlarla işaretlendi. Hücre süspansiyonları daha sonra sabitlenebilir canlılık boyası, florokrom etiketli streptavidin, hematopoetik hücrelerin tanımlanması için anti-CD45 ve ILC2 hücrelerinin tanımlanması için anti-CD90 ile boyandı. İlk kapı, lenfoid hücrelerin klasik morfolojisi ile saçılma (SSC)-A/yan saçılma (FSC)-A özelliklerini gösterir. Tek hücreli olaylar seçildi, ardından canlı hücreler ve ardından CD45+ hücreleri geldi. Bu popülasyonda, CD90 + lin- hücrelerine odaklandık; Bu gruptan ST2 ve GFP ekspresyonunu değerlendirerek IL-9+ ILC2 hücrelerini tanımladık. (C) Akciğerlerde, lamina propria'da ve intraepitelyal hücre bölmesinde belirtilen zamanlarda bulunan ILC2 hücrelerinin frekansları enfeksiyon sonrası noktalar. Veriler, zaman noktası başına üç bağımsız deneyden, grup başına analiz edilen bir veya iki farenin ortalama ± SEM'ini temsil eder; eşlenmemiş T-testi; *p 0,05 ≤. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/64075/64075fig03large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Tablo 1: Kimyasal çözeltilerin ve bileşimlerinin listesi. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/64075/Table%201.xlsx" target="_blank">Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.</a>
Tablo 2: IL-9 üreten ILC2 hücrelerini tanımlamak için antikor kokteyli. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/64075/Table%202%20final.xlsx" target="_blank">Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.</a>
Tablo 3: IL-9 üreten T lenfositleri tanımlamak için antikor kokteyli. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/64075/Table%203%20final.xlsx" target="_blank">Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.</a>
Ek Şekil 1: Mediastinal lenf nodu lokalizasyonunun şematik gösterimi. Created in BioRender.com <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/64075/Supplementary%20Figure%201.pdf" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Şekil 2: İnce bağırsak ve lenf nodlarından intraepitelyal hücreler içindeki IL-9+ ILC2'leri tanımlamak için kullanılan temsili akım sitometrisi ve geçit stratejisi. (A) İnce bağırsak intraepitel hücrelerinden tek hücreli süspansiyonlar ilk olarak soy hücrelerini (anti-B220, anti-CD11b, anti-FcεRI, anti-TCR-β, anti-TCR-γδ, anti-Siglec F, anti-CD4, anti-CD11c, anti-Gr-1, anti-CD8, anti-CD19, anti-NK1.1 ve anti-Ter119) ve Fc-Block'u seçmek için biyotin etiketli antikorlarla inkübe edildi. Bunu, sabitlenebilir bir canlılık boyası, florokrom etiketli streptavidin, hematopoetik hücrelerin tanımlanması için anti-CD45 ve ILC2 hücrelerinin tanımlanması için anti-CD90 ile boyama izledi. İlk kapı, lenfoid hücrelerin klasik morfolojisi ile yan saçılma (SSC)-A/ileri saçılma (FSC)-A özelliklerini gösterir. Tek hücreli olaylar seçildi, ardından canlı hücreler ve ardından CD45+ hücreleri geldi. Bu popülasyonda, CD90 + lin- hücrelerine odaklandık; Bu gruptan GFP+ hücreleri IL-9+ ILC2 hücreleri olarak tanımlandı. (B,C) IL-9+ ILC2 hücrelerini tanımlamak için (B) mediastinal lenf nodları ve (C) mezenterik lenf nodları için temsili akım sitometrisi ve geçit stratejisi. Lenf nodlarının boyanması anti-CD45 antikorunu içermiyordu, çünkü tüm popülasyonun pozitif olması bekleniyordu. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/64075/Supplementary%20Figure%202F.pdf" target="_blank">Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.</a>
Ek Şekil 3: Mediastinal lenf nodlarında ve ince bağırsakta Th9 hücrelerini tanımlamak için kullanılan temsili akım sitometri analizi ve geçit stratejisi. (A) mediastinal lenf nodlarından tek hücreli süspansiyonlar, sabitlenebilir bir canlılık boyası ve floresan olarak etiketlenmiş anti-TCR-β ve anti-CD4 antikorları ile boyandı. İlk kapı, lenfoid hücrelerin klasik morfolojisi ile yan saçılma (SSC)-A/ileri saçılma (FSC)-A özelliklerini gösterir. Tek hücreli olaylar seçildi, ardından canlı hücreler ve ardından TCR-β ve CD4 çift pozitif hücreler; Bu gruptan GFP+ hücreleri Th9 hücreleri olarak tanımlandı. İnce bağırsaktan (B) lamina propria ve (C) intraepitelyal hücreler için benzer bir akış sitometri stratejisi kullanıldı, ancak CD45 + hücreleri canlı hücrelerden sonra seçildi, ardından GFP + hücrelerinin Th9 hücreleri olarak tanımlandığı TCR-β ve CD4 çift pozitif hücreler izledi. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/64075/Supplementary%20Figure%203F.pdf" target="_blank">Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.</a>
Ek Şekil 4: Th9 hücrelerinin mutlak sayısı enfeksiyon boyunca önemli ölçüde değişir. TCR-β ve CD4 çift pozitif hücrelerden IL-9+ hücrelerinin mutlak sayıları, (A) akciğer, (B) mediastinal lenf nodları ve (C) mezenterik lenf nodlarında enfeksiyon sonrası 0, 4, 7 ve 10. günlerde belirlendi. Veriler, zaman noktası başına üç bağımsız deneyden, grup başına analiz edilen bir veya iki farenin ortalama ± SEM'ini temsil eder; eşlenmemiş T-testi *p 0,05, **p ≤ 0,001, ***P ≤ 0,0001 ≤. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/64075/Supplementary%20Figure%204F.pdf" target="_blank">Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.</a>
Ek Şekil 5: IL-9 + ILC2 hücrelerinin mutlak sayıları enfeksiyon boyunca farklılık gösterir. Enfeksiyon sonrası 0, 4, 7 ve 10. günlerde lin-CD90+ popülasyonundan IL-9+ ILC2 hücrelerinin mutlak sayıları (A) akciğer, (B) lamina propria ve (C) ince bağırsaktan intraepitelyal hücrelerde belirlendi. Veriler, zaman noktası başına üç bağımsız deneyden, grup başına analiz edilen bir veya iki farenin ortalama ± SEM'ini temsil eder; eşlenmemiş T-testi *p ≤ 0.05. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/64075/Supplementary%20Figure%205.pdf" target="_blank">Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.</a>
Ek Şekil 6: Lenf nodlarındaki IL-9+ ILC2 hücrelerinin frekansları ve mutlak sayıları enfeksiyon sırasında önemli ölçüde artar. (A) Mediastinal lenf nodlarından IL-9+ ILC2 hücrelerinin sıklığı ve (C) mutlak sayıları. (B) Mezenterik lenf nodlarından IL-9+ ILC2 hücrelerinin sıklığı ve (D) mutlak sayıları. Değerler, enfeksiyon sonrası 0, 4, 7 ve 10. günlerde lin-CD90+ popülasyonu içinde IL-9+ ILC2 hücreleri olarak belirlendi. Veriler, zaman noktası başına üç bağımsız deneyden, grup başına analiz edilen bir veya iki farenin ortalama ± SEM'ini temsil eder; eşlenmemiş T-testi * p ≤ 0.05, ***p ≤ 0.0001. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/64075/Supplementary%20Figure%206.pdf" target="_blank">Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.</a>
Ek Şekil 7: N. brasiliensis ile enfekte bağırsaktan ILC2 hücrelerini eksprese eden IL-9'un akış sitometrisi analizi. Enfeksiyon sonrası 7. günde IL-9-muhabir farelerin bağırsağından izole edilen ILC2 hücrelerinin temsili grafikleri. IL-9 ekspresyonu, enfekte muhabir farelerin (IL-9 REP) intraepitelyal veya lamina propria bölmelerinden yeni izole edilmiş ILC2 hücrelerinde, daha önce tarif edilen IL-9 hücre içi boyama protokolü 9'u (IL-9 AB, bir IL-9 antikor klonu RM9A4, BioLegend kullanılarak) takiben değerlendirildi. IL-9 eksprese eden ILC2'leri tanımlamak için, tek hücreli süspansiyonlar ilk önce soy hücrelerini (anti-B220, anti-CD11b, anti-FcεRI, anti-TCR-β, anti-TCR-γδ, anti-Siglec F, anti-CD4, anti-CD11c, anti-Gr-1, anti-CD8, anti-CD19, anti-NK1.1 ve anti-Ter119) ve Fc-Block seçmek için biyotin etiketli antikorlarla inkübe edildi, ardından esnek canlılık boyası, florokrom etiketli streptavidin, anti-CD45 ve anti-CD90 ile boyandı. Grafikler, intraepitelyal (A,B) ve lamina propria (C,D) bölmelerinde bulunan lin-CD45+CD90+ popülasyonu üzerinde geçitli, taze izole edilmiş hücrelerden (A,C) gelen muhabir sinyaliyle veya IL-9'un (B,D) hücre içi boyanmasını takiben tespit edilen IL-9 eksprese eden ILC2 hücrelerini göstermektedir. Kontrol farelerine PBS enjekte edildi. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/64075/Supplementary%20Figure%207.pdf" target="_blank">Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Strategy for the Study of IL-9-Producing Lymphoid Cells in the Nippostrongylus brasiliensis Infection Model at JoVE.com

A Strategy for the Study of IL-9-Producing Lymphoid Cells in the Nippostrongylus brasiliensis Infection Model

IL-9 eksprese eden T ve ILC2 hücreleri, N. brasiliensis enfeksiyonu sırasında indüklenir, ancak düşük frekansları ve diferansiyel kinetik olmaları nedeniyle enfekte bağırsakta karakterizasyonları büyük ölçüde göz ardı edilmiştir. Bu protokol, bu hücrelerin farklı hedef organlardan izole edilmesini ve farklı enfeksiyon aşamalarında akış sitometrisi yoluyla kimliklerinin doğrulanmasını açıklar.

Nippostrongylus brasiliensis Enfeksiyon Modelinde IL-9 Üreten Lenfoid Hücrelerin İncelenmesi İçin Bir Strateji

IL-9 is a pleiotropic cytokine associated with various processes, including antitumor immunity, induction of allergic pathologies, and the immune response ...

a-strategy-for-study-il-9-producing-lymphoid-cells-nippostrongylus

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Strategy for the Study of IL-9-Producing Lymphoid Cells in the Nippostrongylus brasiliensis Infection Model

1.2K Görüntüleme.  Universidad Nacional Autónoma de México. IL-9 eksprese eden T ve ILC2 hücreleri, N. brasiliensis enfeksiyonu sırasında indüklenir, ancak düşük frekansları ve diferansiyel kinetik olmaları nedeniyle enfekte bağırsakta karakterizasyonları büyük ölçüde göz ardı edilmiştir. Bu protokol, bu hücrelerin farklı hedef organlardan izole edilmesini ve farklı enfeksiyon aşamalarında akış sitometrisi yoluyla kimliklerinin doğrulanmasını açıklar.

Video: A Strategy for the Study of IL-9-Producing Lymphoid Cells in the Nippostrongylus brasiliensis Infection Model

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

Bakteriyel Yapışma Çalışma Kesme Stres Tanıtımı

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the simultaneous infection of the cell by a number of phages, one of two pathways is chosen: lytic (virulent) or lysogenic (dormant)3,4. We recently developed a method for fluorescently labeling individual phages, and were able to examine the post-infection decision in real-time under the microscope, at the level of individual phages and cells5. Here, we describe the full procedure for performing the infection experiments described in our earlier work5. This includes the creation of fluorescent phages, infection of the cells, imaging under the microscope and data analysis. The fluorescent phage is a "hybrid", co-expressing wild- type and YFP-fusion versions of the capsid gpD protein. A crude phage lysate is first obtained by inducing a lysogen of the gpD-EYFP (Enhanced Yellow Fluorescent Protein) phage, harboring a plasmid expressing wild type gpD. A series of purification steps are then performed, followed by DAPI-labeling and imaging under the microscope. This is done in order to verify the uniformity, DNA packaging efficiency, fluorescence signal and structural stability of the phage stock. The initial adsorption of phages to bacteria is performed on ice, then followed by a short incubation at 35&deg;C to trigger viral DNA injection6. The phage/bacteria mixture is then moved to the surface of a thin nutrient agar slab, covered with a coverslip and imaged under an epifluorescence microscope. The post-infection process is followed for 4 hr, at 10 min interval. Multiple stage positions are tracked such that ~100 cell infections can be traced in a single experiment. At each position and time point, images are acquired in the phase-contrast and red and green fluorescent channels. The phase-contrast image is used later for automated cell recognition while the fluorescent channels are used to characterize the infection outcome: production of new fluorescent phages (green) followed by cell lysis, or expression of lysogeny factors (red) followed by resumed cell growth and division. The acquired time-lapse movies are processed using a combination of manual and automated methods. Data analysis results in the identification of infection parameters for each infection event (e.g. number and positions of infecting phages) as well as infection outcome (lysis/lysogeny). Additional parameters can be extracted if desired.

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

This article describes the procedure for preparing a fluorescently-labeled version of bacteriophage lambda, infection of E. coli bacteria, following the infection outcome under the microscope, and analysis of infection results.

Hücre-kaderi ardından<em&gt; E. coli</em&gt; Faj Lambda tarafından Enfeksiyon Sonrası

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

Cutaneous Leishmaniasis in the Dorsal Skin of Hamsters: a Useful Model for the Screening of Antileishmanial Drugs

Traditionally, hamsters are experimentally inoculated in the snout or the footpad. However in these sites an ulcer not always occurs, measurement of lesion size is a hard procedure and animals show difficulty to eat, breathe and move because of the lesion. In order to optimize the hamster model for cutaneous leishmaniasis, young adult male and female golden hamsters (Mesocricetus auratus) were injected intradermally at the dorsal skin with 1 to 1.5 x l07 promastigotes of Leishmania species and progression of subsequent lesions were evaluated for up to 16 weeks post infection. The golden hamster was selected because it is considered the adequate bio-model to evaluate drugs against Leishmania as they are susceptible to infection by different species. Cutaneous infection of hamsters results in chronic but controlled lesions, and a clinical evolution with signs similar to those observed in humans. Therefore, the establishment of the extent of infection by measuring the size of the lesion according to the area of indurations and ulcers is feasible. This approach has proven its versatility and easy management during inoculation, follow up and characterization of typical lesions (ulcers), application of treatments through different ways and obtaining of clinical samples after different treatments. By using this method the quality of animal life regarding locomotion, search for food and water, play and social activities is also preserved.

Optimization of the experimental hamster model for cutaneous leishmaniasis by intradermal injection of Leishmania promastigotes at the dorsal skin. This approach is useful during inoculation, follow-up, characterization of lesions, application of treatments and obtaining of clinical samples. Locomotion, search for food and water, play and social activities are preserved.

Hamsterlar ve Dorsal Skin Kutanöz Leishmaniasis: Antileishmanial Uyuşturucu Tarama için Faydalı Model

Traditionally, hamsters are experimentally inoculated in the snout or the footpad. However in these sites an ulcer not always occurs, measurement of ...

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological deficiencies. GVHD is caused by mature alloreactive T cells present in the bone marrow graft that are infused into the recipient and cause damage to host organs. However, in mice, T cells must be added to the bone marrow inoculum to cause GVHD. Although extensive work has been done to characterize T cell responses post transplant, bioluminescent imaging technology is a non-invasive method to monitor T cell trafficking patterns in vivo. 
Following lethal irradiation, recipient mice are transplanted with bone marrow cells and splenocytes from donor mice. T cell subsets from L2G85.B6 (transgenic mice that constitutively express luciferase) are included in the transplant. By only transplanting certain T cell subsets, one is able to track specific T cell subsets in vivo, and based on their location, develop hypotheses regarding the role of specific T cell subsets in promoting GVHD at various time points. At predetermined intervals post transplant, recipient mice are imaged using a Xenogen IVIS CCD camera. Light intensity can be quantified using Living Image software to generate a pseudo-color image based on photon intensity (red = high intensity, violet = low intensity). 
Between 4-7 days post transplant, recipient mice begin to show clinical signs of GVHD. Cooke et al.1 developed a scoring system to quantitate disease progression based on the recipient mice fur texture, skin integrity, activity, weight loss, and posture. Mice are scored daily, and euthanized when they become moribund. Recipient mice generally become moribund 20-30 days post transplant. 
Murine models are valuable tools for studying the immunology of GVHD. Selectively transplanting particular T cell subsets allows for careful identification of the roles each subset plays. Non-invasively tracking T cell responses in vivo adds another layer of value to murine GVHD models.

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Murine bone marrow transplantation is a widely used technique to study immunological mechanisms governing graft-versus-host disease in humans. The ability to monitor T cell trafficking patterns in vivo allows for detailed analysis of the development and perpetuation of T cell responses during graft-versus-host disease.

Graft-versus-host hastalığı indüksiyonu ve<em&gt; In Vivo</emBir MHC-eşlemeli murin Model Kullanma&gt; T Hücre İzleme

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. However, isolating bacterial RNA from infected cells or tissues is a challenging task, since mammalian RNA mostly dominates the lysates of infected cells. Here we describe an optimized method for RNA isolation of Listeria monocytogenes bacteria growing within bone marrow derived macrophage cells. Upon infection, cells are mildly lysed and rapidly filtered to discard most of the host proteins and RNA, while retaining intact bacteria. Next, bacterial RNA is isolated using hot phenol-SDS extraction followed by DNase treatment. The extracted RNA is suitable for gene transcription analysis by multiple techniques. This method is successfully employed in our studies of Listeria monocytogenes gene regulation during infection of macrophage cells 1-4. The protocol can be easily modified to study other bacterial pathogens and cell types.

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

Here we describe a method for bacterial RNA isolation from Listeria monocytogenes bacteria growing inside murine macrophages. This technique can be used with other intracellular pathogens and mammalian host cells.

RNA Arıtma Hücre içindeki dan Yetiştirilen<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Makrofaj

Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. ...

A Rapid Strategy for the Isolation of New Faustoviruses from Environmental Samples Using Vermamoeba vermiformis

The isolation of giant viruses is of great interest in this new era of virology, especially since these giant viruses are related to protists. Giant viruses may be potentially pathogenic for many species of protists. They belong to the recently described order of Megavirales. The new lineage Faustovirus that has been isolated from sewage samples is distantly related to the mammalian pathogen African swine fever virus. This virus is also specific to its amoebal host, Vermamoeba vermiformis, a protist common in health care water systems. It is crucial to continue isolating new Faustovirus genotypes in order to enlarge its genotype collection and study its pan-genome. We developed new strategies for the isolation of additional strains by improving the use of antibiotic and antifungal combinations in order to avoid bacterial and fungal contaminations of the amoeba co-culture and favoring the virus multiplication. We also implemented a new starvation medium to maintain V. vermiformis in optimal conditions for viruses co-culture. Finally, we used flow cytometry rather than microscopic observation, which is time-consuming, to detect the cytopathogenic effect. We obtained two isolates from sewage samples, proving the efficiency of this method and thus widening the collection of Faustoviruses, to better understand their environment, host specificity and genetic content.

A Rapid Strategy for the Isolation of New Faustoviruses from Environmental Samples Using Vermamoeba vermiformis

We describe here the latest advances in viral isolation for the characterization of new genotypes of Faustovirus, a new asfarvirus-related lineage of giant viruses. This protocol can be applied to the high throughput isolation of viruses, especially giant viruses infecting amoeba.

Kullanımı Çevre Örneklerinde Yeni Faustoviruses İzolasyonunda bir Hızlı Stratejisi<em&gt; Vermamoeba vermiformis</em

The isolation of giant viruses is of great interest in this new era of virology, especially since these giant viruses are related to protists. Giant ...

High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In response to these damages, complex molecular machineries rapidly reseal the plasma membrane to restore its barrier function and maintain cell survival. Despite 60 years of research in this field, we still lack a thorough understanding of the cell resealing machinery. With the goal of identifying cellular components that control plasma membrane resealing or drugs that can improve resealing, we have developed a fluorescence-based high-throughput assay that measures the plasma membrane resealing efficiency in mammalian cells cultured in microplates. As a model system for plasma membrane damage, cells are exposed to the bacterial pore-forming toxin listeriolysin O (LLO), which forms large 30-50 nm diameter proteinaceous pores in cholesterol-containing membranes. The use of a temperature-controlled multi-mode microplate reader allows for rapid and sensitive spectrofluorometric measurements in combination with brightfield and fluorescence microscopy imaging of living cells. Kinetic analysis of the fluorescence intensity emitted by a membrane impermeant nucleic acid-binding fluorochrome reflects the extent of membrane wounding and resealing at the cell population level, allowing for the calculation of the cell resealing efficiency. Fluorescence microscopy imaging allows for the enumeration of cells, which constitutively express a fluorescent chimera of the nuclear protein histone 2B, in each well of the microplate to account for potential variations in their number and allows for eventual identification of distinct cell populations. This high-throughput assay is a powerful tool expected to expand our understanding of membrane repair mechanisms via screening for host genes or exogenously added compounds that control plasma membrane resealing.

Here we describe a high-throughput fluorescence-based assay that measures the plasma membrane resealing efficiency through fluorometric and imaging analyses in living cells. This assay can be used for screening drugs or target genes that regulate plasma membrane resealing in mammalian cells.

Plazma zarı verimliliği memeli hücrelerinde yeniden mühürlemeden yüksek üretilen iş ölçümü

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In ...

The Galleria mellonella Waxworm Infection Model for Disseminated Candidiasis

Candida species are common fungal commensals of humans colonizing the skin, mucosal surfaces, and gastrointestinal tract. Under certain conditions, Candida can overgrow their natural niches resulting in debilitating mucosal infections as well as life-threatening systemic infections, which are a major focus of investigation due to their associated high mortality rates. Animal models of disseminated infection exist for studying disease progression and dissecting the characteristics of Candida pathogenicity. Of these, the Galleria mellonella waxworm infection model provides a cost-effective experimental tool for high-throughput investigations of systemic virulence. Many other bacterial and eukaryotic infectious agents have been effectively studied in G. mellonella to understand pathogenicity, making it a widely accepted model system. Yet, variation in the method used to infect G. mellonella can alter phenotypic outcomes and complicate interpretation of the results. Here, we outline the benefits and drawbacks of the waxworm model to study systemic Candida pathogenesis and detail an approach to improve reproducibility. Our results highlight the range of mortality kinetics in G. mellonella and describe the variables which can modulate these kinetics. Ultimately, this method stands as an ethical, rapid, and cost-effective approach to study virulence in a model of disseminated candidiasis.

The Galleria mellonella Waxworm Infection Model for Disseminated Candidiasis

Galleria mellonella serves as an invertebrate model for disseminated candidiasis. Here, we detail the infection protocol and provide supporting data for the model&#39;s effectiveness.

Galleria mellonella Waxworm enfeksiyon modeli Dissemine kandidiyazis için

Candida species are common fungal commensals of humans colonizing the skin, mucosal surfaces, and gastrointestinal tract. Under certain conditions, ...

Use of the Invertebrate Galleria mellonella as an Infection Model to Study the Mycobacterium tuberculosis Complex

Tuberculosis is the leading global cause of infectious disease mortality and roughly a quarter of the world&#8217;s population is believed to be infected with Mycobacterium tuberculosis. Despite decades of research, many of the mechanisms behind the success of M. tuberculosis as a pathogenic organism remain to be investigated, and the development of safer, more effective antimycobacterial drugs are urgently needed to tackle the rise and spread of drug resistant tuberculosis. However, the progression of tuberculosis research is bottlenecked by traditional mammalian infection models that are expensive, time consuming, and ethically challenging. Previously we established the larvae of the insect Galleria mellonella (greater wax moth) as a novel, reproducible, low cost, high-throughput and ethically acceptable infection model for members of the M. tuberculosis complex. Here we describe the maintenance, preparation, and infection of G. mellonella with bioluminescent Mycobacterium bovis BCG lux. Using this infection model, mycobacterial dose dependent virulence can be observed, and a rapid readout of in vivo mycobacterial burden using bioluminescence measurements is easily achievable and reproducible. Although limitations exist, such as the lack of a fully annotated genome for transcriptomic analysis, ontological analysis against genetically similar insects can be carried out. As a low cost, rapid, and ethically acceptable model for tuberculosis, G. mellonella can be used as a pre-screen to determine drug efficacy and toxicity, and to determine comparative mycobacterial virulence prior to the use of conventional mammalian models. The use of the G. mellonella-mycobacteria model will lead to a reduction in the substantial number of animals currently used in tuberculosis research.

Use of the Invertebrate Galleria mellonella as an Infection Model to Study the Mycobacterium tuberculosis Complex

Galleria mellonella was recently established as a reproducible, cheap, and ethically acceptable infection model for the Mycobacterium tuberculosis complex. Here we describe and demonstrate the steps taken to establish successful infection of G. mellonella with bioluminescent Mycobacterium bovis BCG lux.

Mycobacterium tüberküloz kompleksinin incelenmesi Için bir enfeksiyon modeli olarak ınvertebrate Galleria mellonella kullanımı

Tuberculosis is the leading global cause of infectious disease mortality and roughly a quarter of the world&#8217;s population is believed to be infected ...

Lentiviral CRISPR/Cas9-Mediated Genome Editing for the Study of Hematopoietic Cells in Disease Models

Manipulating genes in hematopoietic stem cells using conventional transgenesis approaches can be time-consuming, expensive, and challenging. Benefiting from advances in genome editing technology and lentivirus-mediated transgene delivery systems, an efficient and economical method is described here that establishes mice in which genes are manipulated specifically in hematopoietic stem cells. Lentiviruses are used to transduce Cas9-expressing lineage-negative bone marrow cells with a guide RNA (gRNA) targeting specific genes and a red fluorescence reporter gene (RFP), then these cells are transplanted into lethally-irradiated C57BL/6 mice. Mice transplanted with lentivirus expressing non-targeting gRNA are used as controls. Engraftment of transduced hematopoietic stem cells are evaluated by flow cytometric analysis of RFP-positive leukocytes of peripheral blood. Using this method, ~90% transduction of myeloid cells and ~70% of lymphoid cells at 4 weeks after transplantation can be achieved. Genomic DNA is isolated from RFP-positive blood cells, and portions of the targeted site DNA are amplified by PCR to validate the genome editing. This protocol provides a high-throughput evaluation of hematopoiesis-regulatory genes and can be extended to a variety of mouse disease models with hematopoietic cell involvement.

Described are protocols for the highly efficient genome editing of murine hematopoietic stem and progenitor cells (HSPC) by the CRISPR/Cas9 system to rapidly develop mouse model systems with hematopoietic system-specific gene modifications.

Hastalık Modellerinde Hematopoetik Hücrelerin İncelemi için Lentiviral CRISPR/Cas9-Aracılı Genom Düzenleme

Manipulating genes in hematopoietic stem cells using conventional transgenesis approaches can be time-consuming, expensive, and challenging. Benefiting ...

Nippostrongylus brasiliensis Enfeksiyon Modelinde IL-9 Üreten Lenfoid Hücrelerin İncelenmesi İçin Bir Strateji

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Bakteriyel Yapışma Çalışma Kesme Stres Tanıtımı

Hücre-kaderi ardından

Hamsterlar ve Dorsal Skin Kutanöz Leishmaniasis: Antileishmanial Uyuşturucu Tarama için Faydalı Model

Graft-versus-host hastalığı indüksiyonu ve

RNA Arıtma Hücre içindeki dan Yetiştirilen

Kullanımı Çevre Örneklerinde Yeni Faustoviruses İzolasyonunda bir Hızlı Stratejisi

Plazma zarı verimliliği memeli hücrelerinde yeniden mühürlemeden yüksek üretilen iş ölçümü

Galleria mellonella Waxworm enfeksiyon modeli Dissemine kandidiyazis için

Mycobacterium tüberküloz kompleksinin incelenmesi Için bir enfeksiyon modeli olarak ınvertebrate Galleria mellonella kullanımı

Hastalık Modellerinde Hematopoetik Hücrelerin İncelemi için Lentiviral CRISPR/Cas9-Aracılı Genom Düzenleme