Böbrek tübuloid kültürleri sağlıklı böbrek dokusundan ve idrardan kurularak böbrek hastalığı ve fizyolojisi üzerinde çalışmak için temsili modellerin üretilmesine olanak sağlanabilir. Bu protokol, doku ve idrardan sağlıklı böbrek tübüloidlerinin üretilmesine izin verir, ikincisi kültürlerin nesli için malzeme elde etmenin noninvaziv ve hasta dostu bir yoludur. Tübuloid kültürleri böbrek fizyolojisini incelemek ve bulaşıcı, kötü huylu ve kalıtsal böbrek hastalıkları gibi hastalık modellemesi için kullanılabilir.
Dokudan insan böbrek tübüloidleri üretmek için, böbrek dokusu örneğini 10 santimetrelik bir Petri kabında bir mililitre ileri DMEM artı artı orta seviyeye yerleştirin ve dokuyu yaklaşık bir milimetreküp büyüklüğünde parçalara bölmek için neşter kullanın. Doku parçalarını 15 mililitrelik bir tüpe aktarmak için neşter ve neşter kullanın ve kabı beş mililitre taze ortamla yıkayın. Ortamı tüpe aktarmak için steril 10 mililitre pipet kullanın.
Doku parçalarını santrifüjleme ile tortulayın ve peleti üç ila dört mililitre kollajenaz çözeltisinde yeniden kullanın. Dokuları yatay bir çalkalayıcı üzerinde 37 santigrat derecede ve dakikada 250 devirde 45 ila 60 dakika boyunca kuluçkaya yatırın ve her 15 dakikada bir kuvvetli sallayın. Süspansiyon homojen olduğunda ve doku parçalarının çoğu sindirildiğinde, tüpü orta ile doldurun ve ters çevrilerek beş ila 10 kez karıştırın.
Süspansiyonu santrifüjle. Pelet kırmızıysa, oda sıcaklığında beş dakikalık bir inkübasyon için tüpe bir mililitre kırmızı kan hücresi liziz tamponu ekleyin. Kuluçkanın sonunda, tüpü taze ortamla yıkayın.
Doku parçaları hala görünür durumdaysa, peletı beş mililitre taze ortamla yeniden kaydedin ve süspansiyonu 100 mikron hücreli bir süzgeçten 50 mililitrelik bir tüpe filtreleyin. Filtrelenmiş süspansiyonu santrifüjleme için yeni bir 15 mililitre tüpe aktarın ve hücre peletinin hacmini ölçmek için bilinen bir hacme ayarlanmış bir P1000 pipet kullanın. Hava kabarcıkları oluşturmadan peletin dikkatlice yeniden süzülün ve hücreleri buz üzerinde bir dakika kuluçkaya yatırın.
Kuluçkanın sonunda, peletin% 70 ila 75 hacimli bodrum membran özü ve elde edilen süspansiyonun plaka 15 mikrolitre damlacıklarında 37 derece ısıtılmış çok kuyulu hücre kültürü plakasında yeniden dürt. Tüm damlacıklar kaplandığında, plakayı 15 ila 20 dakika boyunca 37 santigrat derecede baş aşağı kuluçkaya yatırın, ardından 37 santigrat derecelik uygun hacimli ısıtılmış kültür ortamını ekleyin ve kültürleri parlak bir mikroskop altında inceleyin. İdrardan insan böbrek tübüloidleri üretmek için, idrar örneğini 50 mililitre tüp arasında eşit olarak bölün ve numuneleri yıkama başına 10 ila 20 mililitre taze yıkama ortamı ile iki kez yıkayın.
İkinci yıkamadan sonra, peletleri artık süpernatantlarına yeniden depolar ve numuneleri üçüncü bir santrifüjleme için tek bir 15 mililitrelik tüpte bir araya güvenin. Hücre pelet hacmini gösterildiği gibi ölçün ve hava kabarcıkları oluşturmadan peletin dikkatlice yeniden diriltildi. Buzda bir dakika inkübasyondan sonra, peletin% 70 ila 75 hacimli bodrum membran özü ve plaka 15 mikrolitre damlacıkta elde edilen süspansiyonun 37 santigrat derece ısıtılmış çok kuyulu hücre kültürü plakalarını gösterildiği gibi yeniden kullanın, ardından taze ortam eklemeden ve kültürleri hafif mikroscopy ile görüntülemeden önce damlacıkları 15 ila 20 dakika boyunca baş aşağı inkübasyon yapın.
Her iki kültür türünden bir ila iki hafta sonra, bağlı hücreleri toplamak için kuyuların altlarını kazımak için ucu kullanarak her kuyudaki tübuloid damlacıklarını bozmak için bir P1000 pipet kullanın. Kuyu içeriğini 10 mililitre gelişmiş DMEM artı artı orta içeren tek bir 15 mililitrelik tüpte çekin ve tubuloidleri santrifüjleme ile toplayın. Peletin boyutuna bağlı olarak, 37 santigrat derecede beş dakikalık bir inkübasyon için 10 mikromolar Y27632 ile desteklenmiş tripsin değiştirme maddesi ekleyin.
Kuluçkanın sonunda, tübuloid süspansiyonunu 20 ila 30 kez pipetlamak için ucun üzerine yerleştirilmiş 10 mikroliter pipet ucu ile 1.000 mikroliter pipet ucu kullanın. Tüpte hala sağlam tübuloid olup olmadığını görmek için mikroskop altında kontrol edin. Sağlam tübuloidlerin% 10'undan daha azı mevcuttur, tüpü taze gelişmiş DMEM artı artı ile doldurur ve pelet hacminin gösterildiği gibi ölçülebilmesi için tubuloidleri santrifüjleme ile toplar.
Peletin% 70 ila 75 hacimli bodrum membran özü ve plaka 15 mikrolitre damlacıkları 37 santigrat derece ısıtılmış çok kuyulu hücre kültürü plakasında yeniden dürt. 37 santigrat derecede 15 ila 20 dakikalık baş aşağı inkübasyondan sonra, damlacıklara önceden ısıtılmış kültür ortamı ekleyin ve kültürü hafif mikroskopi ile inceleyin. Böbrek dokusu örneklerinden üretilen tübuloidler tipik olarak kültür kuruluşundan sonraki yedi gün içinde ortaya çıkar ve kaplamadan sonraki bir ila iki hafta içinde geçmesi gerekir.
İdrar kültürlerinde, kompakt tübuloid yapılar ve yapışık hücreler kaplamadan yaklaşık 14 ila 21 gün sonra ortaya çıkar ve ilk geçiş genellikle üç ila dört hafta arasında gerçekleşir. Kistik epitel tubuloidlerin varlığı her pasajda artar. İnsan böbrek tübuloid kültürlerinin başarılı nesli, eşleştirilmiş kutu gen 8 proteini gibi tübüler böbrek epitelinde ifade edilen belirteçler için immünohistokimyasal lekeleme ile değerlendirilebilir.
Doku materyalinin enzymatic sindiriminin doğru zamanlaması ve idrar örneklerinin hızlı işlenmesi, bu protokollerin başarılı bir şekilde sonuçlanması için çok önemli adımlardır. Böbrek tübuloid kültürlerinin kurulmasının yüksek verimliliği, birçok kemoterapötiklerin ortak bir yan etkisi olan ilaca bağlı nefrotoksisitenin hastaya özgü testlerinin önünü açabilir.
