저자는 José Luis Ramos-Balderas의 기술 지원에 감사드립니다. 이 작업은 CONACYT(FORDECYT-PRONACE-303027)에서 PLL에 대한 다음 보조금으로 지원되었습니다. OM-P와 EO-M은 CONACYT(각각 736162 및 481437)로부터 펠로우십을 받았습니다. MCM-M은 CONACYT(Estancias Posdoctorales por México 2022(3))로부터 펠로우십을 받았습니다.

여기에 설명 된 모든 동물 실험은 멕시코 국립 자치 대학교 세포 생리학 연구소의 내부 동물 취급위원회 (CICUAL)의 승인을 받았습니다.
참고: 전체 프로토콜의 순서도는 그림 1에 나와 있습니다.
1. 생쥐의 주거
<ol><li>8-10주령의 암컷 또는 수컷 생쥐를 12시간 명암 주기로 일정한 온도와 습도를 가진 동물 시설에 수용하고 물과 음식에 임의 로 접근할 수 있습니다. 참고: 이 프로토콜은 이전에 설명한 대로 C57BL/6 배경에서 IL-9 리포터 마우스 균주를 사용합니다4; 그러나, 다른 IL-9 리포터 균주(reporter strain 6,7,8)와 세포내 IL-9 염색(intracellular IL-9 staining)을 사용할 수 있으며, 다양한 결과가 나온다9.</li>
</ol>2. 생쥐 감염
<ol><li>감염 1 일 전에 몸의 중앙에서 꼬리 기저부 근처까지 생쥐의 등을 면도하십시오. 마취제의 사용은 필수적이지 않습니다.</li>
	<li>앞서설명한 바와 같이 허리에 100μL의 인산염 완충 식염수(PBS)10에 200마리의 생존 가능한 3기 N. brasiliensis 유충(L3)을 각 마우스에 피하 접종하거나, 대조군으로 PBS 단독으로 100μL를 주사합니다. 감염 후 4일째, 7일째 또는 10일째에 동물을 희생합니다.</li>
</ol>3. 폐, 소장, 종격동 및 장간막 림프절의 분리
<ol><li>자궁 경부 탈구로 마우스를 안락사시킵니다. 마우스를 등에 대고 70% 에탄올을 뿌립니다. 가위로 정중선을 절개하고 피부를 열어 복부와 흉부 부위를 노출시킵니다. 참고: 이소플루란은 대체 안락사 방법으로 사용할 수 있습니다12. 이산화탄소 챔버는CO2 가 폐 조직 손상과 출혈을 유발하므로 권장하지 않는다13.</li>
	<li>종격동 림프절과 폐의 분리<ol><li>흉골을 절개하고 "V"자 모양으로 잘라 갈비뼈와 흉부 근육을 제거합니다. 흉강이 노출되면 심장 아래 식도 옆에 있는 종격동 림프절을 찾습니다( 보충 그림 1 참조).</li>
		<li>종격동 림프절을 추출하여 12웰 배양 플레이트의 R-10 배지(표 1) 1mL에 수집합니다. 처리 될 때까지 빛으로부터 보호 된 얼음 위에 보관하십시오. 참고: 샘플은 이 실험에 사용된 리포터 마우스의 형광 신호가 감소하지 않도록 빛으로부터 보호되어야 합니다.</li>
		<li>폐를 추출하고 마우스당 12웰 배양 플레이트의 R-10 배지 1mL에 수집합니다. 처리 될 때까지 빛으로부터 보호 된 얼음 위에 보관하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>장간막 림프절 사슬과 소장의 분리<ol><li>복강을 노출시키고 소장을 오른쪽으로 조심스럽게 움직여 결장을 따라 장간막 림프절(MLN) 사슬을 노출시킵니다.</li>
		<li>집게를 사용하여 MLN을 제거하고 종이 타월로 부드럽게 굴려서 지방을 빼냅니다.</li>
		<li>MLN을 12-웰 배양 플레이트에서 1mL의 R-10 배지로 옮깁니다. 처리 될 때까지 빛으로부터 보호 된 얼음 위에 보관하십시오.</li>
		<li>유문 괄약근 바로 아래와 맹장 위의 소장을 자릅니다. 집게를 사용하여 장을 천천히 당겨 부착 된 장간막과 지방 조직을 제거하십시오.</li>
		<li>소장을 종이 타월에 놓고 PBS로 충분히 적시십시오. 가위로 소장에서 Peyer의 패치를 제거하십시오. 알림: 생존력을 유지하려면 남은 지방 조직을 제거하고 전체 과정에서 PBS로 소장을 촉촉하게 유지하십시오.</li>
		<li>가위를 사용하여 소장을 세로로 자르고 집게를 열린 장 위로 부드럽게 밀어 배설물과 점액을 제거합니다.</li>
		<li>겸자로 소장을 잡고 얼음 위에 PBS 5mL로 몇 번 조심스럽게 담그고 씻습니다. 두 번 반복하십시오.</li>
		<li>소장을 짧은 조각(약 5mm)으로 자르고 2% FBS가 포함된 10mL의 HBSS14 가 있는 50mL 원뿔형 튜브에 수집합니다(표 1). 즉시 상피내 및 고유판 세포를 계속 분리하십시오.</li>
	</ol></li>
</ol>4. 소장, 폐 및 림프절에서 단세포 현탁액의 제조
참고: 소장에서 단세포 현탁액을 준비할 때 1인당 최대 6마리의 마우스를 처리하는 것이 매우 중요한데, 이는 처리 기간이 길어질수록 세포 생존력이 크게 감소하기 때문입니다. 이 방법은 Heligmosomoides polygyrus 감염 마우스 모델5에서 채택되었습니다.
<ol><li>진탕 배양기, R-20 배지, HBSS, 및 HBSS-2 mM EDTA(표 1)를 37°C에서 예열하였다.</li>
	<li>시료당 10mL의 소장 소화 배지(표 1)를 준비합니다.</li>
	<li>3.3.8 단계의 내장 조각을 손으로 세게 흔듭니다.</li>
	<li>유리 깔때기 위의 나일론 메쉬(약 10cm x 10cm)를 통해 각 샘플을 여과합니다. 메쉬 위에 예열된 HBSS 10mL를 추가하여 샘플을 세척하고 플로우 스루를 버립니다. 한 번 더 반복하십시오. 알림: 각 샘플에 새 메쉬를 사용하고 절차 전반에 걸쳐 재사용하십시오.</li>
	<li>깔때기에서 메쉬를 제거하고 50mL의 따뜻한 HBSS-10mM EDTA가 있는 2mL 원뿔형 튜브의 메쉬에서 샘플을 수집합니다(4.1단계). 37°C에서 10분 동안 인큐베이션하고 200rpm으로 진탕합니다.</li>
	<li>최대 속도(3,200rpm)로 10초 동안 소용돌이치고 유리 깔때기 위에 메쉬로 샘플을 여과하여 50mL 원뿔형 튜브에서 유동을 회수합니다.</li>
	<li>4.5단계와 4.6단계를 두 번 반복하여 동일한 50mL 원뿔형 튜브에서 플로우 스루를 회수합니다. 상피내 세포는 이 30mL 분획에 있습니다. 나머지 조직을 저장하십시오.</li>
	<li>상피내 세포로부터의 단세포 현탁액 제제<ol><li>4.7단계에서 회수한 30mL의 세포 현탁액을 실온(RT)에서 5분 동안 450 x g 에서 원심분리합니다. 상청액을 버리십시오.</li>
		<li>5mL의 PBS를 첨가하고 RT에서 5분 동안 450 x g 에서 원심분리합니다.</li>
		<li>세포 펠릿을 RPMI 10% FBS-20μg/mL DNase 3mL에 재현탁합니다(표 1). 세포가 염색 될 때까지 빛으로부터 보호 된 얼음 위에 보관하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>고유판 세포로부터의 단일 세포 현탁액 제조<ol><li>깔때기 위의 메쉬를 통해 따뜻한 HBSS 10mL 이상을 부어 4.7단계에서 남은 소장 조직을 세척합니다. 세탁을 반복하십시오. 10mL의 소장 소화 배지가 있는 50mL 원뿔형 튜브의 메쉬에서 조직을 수집합니다.</li>
		<li>37°C에서 30분 동안 인큐베이션하고 200rpm으로 진탕합니다. 5분마다 최대 속도로 10초 동안 소용돌이칩니다.</li>
		<li>10mL의 FACS-EDTA 완충액(표 1)을 첨가하여 소화 반응을 중지하고 얼음 위에 올려 놓는다.</li>
		<li>혈청학적 피펫을 사용하여 100μm 세포 여과기를 통해 각 샘플을 여과하고 얼음 위에 놓인 50mL 원뿔형 튜브에서 현탁액을 회수합니다.</li>
		<li>4 °C에서 600 x g 로 6분 동안 원심분리합니다.</li>
		<li>상청액을 버리십시오. 세포 펠릿을 5 mL의 PBS로 세척하고, 4°C에서 6분 동안 600 x g 에서 원심분리하였다.</li>
		<li>상층액을 버리고 세포 펠릿을 RPMI 10% FBS-20μg/mL DNase 1mL에 재현탁합니다. 세포가 염색 될 때까지 빛으로부터 보호 된 얼음 위에 보관하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>폐에서 단일 세포 현탁액 준비 참고: 각 폐와 소장은 세포 생존율이 낮은 취급 시간이 연장되는 것을 방지하기 위해 두 사람이 병렬로 처리해야 합니다.<ol><li>처리된 샘플당 4mL의 폐 소화 배지(표 1)를 준비합니다.</li>
		<li>단계 3.2.3에서 폐를 함유하는 웰로부터 RPMI 배지를 제거한다. 가는 가위로 폐를 작은 조각으로 자릅니다.</li>
		<li>주걱을 사용하여 폐 조각을 15mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 4mL의 폐 소화 배지를 추가합니다(표 1).</li>
		<li>37°C에서 30분 동안 인큐베이션하고 250rpm에서 진탕합니다. 완료되면 각 샘플이 처리될 때까지 얼음에 보관하십시오.</li>
		<li>6웰 배양 플레이트의 단일 웰에 위치한 100μm 세포 여과기를 통해 각 샘플을 여과합니다. 주사기 플런저로 조직을 분리하십시오.</li>
		<li>각 샘플을 15mL 원뿔형 튜브에서 회수하고 4mL의 R-2 배지를 추가합니다(표 1). 다른 샘플이 처리되는 동안 얼음 위에 보관하십시오.</li>
		<li>4 °C에서 5분 동안 600 x g 로 원심분리합니다. 상층액을 버리고 세포 펠릿을 1mL의 R-5 배지에 재현탁합니다(표 1).</li>
		<li>원심분리하는 동안, 조혈 세포 분획15,16을 농축하기 위해 시료 당 4 mL의 27.5% 밀도-구배 용액(표 1)을 준비한다. 단세포 분리를 위한 이러한 전략은 다른 유사한 밀도 구배 배지에 비해 더 효율적이고 비용 효율적이며 독성이 적다(17).</li>
		<li>4.10.7 단계의 세포 현탁액 1 mL에 27.5 % 밀도 구배 용액 4 mL를 넣고 세게 흔든다.</li>
		<li>혼합 현탁액 위에 R-5 배지 (표 1)를 천천히 추가하여 두 개의 상을 만듭니다.</li>
		<li>RT에서 1,500 x g 에서 20분 동안 원심분리기를 사용하고 가속을 낮추고 브레이크를 끕니다. 두 위상 사이에 형성된 고리를 관찰하십시오.</li>
		<li>1mL 마이크로피펫으로 두 상 사이에 형성된 링을 회수하고 4mL의 R-2 배지에 재현탁합니다.</li>
		<li>4 °C에서 5분 동안 450 x g 로 원심분리합니다. 상청액을 버리십시오. 세포 펠릿을 1mL의 ACK 완충액에 재현탁하고(표 1), RT에서 1분 동안 인큐베이션합니다.</li>
		<li>4 mL의 R-5 배지를 첨가하고 4 °C에서 5 분 동안 450 x g 에서 원심 분리합니다. 상층액을 버리고 세포 펠릿을 1mL의 R-10 배지에 재현탁합니다. 유세포 분석을 위해 염색될 때까지 빛으로부터 보호되는 얼음 위에 보관하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>림프절에서 단일 세포 현탁액 준비<ol><li>3.2.2 또는 3.3.3 단계의 림프절을 6-웰 배양 플레이트의 웰에 있는 두 개의 메쉬 조각 사이에 놓고 주사기 플런저로 해리합니다.</li>
		<li>세포 현탁액을 1.5 mL 원뿔형 튜브에서 회수하고, 4°C에서 5분 동안 450 x g 에서 원심분리하였다.</li>
		<li>상층액을 버리고 세포 펠릿을 R-10 배지 1mL에 재현탁합니다. 유세포 분석을 위해 염색될 때까지 빛으로부터 보호되는 얼음 위에 보관하십시오. 알림: 덩어리가 보이면 s를 걸러냅니다.amp100μm 셀 스트레이너를 통해 s.</li>
	</ol></li>
</ol>5. 유세포 분석을 위한 세포 염색(그림 2 및 그림 3)
참고: 4°C에서 5분 동안 450 x g 에서 단계 4.11.3의 림프절 세포 현탁액을 원심분리하고, 세포 펠릿을 500 μL의 FACS 완충액에 재현탁시킨다(표 1).
<ol><li>ILC2s 식별을 위한 세포 염색(그림 3 및 보충 그림 2) 참고: 이 염색 절차는 IL-9 발현 ILC2 세포의 식별에 특이적입니다.<ol><li>플레이트 4.10.14 단계로부터의 폐 샘플 당 150 μL (대략 1.8 x 10 6 세포) 및 단계 4.11.3으로부터의 림프절 샘플 당 50 μL (종격동 및 장간막 림프절 샘플에 대해 각각 대략 0.7 x 10 6 및 2.2 x 106 세포) 96 웰 원뿔형 바닥 배양 플레이트에서. 100 μL의 FACS 완충액을 첨가하고, 4°C에서 5분 동안 450 x g에서 원심분리한다.</li>
		<li>96웰 원뿔형 바닥 배양 플레이트에서 4.8.3 및 4.9.7 단계로부터의 소장 샘플(상피내 및 고유판 샘플의 경우 각각 약 2.7 x 10 6 및0.6 x 106 세포)당 100 μL를 플레이트에 넣는다. 150 μL의 FACS 완충액을 첨가하고 4°C에서 5분 동안 450 x g 에서 원심분리합니다.</li>
		<li>상청액을 버리고, FACS 완충액에 희석된 비오티닐화 항체 칵테일(표 2)의 50 μL에 각각의 세포 펠렛을 재현탁시켰다. 빛으로부터 보호되는 4°C에서 30분 동안 배양한다. 참고: 상피내 및 고유판에 대해 20μg/mL DNase와 함께 FACS 버퍼를 사용하십시오.amp르.</li>
		<li>150 μL의 FACS 버퍼를 추가합니다. 4 °C에서 5분 동안 450 x g 로 원심분리합니다.</li>
		<li>상청액을 버리고, 세포 펠릿을 200 μL의 FACS 완충액에 재현탁시킨다. 다시 원심분리하고 상층액을 버립니다.</li>
		<li>세포 펠릿을 항체/염색 칵테일 50μL에 재현탁하고(표 2), 빛으로부터 보호되는 4°C에서 30분 동안 배양합니다.</li>
		<li>150 μL의 FACS 버퍼를 추가합니다. 4 °C에서 5분 동안 450 x g 로 원심분리합니다.</li>
		<li>상청액을 버리고, 세포 펠릿을 200 μL의 FACS 완충액에 재현탁시킨다. 다시 원심분리하고 상층액을 버립니다. 세척 (5.1.7 단계)을 반복하고 상청액을 버립니다.</li>
		<li>300 μL의 FACS 완충액에 세포 펠릿을 재현탁하고, 유세포 분석에 의해 분석한다.</li>
		<li>소장 및 폐 샘플의 경우 림프구, 단일 세포, 살아있는 세포, 조혈 세포, CD90+계통 세포, ST2+ 세포 및 IL-9+ 세포와 같은 게이팅 전략을 사용합니다(그림 3A, B 및 보충 그림 2A). 림프절 샘플의 경우 살아있는 세포, 단일 세포, CD90+ 계통 세포, ST2+ 세포 및 IL-9+ 세포와 같은 게이팅 전략을 사용합니다(보충 그림 2B, C).</li>
	</ol></li>
	<li>IL-9 생성 림프구의 동정을 위한 세포 염색(그림 2 및 보충 그림 3)<ol><li>폐 샘플당 800μL를 4.10.14단계에서 1.5mL 튜브(약 14.6 x 106 세포)로 옮깁니다. 4 °C에서 5분 동안 450 x g 로 원심분리합니다. 상청액을 버리십시오.</li>
		<li>림프절 샘플의 경우, 400 μL의 세포 현탁액을 단계 4.11.3 (종격동 및 장간막 림프절 샘플에 대해 각각 대략 5.6 x 106 및 17.5 x 10 6 세포)을 96-웰 원뿔형 바닥 플레이트에 2단계로 플레이트한다.<ol><li>먼저 200 μL를 옮기고, 4°C에서 5분 동안 450 x g 에서 원심분리하고, 상청액을 버린다.</li>
			<li>또 다른 200 μL를 해당 웰로 옮깁니다. 4°C에서 5분 동안 450 x g 로 원심분리하고, 상청액을 버린다.</li>
		</ol></li>
		<li>세포 펠릿을 항체/염색 칵테일 50-400μL에 재현탁하고(표 3), 빛으로부터 보호된 4°C에서 30분 동안 배양합니다. 참고: 폐 샘플은 400μL, 종격동 림프절 샘플은 50μL, 장간막 림프절 샘플은 염색 칵테일 100μL에 재현탁해야 합니다.</li>
		<li>150 μL의 FACS 완충액을 종격동 림프절 샘플에 추가하고 100 μL의 장간막 림프절 샘플을 추가합니다. 4°C에서 5분 동안 450 x g 로 원심분리하고, 상청액을 버린다.</li>
		<li>펠릿을 각각 1 mL 및 200 μL의 FACS 완충액에 재현탁하여 폐 및 림프절 샘플을 세척한다. 4 °C에서 5분 동안 450 xg 로 원심분리합니다. 상청액을 버리고 세척을 반복하십시오.</li>
		<li>폐 샘플을 600μL의 FACS 완충액에 재현탁하고 유세포 분석으로 분석합니다. 림프구, 단세포, 살아있는 세포, 조혈 세포, CD4+TCRβ+ 세포 및 IL-9+ 세포와 같은 게이팅 전략을 사용합니다(그림 2A).</li>
		<li>림프절 샘플을 300μL의 FACS 완충액에 재현탁하고 유세포 분석으로 분석합니다. 림프구, 단일 세포, 살아있는 세포, CD4+ TCRβ+ 세포 및 IL-9+ 세포와 같은 게이팅 전략을 사용합니다(그림 2B 및 보충 그림 3A).</li>
	</ol></li>
</ol>6. 단세포 현탁액에서 세포의 절대 수 측정
<ol><li>4.8.3, 4.9.7, 4.10.14 및 4.11.3 분리 단계의 샘플을 PBS로 1:20 비율로 희석합니다(샘플 10μL + PBS 190μL).</li>
	<li>6.1단계에서 희석된 각 샘플 10μL를 트리판 블루 10μL와 혼합합니다. 혈구계에 10 μL를 넣고 각 희석을 고려하여 살아있는 세포를 계수합니다.</li>
	<li>유세포 분석에 의해 결정된 살아있는 세포(생존율 염료 음성 세포)로부터 관심 대상 집단의 백분율에 분리 후 단세포 현탁액의 총 살아있는 세포 수를 곱하고, 이 수를 100으로 나누어 세포의 절대 개수를 구한다(보충도 4, 보충도 5 및 보충도 6). 절대 수 = (유세포 분석에 의해 결정된 살아있는 세포에서 관심 모집단의 백분율 x 단일 세포 현탁액의 총 살아있는 세포 수)/100</li>
</ol>

<ol>
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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-33+induces+the+enzyme+Tryptophan+hydroxylase+1+to+promote+inflammatory+group+2+innate+lymphoid+cell-mediated+immunity.">Interleukin-33 induces the enzyme Tryptophan hydroxylase 1 to promote inflammatory group 2 innate lymphoid cell-mediated immunity.</a> Immunity. 52 (4), 606-619 (2020).</li><li>Olgu&#237;n-Mart&#237;nez, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-33+and+the+PKA+pathway+regulate+ILC2+populations+expressing+IL-9+and+ST2.">IL-33 and the PKA pathway regulate ILC2 populations expressing IL-9 and ST2.</a> Frontiers in Immunology. 13, 787713 (2022).</li><li>Olguin-Martinez, E., Ruiz-Medina, B. E., Licona-Limon, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+molecular+markers+and+heterogeneity+in+type+2+innate+lymphoid+cells.">Tissue-specific molecular markers and heterogeneity in type 2 innate lymphoid cells.</a> Frontiers in Immunology. 12, 757967 (2021).</li><li>Noelle, R. J., Nowark, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+sources+and+immune+functions+of+interleukin-9.">Cellular sources and immune functions of interleukin-9.</a> Nature Reviews. Immunology. 10 (10), 683-687 (2010).</li></ol>

저자는 공개 할 것이 없습니다.

장내 기생충-숙주 상호 작용 및 기생충 감염에 대한 면역 반응에 대한 완전한 이해는 조직 리모델링 및 벌레 퇴학 유도에 핵심적인 다양한 세포 집단 및 이펙터 분자의 식별 및 분석이 필요합니다. 토양 매개 기생충 감염은 전 세계 개발 도상국에서 큰 문제입니다. 그러나 최근까지 이 감염의 영향을 받는 주요 기관인 소장에 존재하는 희귀 세포 집단을 분석할 수 있는 프로토콜은 사용할 수 없었습니다5. 이 프로토콜은 N. brasiliensis 감염 동안 폐, 종격동 및 장간막 림프절에서 IL-9 발현 림프 세포의 유세포 분석을 허용하는 이전에 설명한 방법을 다루며, 소장에서 처음으로 이 집단을 식별하는 추가 이점이 있습니다.
이 프로토콜의 성공 여부는 조직 처리 시간에 크게 좌우됩니다. 한 사람당 최대 6 개의 소장 샘플을 한 번에 처리하는 것이 필수적입니다. 다른 장기를 처리해야 하는 경우 다른 사람이 병행하여 처리하는 것이 좋습니다. 상대적으로 낮은 기생충 부하(200 L3 유충)를 사용함으로써 이 프로토콜은 N. brasiliensis에 감염된 장에서 림프 세포를 분리하는 동시에 이러한 세포를 다른 장기에서 분리하는 능력을 유지합니다. 더 높은 기생충 부하의 사용은 소장에서 분리된 세포의 질과 양을 위태롭게 합니다(데이터는 표시되지 않음). 그러나 다른 장기에서 IL-9 발현 림프 세포가 크게 증가할 수 있다4. 장과 장간막 림프절을 처리할 때 부착된 지방 조직을 제거하지 않으면 세포 사멸이 증가하기 때문에 제거하는 것이 중요합니다. 이 데이터는 자연적인 감염 과정이 소장에서 회수 된 림프 세포의 절대 수에 부정적인 영향을 미친다는 관찰을 뒷받침합니다. 여기에 설명된 연구에서 IL-9+ ILC2 세포의 빈도는 일정하게 유지되는 반면 절대 수치는 각 독립 실험에서 높은 변동성을 나타냅니다. 따라서 절대적인 숫자에서 도출된 결론은 부정확할 수 있으므로 피해야 합니다. 또한, 조직에서 IL-9 발현 T 세포의 빈도가 낮기 때문에 가능한 한 많은 수의 세포를 획득하고 염색하는 것이 좋습니다.
이 ILC2 분석의 한계는 이 모집단을 정의하기 위해 이산 마커 조합을 사용한다는 것입니다. 관심 조직 및 감염 단계에 따라, CD25, Klrg1 및 ST2와 같은 추가 마커를 ILC2 세포의 보다 상세한 표현형 특성화에 사용할 수 있다22. 우리는 여기에 제시된 프로토콜이 INFER 리포터 마우스 균주4를 기반으로 하며 IL-9 발현 세포의 식별에 이점을 나타낼 수 있음을 인정합니다. 그러나, 여기에서 발견된 결과는 다른 마우스 리포터 균주의 사용 및 세포내 IL-9 염색 6,7,8,9를 포함한 대체 전략을 사용하여 얻을 수 있을 것으로 기대합니다. 기존의 마우스를 사용하고 상피내 및 고유판 세포에서 IL-9의 세포내 염색을 수행하면 검출 가능한 신호가 손실되고 얻은 데이터가 손상될 수 있음을 언급하는 것이 중요합니다(보충 그림 7). 이는 이미 생체 외에서 분리 및 유지하기 어려운 하위 집합을 염색하는 데 필요한 장기적인 조작 때문일 수 있습니다. 따라서 처리 시간을 줄이고 생체 내에서 IL-9 발현의 신뢰할 수 있는 분석을 보장하기 위해 리포터 마우스 균주를 사용하는 것이 좋습니다. 우리는 또한 Th9 세포가 IL-923을 발현하는 유일한 T 세포가 아니라는 사실을 인정합니다. 그러나 이 기생 모델에서는 다른 하위 집합이 이를 표현할 것으로 기대하지 않습니다. 그럼에도 불구하고, 기술된 맥락에서 다른 IL-9-발현 하위세트의 존재를 버리기 위해, 전사 마커의 사용과 함께 제2형 사이토카인의 완전한 특성화가 가능하다.
감염 후 5일 이전에 IL-9 발현 림프 세포의 정량화가 이전에 보고되었습니다. 그러나 셀 주파수가 매우 낮아집니다4. 이 연구의 프로토콜은 기생충 제거가 시작될 때까지 N. brasiliensis 감염 동역학의 상당 부분을 다룹니다2. 그러나 우리는 이 연구의 일부 세포 집단이 분석된 기간 내에 기저 수준으로 돌아가지 않았다는 것을 알아차렸으며, 이는 연구가 생체 내 감염의 보다 발전된 단계에서 이러한 세포의 행동에 대한 완전한 관점을 갖기 위해 연장된 시점으로부터 이점을 얻을 수 있음을 시사합니다. 그럼에도 불구하고, 우리는 여기에 제시된 연구가 기생충 감염 모델에서 IL-9 발현 림프 세포를 연구하는 데 관심이 있는 연구자들을 위한 참조 가이드 역할을 할 수 있으며, 이를 통해 관심 조직에서 특정 세포 유형을 검출하기 위한 이상적인 감염 단계를 선택할 수 있다고 믿습니다. 전체적으로, 여기에 설명된 방법은 생리학적으로 관련된 기생충 감염 모델 동안 IL-9를 발현하는 T 림프구 및 ILC2 세포의 표현형 및 기능을 평가하고, 이러한 세포에 대한 지식을 넓히고, 잠재적으로 다른 병리학적 조건에서 이들에 대한 이해를 향상시키는 데 유용할 것입니다.

십이지장충은 전 세계적으로 약 7억 명의 사람들을 감염시키는 장내 기생충으로, 주로 저개발국의 열대 지역에서 발생합니다. 인간에게 가장 흔한 십이지장충 기생충인 십이지장 충 및 Necator americanus에 의한 고강도 감염은 빈혈과 단백질 결핍을 유발하여 성장과 정신 발달을 지연시킬 수 있습니다1. N. americanus 와 설치류 기생충 Nippostrongylus brasiliensis 는 숙주에서 원형의 제2형 면역 반응을 유도하고 수명 주기에서 유사성을 공유합니다. 따라서 N. brasiliensis 에 의한 생쥐의 감염은 인간 십이지장충 감염에 가장 일반적으로 사용되는 모델입니다. 3 단계 (L3) N. brasiliensis 감염성 유충은 감염 후 처음 몇 시간 동안 피부에서 폐로 이동합니다. 일단 폐에 들어가면 L4가 되어 기관을 따라 이동하여 삼키고 위를 통과하여 장에 도달하여 4-5일 이내에 성인(L5)이 됩니다. 장에서 L5 벌레는 기생충 수명 주기2를 다시 시작하기 위해 대변으로 배설되는 알을 낳습니다.
N. brasiliensis에 의해 유도된 면역 반응은 호산구 증가증, 호염구증, 잔 및 비만 세포 증식증과 함께 IL-4, IL-5, IL-9, IL-10 및 IL-13을 포함한 여러 제2형 사이토카인의 증가, IgG1 및 IgE 생산 증가를 특징으로 합니다. N. brasiliensis 감염에 대한 면역 반응을 확인하고 정의하려는 대부분의 연구는 이 모델3에서 IL-4 또는 IL-13의 역할에 중점을 두고 있습니다. 그러나 IL-9 발현 세포의 식별 및 특성화와 이 사이토카인의 기능은 Licona-Limón et al. N. brasiliensis에 대한 면역 반응에서 IL-9의 중요한 역할을 입증하는 첫 번째 연구를 발표했습니다. 이 연구는 리포터 마우스를 사용하여 T 세포(대부분 T 헬퍼 9)와 제2형 선천성 림프 세포(ILC2s)를 감염 시 IL-9를 발현하는 주요 세포 하위 집합으로 설명했습니다4.
기생충에 감염된 폐에서 면역 세포의 분리 및 특성화가 가능하며 광범위하게 보고되었습니다 3,4. 그러나 내재된 조직 리모델링 및 점액 생성으로 인해 감염된 장에서 그렇게 하는 것은 Ferrer-Font et al.5의 최근 발표까지 기술적인 도전으로 판명되었습니다. 이 그룹은 Heligmosomoides polygyrus에 감염된 쥐 내장에서 면역 하위 집합의 단일 세포 현탁액을 분리하고 분석하는 프로토콜을 설명했습니다. 이를 기반으로 우리는 이제 N. brasiliensis에 감염된 장에서 IL-9 발현 림프 세포의 분리 및 세포 분석을 위한 프로토콜을 표준화했습니다. 또한, 우리는 감염 전반에 걸쳐 다양한 세포 소스와 해부학적 위치에서 IL-9 동역학을 확립했습니다.
이 감염과 관련된 뚜렷한 세포 집단을 특성화하는 것은 기생충에 대한 면역 반응과 숙주와의 상호 작용에 대한 더 넓은 이해에 매우 중요합니다. 이 포괄적인 프로토콜은 관심 질병 단계에서 원하는 기관에서 IL-9 생성 세포를 분리하고 분석하는 명확한 경로를 제공하여 N. brasiliensis 감염 및 일반적으로 기생충 감염에서 이러한 세포의 역할에 대한 지식을 급격히 향상시킬 수 있습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ACK buffer</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attune Nxt cytometer</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B220</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11c&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>117304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD19&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>115504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4 (BV421)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45.2</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>109846</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD90.2</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>105314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase D</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11088866001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse I</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18068015</td>
			<td>Specific activity: &#8805;10 000 units/mg&#160;&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Facs ARIA II sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Melody cell sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc-Block</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc&#949;RI</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13589885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26140079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo</td>
			<td>FlowJo</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometry analysis data software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gr-1</td>
			<td>Tonbo</td>
			<td>305931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-9</td>
			<td>biolegend</td>
			<td>514103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NK1.1&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>108704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon mesh</td>
			<td>&#160;&#8206; lba</td>
			<td>B07HYHHX5V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPrep Density Gradient Medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline&#160;</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Siglec F&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>155512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>405206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCR-&#946;&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>109203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCR-&#946; (PE/Cy7)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>109222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCR-&#947;&#948;&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>118103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ter119</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>116204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricine buffer&#160;</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zombie Aqua Fixable Viability Dye</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>423101</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a strategy for the study of il-9-producing lymphoid cells in the nippostrongylus brasiliensis infection model

IL-9는 항 종양 면역, 알레르기 병리의 유도 및 기생충 감염에 대한 면역 반응을 포함한 다양한 과정과 관련된 다면발현 사이토 카인으로 기생충 퇴학에 중요한 역할을합니다. Nippostrongylus brasiliensis 감염의 쥐 모델에서 IL-9는 주로 폐, 소장 및 배액 림프절에서 발견되는 CD4+ T 림프구 및 선천성 림프 세포에 의해 생성됩니다. IL-9의 세포내 염색과 관련된 기술적 어려움과 감염 시 소장에서 조혈 세포를 분리하는 복잡성을 감안할 때, 이 모델의 다양한 림프 및 비림프 조직에서 IL-9의 발현을 분석하기 위한 포괄적이지만 간단한 프로토콜이 절실히 필요합니다. 여기에 설명된 프로토콜은 감염 전반에 걸쳐 종격동 및 장간막 림프절뿐만 아니라 N. brasiliensis가 표적으로 하는 주요 기관인 폐 및 소장에서 CD4+ T 세포와 선천성 림프 세포에 의해 생성되는 IL-9의 동역학을 설명합니다. 또한 관심 있는 세포 유형과 기관에 따라 감염에 필요한 유충의 수를 자세히 설명합니다. 이 프로토콜은 N. brasiliensis 감염 모델에서 관심 있는 특정 세포, 기관 및 질병 단계에 집중할 수 있는 기회를 제공함으로써 시간과 자원을 절약하기 위한 분석의 표준화를 지원하는 것을 목표로 합니다.

마우스에 200 L3 단계 N. brasiliensis 유충 또는 가짜 대조군을 위한 PBS를 피하 주사했습니다. 이 프로토콜에 사용된 유충의 수는 림프 조직과 폐의 세포를 검출하는 데 더 많은 양의 벌레가 사용된 이전 보고서와 달리 폐, 림프 조직 및 소장에서 생존 가능한 세포를 분리하기 위해 조정되었습니다. 폐, 종격동 림프절, 장간막 림프절 및 소장을 감염 후 0, 4, 7 및 10일에 채취하여 림프구 분리 및 IL-9 생산 집단의 특성화를 수행했습니다. 총 27마리의 마우스를 분석된 시점 당 9개의 대조군 및 4 내지 6개의 N. 브라질리엔시스-감염된 마우스를 포함하는 2개 이상의 독립적인 실험에 사용하였다. 가짜 감염 대조군은 기저 수를 얻기 위해 모든 실험에 포함되었습니다. 이 프로토콜을 사용하여 IL-9 생성 CD4+ T 세포(이 모델의 대부분 Th9 세포)를 정량화 및 추가 분석을 위해 폐, 장간막 및 종격동 림프절에서 분리할 수 있습니다.
자연적인 감염 과정에 따라 먼저 폐와 종격동 림프절에 존재하는 IL-9 생성 CD4+ T 림프구(Th9)의 빈도를 평가했습니다(게이팅 전략은 그림 2A 및 보충 그림 3A에 표시됨). 두 기관 모두에서 Th9 빈도는 4일째부터 증가하여 감염 후 7일째에 정점에 도달했으며(그림 2C), Th9 절대수에서도 관찰된 증가입니다(보충 그림 4A,B). 장간막 림프절(게이팅 전략)에서 감염 후 7일과 10일에 Th9 세포의 빈도와 절대 수가 크게 증가했습니다(그림 2C 및 보충 그림 4C), 이전 보고서4에 따라. T 세포 및 ILC2s의 존재는 상피내 및 고유판 샘플에서 확인되었습니다. 그러나 감염 기간 동안 이러한 장 구획에서 Th9 세포가 관찰되지 않았습니다(보충 그림 3B, C).
그런 다음 감염된 마우스의 림프 및 비림프 조직에서 IL-9 발현 ILC2 세포를 평가했습니다(게이팅 전략은 그림 3A, B 및 보충 그림 2에 표시됨). 감염 후 7일째에 폐에서 ILC2s를 발현하는 ST2+ IL-9- 및 ST2+ IL-9+의 빈도가 크게 증가하는 것을 관찰했습니다(그림 3C). 동시에, 절대 수치를 분석한 결과, 감염 후 7일째에 ST2+ IL-9+ 개체군에서만 통계적으로 유의미한 증가가 나타났습니다(보충 그림 5A). 종격동 림프절( 보충 그림 2B에 나타난 게이팅 전략)에서 IL-9 발현 ILC2 세포(ST2+ IL-9+)의 수는 감염 후 10일째에 유의하게 증가한 반면, ST2+ 세포의 절대 수는 감염 후 7일째부터 시작하여 감염 후 10일째까지 증가하는 경향을 보였습니다(보충 그림 6A, C).
IL-9+ ILC2 세포는 또한 소장의 고유판 및 상피내 구획에서 발견되었습니다(게이팅 전략은 그림 3B 및 보충 그림 2A에 표시됨). N. brasiliensis 감염은 고유판에서 4일째에 ST2+ IL-9+ 세포의 빈도를 통계적으로 유의하게 증가시켰고, 고유판에서 7일째 및 10일째에 ST2-IL-9+ 개체군을 초래했습니다. 상피내 구획에서, 감염 후 각각 7일째 및 10일째에 ST2+ IL9+ 및 ST2-IL-9+ 세포의 빈도에서도 유의한 변화가 관찰되었다(도 3C). 중요한 것은 상대적으로 적은 수의 유충 부하에도 불구하고 기생충 감염은 소장에 광범위한 손상을 일으켰다는 것입니다. 따라서 IL-9 발현 ILC2s 절대 수의 분석은 기술적으로 불가능하며 살아있는 세포의 낮은 수율로 인해 이 집단의 정확한 정량화를 방해합니다(보충 그림 5B, C). 한편, 장간막 림프절의 분석(보충 그림 2C에 표시된 게이팅 전략)은 감염 후 10일째에 ST2+ IL-9-, ST2+ IL-9+ 및 ST2-IL-9+ ILC2 세포의 절대 수가 유의하게 증가한 것으로 나타났으며(보충 그림 6D), 이전에 보고된 바와 같이 4. 한편, 감염 전반에 걸쳐 이들 집단의 빈도에는 차이가 관찰되지 않았습니다(보충 그림 6B). ST2 및 IL-9 발현 세포의 이러한 다양한 하위 집합은 생체 내에서 잠재적으로 차별적인 역할을 하는 흥미로운 집단이며, 최근에 기술된 바와 같이 자연 ILC2 대 염증성 ILC2에 해당할 수 있다 18,19,20,21. 그러나 이것은 향후 연구에서 다루어져야 합니다.
요약하면, 우리는 N. brasiliensis에 감염된 장에서 IL-9 발현 세포의 회수를 위해 이 프로토콜을 조정하면서 폐 및 림프 조직에서 여전히 검출할 수 있었습니다. 기생충에 감염된 내장에서 면역 세포를 회수하는 것은 기술적으로 어려운 것으로 입증되었습니다. 여기에서 감염에 사용된 유충의 수를 조정하면 장 조직 무결성이 개선되어 IL-9+ 개체군이 회복될 수 있었습니다. 우리가 아는 한, 이것은 N. brasiliensis 감염 동안 장에서 IL-9 발현 세포를 분석하기 위해 특별히 개발된 최초의 프로토콜입니다. 그럼에도 불구하고 다른 면역 세포도 이러한 단계에 따라 분리될 수 있습니다. 여기에 제시된 데이터는 소장에 상주하는 대부분의 조직 상주 IL-9 발현 세포가 ILC2임을 보여줍니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64075/64075fig01.jpg"> 그림 1: 설명된 프로토콜의 흐름도. 다른 기관을 처리하는 데 사용되는 주요 단계와 얻은 예상 IL-9 발현 세포 하위 집합이 포함된 개략도. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/64075/64075fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64075/64075fig02.jpg"> 그림 2: Th9 세포는 N. brasiliensis 감염 전반에 걸쳐 폐, 종격동 및 장간막 림프절에서 발견됩니다. (A) 폐 및 (B) 장간막 림프절에서 Th9 세포 식별에 사용되는 대표적인 유세포 분석 및 게이팅 전략. 각 장기의 단일 세포 현탁액을 고정 가능한 생존 염료, 조혈 세포 식별을 위한 형광 표지 항-CD45, CD4+ T 림프구 식별을 위한 항-T 세포 수용체(TCR) β 및 항-CD4로 염색했습니다. GFP+ 신호는 존재하는 Th9 세포의 백분율을 나타냅니다. 첫 번째 게이트는 림프 세포의 고전적인 형태와 함께 측면 산란(SSC)-A/전방 산란(FSC)-A 특성을 보여줍니다. 단일 세포 이벤트를 선택한 다음 살아있는 세포와 CD45+ 세포를 선택했습니다. 이 집단 내에서 우리는 TCR-β 및 CD4 이중 양성 세포에 초점을 맞추었고, 이로부터 GFP+ 세포가 Th9 세포로 확인되었습니다. 림프절의 염색은 항-CD45 항체를 포함하지 않았는데, 이는 전체 집단이 양성일 것으로 예상되기 때문이다. (C) 감염 후 표시된 시간에 폐, 종격동 및 장간막 림프절에서 발견되는 Th9 세포의 빈도. 데이터는 3개의 독립적인 실험으로부터 그룹당 분석된 1개 또는 2개의 마우스의 평균 ± SEM을 시점별로 나타내고; 짝을 이루지 않은 T-검정; *p≤ 0.05, **p≤ 0.001, ***p≤ 0.0001입니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/64075/64075fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64075/64075fig03.jpg"> 그림 3: IL-9 생성 ILC2 세포는 비림프성 기관에서 발견됩니다. (A) 폐 및 (B) 소장 고유판에서 IL-9+ ILC2 세포를 식별하는 데 사용되는 대표적인 유세포 분석 및 게이팅 전략. 각 기관의 단일 세포 현탁액을 비오티닐화 항체로 표시하여 계통 세포(항-B220, 항-CD11b, 항-FcεRI, 항-TCR-β, 항-TCR-γδ, 항-Siglec F, 항-CD4, 항-CD11c, 항-Gr-1, 항-CD8, 항-CD19, 항-NK1.1 및 항-Ter119) 및 Fc-블록. 이어서, 세포 현탁액을 고정성 생존도 염료, 형광색소 표지된 스트렙타비딘, 조혈 세포의 식별을 위한 항-CD45 및 ILC2 세포의 식별을 위한 항-CD90으로 염색하였다. 첫 번째 게이트는 림프 세포의 고전적인 형태와 함께 산란(SSC)-A/측면 산란(FSC)-A 특성을 보여줍니다. 단일 세포 이벤트를 선택한 다음 살아있는 세포와 CD45+ 세포를 선택했습니다. 이 집단 내에서 우리는 CD90+ lin- 세포에 초점을 맞췄습니다. 이 그룹에서 ST2 및 GFP 발현을 평가하여 IL-9+ ILC2 세포를 확인했습니다. (C) 감염 후 표시된 시점에서 폐, 고유판 및 상피내 세포 구획에서 발견되는 ILC2 세포의 빈도. 데이터는 3개의 독립적인 실험으로부터 그룹당 분석된 1개 또는 2개의 마우스의 평균 ± SEM을 시점별로 나타내고; 짝을 이루지 않은 T-검정; *p ≤ 0.05. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/64075/64075fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
표 1 : 화학 용액 및 그 조성 목록. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/64075/Table%201.xlsx" target="_blank">이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
표 2: IL-9 생성 ILC2 세포를 확인하기 위한 항체 칵테일. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/64075/Table%202%20final.xlsx" target="_blank">이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
표 3: IL-9-생성 T 림프구를 확인하기 위한 항체 칵테일. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/64075/Table%203%20final.xlsx" target="_blank">이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 그림 1: 종격동 림프절 위치의 개략도. 만든 BioRender.com <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/64075/Supplementary%20Figure%201.pdf" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 그림 2: 소장 및 림프절의 상피내 세포 내에서 IL-9+ ILC2를 식별하는 데 사용되는 대표적인 유세포 분석 및 게이팅 전략. (A) 소장 상피내 세포의 단세포 현탁액을 먼저 비오틴 표지 항체와 함께 배양하여 계통 세포(항-B220, 항-CD11b, 항-FcεRI, 항-TCR-β, 항-TCR-γδ, 항-Siglec F, 항-CD4, 항-CD11c, 항-Gr-1, 항-CD8, 항-CD19, 항-NK1.1 및 항-Ter119) 및 Fc-차단. 이어서, 고정 가능한 생존도 염료, 형광색소 표지 스트렙타비딘, 조혈 세포 식별을 위한 항-CD45 및 ILC2 세포 식별을 위한 항-CD90으로 염색했습니다. 첫 번째 게이트는 림프 세포의 고전적인 형태와 함께 측면 산란(SSC)-A/전방 산란(FSC)-A 특성을 보여줍니다. 단일 세포 이벤트를 선택한 다음 살아있는 세포와 CD45+ 세포를 선택했습니다. 이 집단 내에서 우리는 CD90+ lin- 세포에 초점을 맞췄습니다. 이 그룹에서 GFP+ 세포는 IL-9+ ILC2 세포로 확인되었습니다. (나,씨) IL-9+ ILC2 세포를 식별하기 위한 (B) 종격동 림프절 및 (C) 장간막 림프절에 대한 대표적인 유세포 분석 및 게이팅 전략. 림프절의 염색은 항-CD45 항체를 포함하지 않았는데, 이는 전체 집단이 양성일 것으로 예상되었기 때문이다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/64075/Supplementary%20Figure%202F.pdf" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 그림 3: 종격동 림프절 및 소장에서 Th9 세포를 식별하는 데 사용되는 대표적인 유세포 분석 및 게이팅 전략. (A) 종격동 림프절로부터의 단세포 현탁액을 고정 가능한 생존성 염료 및 형광 표지된 항-TCR-β 및 항-CD4 항체로 염색하였다. 첫 번째 게이트는 림프 세포의 고전적인 형태와 함께 측면 산란(SSC)-A/전방 산란(FSC)-A 특성을 보여줍니다. 단일 세포 이벤트를 선택한 다음 살아있는 세포와 TCR-β 및 CD4 이중 양성 세포를 선택했습니다. 이 그룹에서 GFP+ 세포는 Th9 세포로 확인되었습니다. CD45+ 세포가 살아있는 세포 다음에 선택되고 TCR-β 및 CD4 이중 양성 세포가 뒤따르는 것을 제외하고는 소장에서 (B) 고유판 및 (C) 상피내 세포에 대해 유사한 유세포 분석 전략이 사용되었으며, 여기서 GFP+ 세포는 Th9 세포로 식별되었습니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/64075/Supplementary%20Figure%203F.pdf" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 그림 4: Th9 세포의 절대 수는 감염 전반에 걸쳐 크게 변합니다. TCR-β 및 CD4 이중 양성 세포로부터의 IL-9+ 세포의 절대 수는 (A) 폐, (B) 종격동 림프절 및 (C) 장간막 림프절에서 감염 후 0, 4, 7 및 10일에 결정되었습니다. 데이터는 3개의 독립적인 실험으로부터 그룹당 분석된 1개 또는 2개의 마우스의 평균 ± SEM을 시점별로 나타내고; 짝을 이루지 않은 T-검정 *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.001, ***P ≤ 0.0001. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/64075/Supplementary%20Figure%204F.pdf" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 그림 5: IL-9+ ILC2 세포의 절대 수는 감염 전반에 걸쳐 다릅니다. 감염 후 0일, 4일, 7일 및 10일에 lin-CD90+ 집단에서 IL-9+ ILC2 세포의 절대 수를 (A) 폐, (B) 고유판 및 (C) 소장에서 상피내 세포에서 측정했습니다. 데이터는 3개의 독립적인 실험으로부터 그룹당 분석된 1개 또는 2개의 마우스의 평균 ± SEM을 시점별로 나타내고; 짝을 이루지 않은 T-검정 *p ≤ 0.05. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/64075/Supplementary%20Figure%205.pdf" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 그림 6: 림프절에서 IL-9+ ILC2 세포의 빈도 및 절대 수는 감염 동안 유의하게 증가합니다. (A) 종격동 림프절에서 IL-9+ ILC2 세포의 빈도 및 (C) 절대 수. (B) 장간막 림프절에서 IL-9+ ILC2 세포의 빈도 및 (D) 절대 수. 값은 감염 후 0일, 4일, 7일 및 10일에 lin-CD90+ 집단 내에서 IL-9+ ILC2 세포로 결정되었습니다. 데이터는 3개의 독립적인 실험에서 그룹당 분석된 1개 또는 2개의 마우스의 평균 SEM± 나타내며, 짝을 이루지 않은 T-검정 *p ≤ 0.05, ***p ≤ 0.0001입니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/64075/Supplementary%20Figure%206.pdf" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 그림 7: N. brasiliensis에 감염된 장에서 ILC2를 발현하는 IL-9 세포의 유세포 분석. 감염 후 7일째에 IL-9-리포터 마우스의 장에서 분리된 ILC2 세포의 대표적인 플롯. IL-9 발현은 감염된 리포터 마우스의 상피내 또는 고유판 구획으로부터 갓 분리된 ILC2 세포에서 이전에 기술된 IL-9 세포내 염색 프로토콜 9 (IL-9 AB, IL-9 항체 클론 RM9A4, BioLegend를 사용하여)에 따라 평가하였다. IL-9 발현 ILC2s를 확인하기 위해, 단일 세포 현탁액을 먼저 비오틴 표지 항체와 함께 배양하여 계통 세포(항-B220, 항-CD11b, 항-FcεRI, 항-TCR-β, 항-TCR-γδ, 항-Siglec F, 항-CD4, 항-CD11c, 항-Gr-1, 항-CD8, 항-CD19, 항-NK1.1 및 항-Ter119) 및 Fc-Block으로 염색한 다음, 유연한 생존도 염료, 형광색소 표지된 스트렙타비딘, 항-CD45 및 항-CD90으로 염색하였다. 플롯은 상피내(A,B) 및 고유판(C,D) 구획에 존재하는 lin-CD45+CD90+ 집단에서 게이트된 IL-9 발현 ILC2 세포를 보여주며, 새로 분리된 세포(A,C)의 리포터 신호를 통해 또는 IL-9의 세포내 염색(B,D). 대조군 마우스에 PBS를 주사하였다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/64075/Supplementary%20Figure%207.pdf" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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A Strategy for the Study of IL-9-Producing Lymphoid Cells in the Nippostrongylus brasiliensis Infection Model

IL-9 발현 T 및 ILC2 세포는 N. brasiliensis 감염 동안 유도되지만, 이들의 특성화는 낮은 빈도 및 차등 동역학으로 인해 감염된 장에서 크게 간과되었습니다. 이 프로토콜은 서로 다른 표적 기관에서 이러한 세포를 분리하고 서로 다른 감염 단계에서 유세포 분석을 통해 신원을 확인하는 방법을 설명합니다.

Nippostrongylus brasiliensis 감염 모델에서 IL-9 생성 림프 세포 연구를 위한 전략

IL-9 is a pleiotropic cytokine associated with various processes, including antitumor immunity, induction of allergic pathologies, and the immune response ...

a-strategy-for-study-il-9-producing-lymphoid-cells-nippostrongylus

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Strategy for the Study of IL-9-Producing Lymphoid Cells in the Nippostrongylus brasiliensis Infection Model

1.2K 조회수.  Universidad Nacional Autónoma de México. IL-9 발현 T 및 ILC2 세포는 N. brasiliensis 감염 동안 유도되지만, 이들의 특성화는 낮은 빈도 및 차등 동역학으로 인해 감염된 장에서 크게 간과되었습니다. 이 프로토콜은 서로 다른 표적 기관에서 이러한 세포를 분리하고 서로 다른 감염 단계에서 유세포 분석을 통해 신원을 확인하는 방법을 설명합니다.

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Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

세균성 접착 연구에 전단 응력을 소개합니다

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

연구

면역학 및 감염병학

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the simultaneous infection of the cell by a number of phages, one of two pathways is chosen: lytic (virulent) or lysogenic (dormant)3,4. We recently developed a method for fluorescently labeling individual phages, and were able to examine the post-infection decision in real-time under the microscope, at the level of individual phages and cells5. Here, we describe the full procedure for performing the infection experiments described in our earlier work5. This includes the creation of fluorescent phages, infection of the cells, imaging under the microscope and data analysis. The fluorescent phage is a "hybrid", co-expressing wild- type and YFP-fusion versions of the capsid gpD protein. A crude phage lysate is first obtained by inducing a lysogen of the gpD-EYFP (Enhanced Yellow Fluorescent Protein) phage, harboring a plasmid expressing wild type gpD. A series of purification steps are then performed, followed by DAPI-labeling and imaging under the microscope. This is done in order to verify the uniformity, DNA packaging efficiency, fluorescence signal and structural stability of the phage stock. The initial adsorption of phages to bacteria is performed on ice, then followed by a short incubation at 35&deg;C to trigger viral DNA injection6. The phage/bacteria mixture is then moved to the surface of a thin nutrient agar slab, covered with a coverslip and imaged under an epifluorescence microscope. The post-infection process is followed for 4 hr, at 10 min interval. Multiple stage positions are tracked such that ~100 cell infections can be traced in a single experiment. At each position and time point, images are acquired in the phase-contrast and red and green fluorescent channels. The phase-contrast image is used later for automated cell recognition while the fluorescent channels are used to characterize the infection outcome: production of new fluorescent phages (green) followed by cell lysis, or expression of lysogeny factors (red) followed by resumed cell growth and division. The acquired time-lapse movies are processed using a combination of manual and automated methods. Data analysis results in the identification of infection parameters for each infection event (e.g. number and positions of infecting phages) as well as infection outcome (lysis/lysogeny). Additional parameters can be extracted if desired.

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

This article describes the procedure for preparing a fluorescently-labeled version of bacteriophage lambda, infection of E. coli bacteria, following the infection outcome under the microscope, and analysis of infection results.

에 셀 운명을 따라<em&gt; E. 대장균</em&gt; 파지 람다에 의해 감염 후

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

Cutaneous Leishmaniasis in the Dorsal Skin of Hamsters: a Useful Model for the Screening of Antileishmanial Drugs

Traditionally, hamsters are experimentally inoculated in the snout or the footpad. However in these sites an ulcer not always occurs, measurement of lesion size is a hard procedure and animals show difficulty to eat, breathe and move because of the lesion. In order to optimize the hamster model for cutaneous leishmaniasis, young adult male and female golden hamsters (Mesocricetus auratus) were injected intradermally at the dorsal skin with 1 to 1.5 x l07 promastigotes of Leishmania species and progression of subsequent lesions were evaluated for up to 16 weeks post infection. The golden hamster was selected because it is considered the adequate bio-model to evaluate drugs against Leishmania as they are susceptible to infection by different species. Cutaneous infection of hamsters results in chronic but controlled lesions, and a clinical evolution with signs similar to those observed in humans. Therefore, the establishment of the extent of infection by measuring the size of the lesion according to the area of indurations and ulcers is feasible. This approach has proven its versatility and easy management during inoculation, follow up and characterization of typical lesions (ulcers), application of treatments through different ways and obtaining of clinical samples after different treatments. By using this method the quality of animal life regarding locomotion, search for food and water, play and social activities is also preserved.

Optimization of the experimental hamster model for cutaneous leishmaniasis by intradermal injection of Leishmania promastigotes at the dorsal skin. This approach is useful during inoculation, follow-up, characterization of lesions, application of treatments and obtaining of clinical samples. Locomotion, search for food and water, play and social activities are preserved.

햄스터의 지느러미 피부에 피부 Leishmaniasis : Antileishmanial 약물의 상영을위한 유용한 모델

Traditionally, hamsters are experimentally inoculated in the snout or the footpad. However in these sites an ulcer not always occurs, measurement of ...

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological deficiencies. GVHD is caused by mature alloreactive T cells present in the bone marrow graft that are infused into the recipient and cause damage to host organs. However, in mice, T cells must be added to the bone marrow inoculum to cause GVHD. Although extensive work has been done to characterize T cell responses post transplant, bioluminescent imaging technology is a non-invasive method to monitor T cell trafficking patterns in vivo. 
Following lethal irradiation, recipient mice are transplanted with bone marrow cells and splenocytes from donor mice. T cell subsets from L2G85.B6 (transgenic mice that constitutively express luciferase) are included in the transplant. By only transplanting certain T cell subsets, one is able to track specific T cell subsets in vivo, and based on their location, develop hypotheses regarding the role of specific T cell subsets in promoting GVHD at various time points. At predetermined intervals post transplant, recipient mice are imaged using a Xenogen IVIS CCD camera. Light intensity can be quantified using Living Image software to generate a pseudo-color image based on photon intensity (red = high intensity, violet = low intensity). 
Between 4-7 days post transplant, recipient mice begin to show clinical signs of GVHD. Cooke et al.1 developed a scoring system to quantitate disease progression based on the recipient mice fur texture, skin integrity, activity, weight loss, and posture. Mice are scored daily, and euthanized when they become moribund. Recipient mice generally become moribund 20-30 days post transplant. 
Murine models are valuable tools for studying the immunology of GVHD. Selectively transplanting particular T cell subsets allows for careful identification of the roles each subset plays. Non-invasively tracking T cell responses in vivo adds another layer of value to murine GVHD models.

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Murine bone marrow transplantation is a widely used technique to study immunological mechanisms governing graft-versus-host disease in humans. The ability to monitor T cell trafficking patterns in vivo allows for detailed analysis of the development and perpetuation of T cell responses during graft-versus-host disease.

이식 - 대 - 호스트 질병의 유도 및<em&gt; 생체 내</emMHC 검색 손쥐 모델을 사용&gt; T 셀 모니터링

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. However, isolating bacterial RNA from infected cells or tissues is a challenging task, since mammalian RNA mostly dominates the lysates of infected cells. Here we describe an optimized method for RNA isolation of Listeria monocytogenes bacteria growing within bone marrow derived macrophage cells. Upon infection, cells are mildly lysed and rapidly filtered to discard most of the host proteins and RNA, while retaining intact bacteria. Next, bacterial RNA is isolated using hot phenol-SDS extraction followed by DNase treatment. The extracted RNA is suitable for gene transcription analysis by multiple techniques. This method is successfully employed in our studies of Listeria monocytogenes gene regulation during infection of macrophage cells 1-4. The protocol can be easily modified to study other bacterial pathogens and cell types.

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

Here we describe a method for bacterial RNA isolation from Listeria monocytogenes bacteria growing inside murine macrophages. This technique can be used with other intracellular pathogens and mammalian host cells.

RNA 정제는 세포 내에서 재배<em&gt; 리스테리아</em&gt; 식세포 세포에

Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. ...

A Rapid Strategy for the Isolation of New Faustoviruses from Environmental Samples Using Vermamoeba vermiformis

The isolation of giant viruses is of great interest in this new era of virology, especially since these giant viruses are related to protists. Giant viruses may be potentially pathogenic for many species of protists. They belong to the recently described order of Megavirales. The new lineage Faustovirus that has been isolated from sewage samples is distantly related to the mammalian pathogen African swine fever virus. This virus is also specific to its amoebal host, Vermamoeba vermiformis, a protist common in health care water systems. It is crucial to continue isolating new Faustovirus genotypes in order to enlarge its genotype collection and study its pan-genome. We developed new strategies for the isolation of additional strains by improving the use of antibiotic and antifungal combinations in order to avoid bacterial and fungal contaminations of the amoeba co-culture and favoring the virus multiplication. We also implemented a new starvation medium to maintain V. vermiformis in optimal conditions for viruses co-culture. Finally, we used flow cytometry rather than microscopic observation, which is time-consuming, to detect the cytopathogenic effect. We obtained two isolates from sewage samples, proving the efficiency of this method and thus widening the collection of Faustoviruses, to better understand their environment, host specificity and genetic content.

A Rapid Strategy for the Isolation of New Faustoviruses from Environmental Samples Using Vermamoeba vermiformis

We describe here the latest advances in viral isolation for the characterization of new genotypes of Faustovirus, a new asfarvirus-related lineage of giant viruses. This protocol can be applied to the high throughput isolation of viruses, especially giant viruses infecting amoeba.

사용 환경 샘플에서 새로운 Faustoviruses의 분리에 대한 신속한 전략<em&gt; Vermamoeba의 vermiformis</em

The isolation of giant viruses is of great interest in this new era of virology, especially since these giant viruses are related to protists. Giant ...

High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In response to these damages, complex molecular machineries rapidly reseal the plasma membrane to restore its barrier function and maintain cell survival. Despite 60 years of research in this field, we still lack a thorough understanding of the cell resealing machinery. With the goal of identifying cellular components that control plasma membrane resealing or drugs that can improve resealing, we have developed a fluorescence-based high-throughput assay that measures the plasma membrane resealing efficiency in mammalian cells cultured in microplates. As a model system for plasma membrane damage, cells are exposed to the bacterial pore-forming toxin listeriolysin O (LLO), which forms large 30-50 nm diameter proteinaceous pores in cholesterol-containing membranes. The use of a temperature-controlled multi-mode microplate reader allows for rapid and sensitive spectrofluorometric measurements in combination with brightfield and fluorescence microscopy imaging of living cells. Kinetic analysis of the fluorescence intensity emitted by a membrane impermeant nucleic acid-binding fluorochrome reflects the extent of membrane wounding and resealing at the cell population level, allowing for the calculation of the cell resealing efficiency. Fluorescence microscopy imaging allows for the enumeration of cells, which constitutively express a fluorescent chimera of the nuclear protein histone 2B, in each well of the microplate to account for potential variations in their number and allows for eventual identification of distinct cell populations. This high-throughput assay is a powerful tool expected to expand our understanding of membrane repair mechanisms via screening for host genes or exogenously added compounds that control plasma membrane resealing.

Here we describe a high-throughput fluorescence-based assay that measures the plasma membrane resealing efficiency through fluorometric and imaging analyses in living cells. This assay can be used for screening drugs or target genes that regulate plasma membrane resealing in mammalian cells.

포유류 세포에서 효율 Resealing 원형질 막의 높은 처리량 측정

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In ...

The Galleria mellonella Waxworm Infection Model for Disseminated Candidiasis

Candida species are common fungal commensals of humans colonizing the skin, mucosal surfaces, and gastrointestinal tract. Under certain conditions, Candida can overgrow their natural niches resulting in debilitating mucosal infections as well as life-threatening systemic infections, which are a major focus of investigation due to their associated high mortality rates. Animal models of disseminated infection exist for studying disease progression and dissecting the characteristics of Candida pathogenicity. Of these, the Galleria mellonella waxworm infection model provides a cost-effective experimental tool for high-throughput investigations of systemic virulence. Many other bacterial and eukaryotic infectious agents have been effectively studied in G. mellonella to understand pathogenicity, making it a widely accepted model system. Yet, variation in the method used to infect G. mellonella can alter phenotypic outcomes and complicate interpretation of the results. Here, we outline the benefits and drawbacks of the waxworm model to study systemic Candida pathogenesis and detail an approach to improve reproducibility. Our results highlight the range of mortality kinetics in G. mellonella and describe the variables which can modulate these kinetics. Ultimately, this method stands as an ethical, rapid, and cost-effective approach to study virulence in a model of disseminated candidiasis.

The Galleria mellonella Waxworm Infection Model for Disseminated Candidiasis

Galleria mellonella serves as an invertebrate model for disseminated candidiasis. Here, we detail the infection protocol and provide supporting data for the model&#39;s effectiveness.

갤러리아 mellonella Waxworm 감염 모델 전파 칸디 다에 대 한

Candida species are common fungal commensals of humans colonizing the skin, mucosal surfaces, and gastrointestinal tract. Under certain conditions, ...

Use of the Invertebrate Galleria mellonella as an Infection Model to Study the Mycobacterium tuberculosis Complex

Tuberculosis is the leading global cause of infectious disease mortality and roughly a quarter of the world&#8217;s population is believed to be infected with Mycobacterium tuberculosis. Despite decades of research, many of the mechanisms behind the success of M. tuberculosis as a pathogenic organism remain to be investigated, and the development of safer, more effective antimycobacterial drugs are urgently needed to tackle the rise and spread of drug resistant tuberculosis. However, the progression of tuberculosis research is bottlenecked by traditional mammalian infection models that are expensive, time consuming, and ethically challenging. Previously we established the larvae of the insect Galleria mellonella (greater wax moth) as a novel, reproducible, low cost, high-throughput and ethically acceptable infection model for members of the M. tuberculosis complex. Here we describe the maintenance, preparation, and infection of G. mellonella with bioluminescent Mycobacterium bovis BCG lux. Using this infection model, mycobacterial dose dependent virulence can be observed, and a rapid readout of in vivo mycobacterial burden using bioluminescence measurements is easily achievable and reproducible. Although limitations exist, such as the lack of a fully annotated genome for transcriptomic analysis, ontological analysis against genetically similar insects can be carried out. As a low cost, rapid, and ethically acceptable model for tuberculosis, G. mellonella can be used as a pre-screen to determine drug efficacy and toxicity, and to determine comparative mycobacterial virulence prior to the use of conventional mammalian models. The use of the G. mellonella-mycobacteria model will lead to a reduction in the substantial number of animals currently used in tuberculosis research.

Use of the Invertebrate Galleria mellonella as an Infection Model to Study the Mycobacterium tuberculosis Complex

Galleria mellonella was recently established as a reproducible, cheap, and ethically acceptable infection model for the Mycobacterium tuberculosis complex. Here we describe and demonstrate the steps taken to establish successful infection of G. mellonella with bioluminescent Mycobacterium bovis BCG lux.

결핵 균복합체를 연구하기 위한 감염 모델로 무척추동물 갤러리아 멜로넬라 사용

Tuberculosis is the leading global cause of infectious disease mortality and roughly a quarter of the world&#8217;s population is believed to be infected ...

Lentiviral CRISPR/Cas9-Mediated Genome Editing for the Study of Hematopoietic Cells in Disease Models

Manipulating genes in hematopoietic stem cells using conventional transgenesis approaches can be time-consuming, expensive, and challenging. Benefiting from advances in genome editing technology and lentivirus-mediated transgene delivery systems, an efficient and economical method is described here that establishes mice in which genes are manipulated specifically in hematopoietic stem cells. Lentiviruses are used to transduce Cas9-expressing lineage-negative bone marrow cells with a guide RNA (gRNA) targeting specific genes and a red fluorescence reporter gene (RFP), then these cells are transplanted into lethally-irradiated C57BL/6 mice. Mice transplanted with lentivirus expressing non-targeting gRNA are used as controls. Engraftment of transduced hematopoietic stem cells are evaluated by flow cytometric analysis of RFP-positive leukocytes of peripheral blood. Using this method, ~90% transduction of myeloid cells and ~70% of lymphoid cells at 4 weeks after transplantation can be achieved. Genomic DNA is isolated from RFP-positive blood cells, and portions of the targeted site DNA are amplified by PCR to validate the genome editing. This protocol provides a high-throughput evaluation of hematopoiesis-regulatory genes and can be extended to a variety of mouse disease models with hematopoietic cell involvement.

Described are protocols for the highly efficient genome editing of murine hematopoietic stem and progenitor cells (HSPC) by the CRISPR/Cas9 system to rapidly develop mouse model systems with hematopoietic system-specific gene modifications.

질병 모델에서 조혈 세포의 연구를 위한 렌티바이러스 CRISPR/Cas9 매개 게놈 편집

Manipulating genes in hematopoietic stem cells using conventional transgenesis approaches can be time-consuming, expensive, and challenging. Benefiting ...