Name: dissection and culture of mouse embryonic kidney
Uploaded: 2017-05-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dissection and Culture of Mouse Embryonic Kidney at JoVE.com

Yazarlar Leif Oxburgh&#39;a ve Derek Adams&#39;a, teknik destekleri için Stefan Wölfl ve Ulrike Müller ve teknik destekleri için Saskia Schmitteckert, Julia Gobbert, Sascha Weyer ve Viola Mayer&#39;e yardım etmek için el yazmalarına yararlı yorumlar için Leif Oxburgh&#39;u cömertçe paylaşmaktan dolayı teşekkür ederler. laboratuvarı. Bu çalışma Biyologlar Şirketi Geliştirme (CP) tarafından desteklendi .

Fareler, İsveç yönetmeliklerine ve Avrupa Birliği mevzuatına (2010/63 / AB) göre korunmuştur. Bütün prosedürler İsveç Etik Komitesinin talimatlarına (C79 / 9, C248 / 11 ve C135 / 14 izinlerine) uygun olarak gerçekleştirildi. Heidelberg Üniversitesi&#39;ndeki hayvan konularını içeren prosedürler Regierungspräsidium Karlsruhe ve Heidelberg Üniversitesi&#39;nden Hayvan Refahı Memurları tarafından onaylanmıştır. 1. Kültür için Reaktiflerin ve Materyallerin Hazırlanması NOT: Kirliliği en aza indirgemek için laminer bir akış kaputu kullanın. <ol><li> Diseksiyon günü, insana ait Fc&#39;yi tek başına veya insan Fc&#39;ye kaynaştırılmış rekombinant kimerik efrin proteini, anti-insan Fc keçi antikorları ile steril fosfat tamponlu salin (PBS) içinde 1: 5&#39;lik bir molar oranda karıştırarak önceden kümeleyin. 1 saat boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin 5 . </li><li> Kültür ortamını, Dulbecco&#39;nun Modifiye Kartal Ortamını tamamlayarak hazırlayın: Besleyici% 1 penisilin / streptomisin (h / h),% 1 glutamin (h / h),% 1 insülin-transferrin-selenyum (h / h), 50 ug / mL insan holo- lanyum karışımı ile F-12 karışımı (DMEM / F12) Transferrin ve 1.5 ug / mL amfoterisin. NOT: 16 embriyo için 10 mL ortam yeterlidir. </li><li> Kültür ortamına 20 μg / mL son konsantrasyonda kümelenmiş rekombinant efrin çözeltisi ekleyin. Kümelenmiş insan Fc&#39;sini kontrol olarak kullanın. </li><li> Steril, kaplanmamış, düz dipli polistiren 4 yuvalı plakanın her bir kuyusuna 500 μL kültür ortamı ilave ederek kültür plakaları hazırlayın. </li><li> Steril forseps kullanarak dikkatli bir şekilde 5 μm / gözenek büyüklüğünde bir polikarbonat membran filtreyi ortamın üzerine yerleştirin. Hazırlanan plakayı kuluçka makinesine aktarın (37 ° C /% 5 CO 2 ). Filtrenin üst yüzeyde kuru kalmasını ve yüzmesini sağlayın. NOT: İki böbrek anlagen için bir filtre yeterlidir. </li><li> Bir traş bıçağı kullanarak, yaklaşık 30 pipet ipucu (hacim: 100 uL) yaklaşıkY 1 mm daha geniş bir açılma ile sonuçlanacak şekilde. Uçları bir pipet uçlu rafa geri yerleştirin. </li></ol> 2. Metanfrik Temellerin E11.5&#39;te Diseksiyonu <ol><li> E11.5&#39;te servikal dislokasyon ile (veya yerel etik komitesince onaylanmış bir yöntemi kullanarak) zamana bağlı hamile bir fareyi kurban edin. </li><li> Brown ve ark . Tarafından açıklandığı üzere uterus ve embriyoları çıkarın 6 . Bu noktadan itibaren diseksiyon mikroskopu altında çalışın. </li><li> 5 nolu saatçi forseps kullanarak, forellerin altında doğrudan embriyo kesin. Her bir embriyo için taze bir petri kullanın. Bacakları ve embriyonun kuyruğunu çıkarın. Bunu yapmak için, bir çift No.5 saatçilik forsepsiyle çıkarılacak dokuyu alın ve kesmek için ikinci bir çiftin uçlarını kullanın. </li><li> Ventral organ kütlesini çıkarmak için, embriyonun vücut duvarını bir burun deliğinden kaudal yönde yana doğru açmak için bir çift forsepsin uçlarını kullanın. <ol><li> Yüzeyel olarak, paralel olarak kesO dorsal aorta. Yöneltmek için kan dolu ve bu nedenle görünür dorsal aort kullanın. Kapalı forseps ipuçlarını kullanarak vücut duvarının ventral kısmını dorsal kısımdan dikkatlice ayırın ve embriyo üzerine çevirin. Vücut duvarı bir rostral-kaudal yönde lateral olarak kesin ve önceki yan için olduğu gibi yönlendirme için dorsal aortu kullanın. </li></ol></li><li> Ventral vücut duvarı dorsal vücuttan ayrıldıktan sonra, bir çift forsepsle tutun ve organ kütlesi ile birlikte dikkatle çekerek çıkarın. NOT: Metanefrik anlagen genellikle dorsal vücut duvarına yapışır. Bunlar, oval, ~ 200 μm uzunluğunda yapıların arka bacaklar seviyesinde bulunur. </li><li> Dorsal vücut duvarını, ventral yüz yukarı bakacak şekilde bir çift forsepsle tutun. Diğer forseps çiftini kullanarak, dorsal aortayı rostral ucundan tutun ve dorsal aortayı dorsal vücut duvarından dikkatlice soyun. NOT: Her iki metanefrik böbrek genellikle ekte kalırDorsal aorta yapıştırılmış. </li><li> Bir çift forseps kullanarak, aortu çıkarmak için rostral olarak böbrek anlagenine kestik. Daha sonra forseps ipuçlarını kullanarak iki böbrek anlagen dikkatlice ayırın. </li><li> Forsep ipuçlarını kullanarak böbrek anlagenindeki istenmeyen dokuları dikkatlice soyun. Hasar kötü büyümeye ve eksplantın ek analizden çıkarılmasına neden olabileceğinden mezenşime zarar vermemeye özen gösterin. </li><li> Böbrek anlagenini, bir mikrolitrre pipet ve 4 plaka içindeki polikarbon membran filtreye 10 μL PBS içinde geniş açık pipet kullanarak ayrı olarak aktarın. NOT: Yüzey gerilimi nedeniyle, eksplant ince bir ortam tabakası ile örtülür. İki böbrek anlagen için bir filtre yeterlidir. <ol><li> İki böbrek anlageninin her birini filtrenin ilgili yarısının ortasına yerleştirin. Plakayı 37 ° C /% 5 CO 2&#39;de inkübatöre geri aktarın. Metanetrik rud gelinceye kadar plakayı inkübatöre bırakınBir sonraki embriyo örnekleri filtreye konmaya hazırdır. </li></ol></li><li> Her embriyo için 2.3-2.9.1 adımlarını tekrarlayın. NOT: Bazı uygulamalarda, diseksiyon prosedürü, embriyo başına yaklaşık 5 dakika sürecektir. </li><li> 37 ° C /% 5 CO 2&#39;de 3 gün boyunca böbrek anlagen inkübe edin. </li></ol> 3. Fiksasyon ve Boyama için Reaktiflerin Hazırlanması <ol><li> Kalsiyum ve magnezyum (w / v) olmadan PBS içinde% 4 paraformaldehit (PFA) hazırlamak için, PFA 60 ° C&#39;de çözülür, sürekli karıştırılır. Oda sıcaklığına soğutun ve kalan parçacıkları çıkarmak için bir kağıt filtre kullanın. Derhal çalkalamak için 4 ° C&#39;de tutun veya uzun süreli depolamada dondurun. DİKKAT: PFA toksiktir. Yerel güvenlik standartlarında belirtilen kişisel koruyucu donanım kullanın ve bir davlumbazda çalışın. Kurumsal talimatları takip edip atık atın ve atık konteynırlarını kullanın. </li><li> Geçirgen hale getirme çözeltisi hazırlamak için, Triton X-100&#39;ü seyreltinPBS içinde kalsiyum ve magnezyum olmadan% 0.3 (h / h). </li><li> Bloklama çözeltisi hazırlamak için, kalsiyum ve magnezyum içermeyen PBS&#39;ye% 5 (v / v) keçi serumu ve% 0.1 Triton X-100 ekleyin. % 0.02 (w / v) nihai konsantrasyona sodyum azid ekleyin. 4 ° C&#39;de saklayın. DİKKAT: Sodyum azid toksiktir. Sodyum azidi yerel güvenlik ve çevre koruma yönetmeliklerine uygun olarak kullanın. NOT: Boyama için antikor kullanırken, ikincil antikorun bloke edici solüsyon yapmak için türetildiği türlerden% 5 serum kullanın. </li><li> Bloke edici çözeltide, biyotinlenmiş Dolichorus biflorus aglutinin 1: 200 seyreltin. Bloke edici çözeltide Alexa488-konjüge streptavidin 1: 200 seyreltin. </li><li> 0.1 M Tris-HC1 (pH 8.5) içinde 0.1 g suda çözünür polivinil alkol bazlı muko yapışkan / mL ila% 25 (w / v) gliserol ilave etmek üzere, kullanıma hazır gömme ortamı yapmak için (materyal tablosuna bakın) . Sürekli çalkantı altında 50 ° C&#39;ye 1 saat boyunca ısıtın, soğutun ve pH&#39;ı 1 ile 8.0-8.5&#39;e ayarlayınNaOH. Daha yüksek NaOH konsantrasyonlarından kaçının. % 0.02 (w / v) nihai konsantrasyona kadar 100 μg / mL N-propilgalat ve timerosal ekleyin. Oda sıcaklığında 30 dakika karıştırın. DİKKAT: Thimerosal toksiktir. Yerel güvenlik ve çevre koruma yönetmeliklerine uygun olarak tutun. <ol><li> Gömülü ortamı 50 mL&#39;lik tüplere doldurun, rotoru dengeye getirin ve 10 dakika boyunca oda sıcaklığında 3.200 xg&#39;de santrifüjleyin. 15 mL&#39;lik tüplere temiz bir solüsyon dökün ve pelleti atın. Birkaç hafta süreyle -20 ° C&#39;de miktar ve depolar. Çözündükten sonra çözeltiyi 4 ° C&#39;de tutun. Kullanımdan hemen önce ~ 30 ° C&#39;ye kadar ısıtın. </li></ol></li><li> Eksplantlara sahip filtreler monte edilecek kadar çok cam slayt hazırlayın. Bunun için, anında yapışkan kullanarak cam sürgünün her iki yanında 18 x 18 mm&#39;lik iki adet küçük lamelleri tutkal edin. Aralarında filtre için ~ 15 mm boşluk bırakın. </li></ol> 4. Fiksasyon ve boyama <ol><li> 3 kültür periyodundan sonraIn vitro (div) günler, kuluçka makinesinden plakaları çıkartın ve bir mikropipet kullanarak kültür ortamını her kuyucuktan dikkatle aspire edin. Filtreye dokunmamaya dikkat edin ve ucu açma kuyusunun duvarına doğru tutun. </li><li> Her göze 500 uL% 4 PFA / PBS ekleyin. Filtreler fiksatif üzerine yüzer. Bir mikropipet kullanarak, filtreleri batırmak için PFA sabitleyiciyi damla damla dikkatle ekleyin. Oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. NOT: Takip eden tüm adımlar için, eksplantları filtreden yıkamamaya özen gösterilmelidir. Pipet ucunun ağzına doğru açılmasını sağlayın. </li><li> PFA&#39;yı çıkarın ve 500 ul PBS ile yıkayın, filtreyi suya batırın. Her göze 500 μL permeabilizasyon solüsyonu ilave edin ve 1 saat oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> 500 μL PBS ile iki kez durulayın ve her oyuğa 500 μL engelleyici çözüm ekleyin. Oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin. </li><li> Bloklama çözeltisini şu şekilde değiştirin:Bloke edici çözeltide 1: 200 oranında seyreltilmiş 250 uL biyotinlenmiş Dolichorus biflorus aglutinin ve 4 ° C&#39;de 24 saat inkübe edin. </li><li> Dolichorus biflorus aglutinin solüsyonunu çıkarın ve her göz başına 500 μL PBS ile iki kez durulayın. </li><li> Bloke edici çözelti 1: 200 seyreltilmiş 250 uL Alexa488-konjuge streptavidin ekleyin ve 24 saat boyunca 4 ° C&#39;de inkübe edin. Alternatif olarak, oda sıcaklığında 2 saat boyunca inkübe edin. NOT: 4 ° C&#39;de inkübe edildiğinde daha iyi bir sinyal-gürültü oranı elde edilir. </li><li> Kuyu başına iki kez 500 μL PBS ile durulayın. Forseps kullanarak, filtreleri hazırlanan cam slaytlara, eksplantlar yukarı bakacak şekilde nakletin. ~ 50-100 μL embedding aracı ile monte edin. 60 mm uzunluğunda No. 1.5 lamelleri ile kaplayın. Gömülü orta solüsyonun karanlıkta oda sıcaklığında 2 saat süreyle katılaşmasına izin verin. Resim hazır oluncaya kadar 4 ° C&#39;de folyoya sarılmış slaytları görüntülemeye veya saklamaya devam edin. </li><li> Geniş alan epifluoresan mikroskopu ile görüntü 7 &lt;/ Sup&gt; bir Hg lambasına bağlanmış ve mavi uyarılma için bir ayna ünitesi (uyarma bandı geçişi, 460 - 495 nm, çift renk ayna, 505 nm ve emisyon bandı geçişi, 510 - 550 nm) ve 20X Plan-Apokrom lensleri, 0.75 sayısal açıklık. </li></ol>

<ol>
	<li>Sax&#233;n, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Organogenesis of the kidney. Developmental and Cell Biology Series. 19, (1987).</li><li>Lindstr&#246;m, N. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+&#946;-catenin,+BMP,+PTEN,+and+Notch+signalling+patterns+the+nephron.">Integrated &#946;-catenin, BMP, PTEN, and Notch signalling patterns the nephron.</a> eLife. 4, e04000 (2015).</li><li>Peuckert, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimodal+Eph/Ephrin+signaling+controls+several+phases+of+urogenital+development.">Multimodal Eph/Ephrin signaling controls several phases of urogenital development.</a> Kidney Int. 90 (2), 373-388 (2016).</li><li>Pasquale, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eph+receptor+signalling+casts+a+wide+net+on+cell+behaviour.">Eph receptor signalling casts a wide net on cell behaviour.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (6), 462-475 (2005).</li><li>Bonanomi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ret+Is+a+Multifunctional+Coreceptor+that+Integrates+Diffusible-+and+Contact-Axon+Guidance+Signals.">Ret Is a Multifunctional Coreceptor that Integrates Diffusible- and Contact-Axon Guidance Signals.</a> Cell. 148 (2), 568-582 (2012).</li><li>Brown, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Culture+of+Cells+from+the+Nephrogenic+Zone+of+the+Embryonic+Mouse+Kidney.">Isolation and Culture of Cells from the Nephrogenic Zone of the Embryonic Mouse Kidney.</a> J Vis Exp. (50), e2555 (2011).</li><li>Grobstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inductive+interaction+in+the+development+of+the+mouse+metanephros.">Inductive interaction in the development of the mouse metanephros.</a> J Exp Zool. 130, 319-340 (1955).</li><li>Sax&#233;n, L., Toivonen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Primary Embryonic Induction. , (1962).</li><li>Sax&#233;n, L., Koskimies, O., Lahti, A., Miettinen, H., Rapola, J., Wartiovaara, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+kidney+mesenchyme+in+an+experimental+model+system.">Differentiation of kidney mesenchyme in an experimental model system.</a> Adv Morphog. 7, 251-293 (1968).</li><li>Dudley, A. T., Godin, R. E., Robertson, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+between+FGF+and+BMP+signaling+pathways+regulates+development+of+metanephric+mesenchyme.">Interaction between FGF and BMP signaling pathways regulates development of metanephric mesenchyme.</a> Genes Dev. 13, 1601-1613 (1999).</li><li>Per&#228;l&#228;, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sema4C-Plexin+B2+signalling+modulates+ureteric+branching+in+developing+kidney.">Sema4C-Plexin B2 signalling modulates ureteric branching in developing kidney.</a> Differentiation. 81 (2), 81-91 (2011).</li><li>Thesleff, I., Ekblom, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+transferrin+in+branching+morphogenesis,+growth+and+differentiation+of+the+embryonic+kidney.">Role of transferrin in branching morphogenesis, growth and differentiation of the embryonic kidney.</a> J Embryol exp Morph. 82, 147-161 (1984).</li><li>Watanabe, T., Costantini, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+analysis+of+ureteric+bud+branching+morphogenesis.">Real-time analysis of ureteric bud branching morphogenesis.</a> Dev Biol. 271, 98-108 (2004).</li><li>Sebinger, D. D. R., Unbekandt, M., Ganeva, V. V., Ofenbauer, A., Werner, C., Davies, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel,+Low-Volume+Method+for+Organ+Culture+of+Embryonic+Kidneys+That+Allows+Development+of+Cortico-Medullary+Anatomical+Organization.">A Novel, Low-Volume Method for Organ Culture of Embryonic Kidneys That Allows Development of Cortico-Medullary Anatomical Organization.</a> PLoS One. 5 (5), e10550 (2010).</li><li>Ekblom, P., Miettinen, A., Virtanen, I., Wahlstr&#246;m, T., Dawnay, A., Sax&#233;n, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+segregation+of+the+metanephric+nephron.">In vitro segregation of the metanephric nephron.</a> Dev Biol. 84 (1), 88-95 (1981).</li><li>Davies, J. A., Unbekandt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=siRNA-mediated+RNA+interference+in+embryonic+kidney+organ+culture.">siRNA-mediated RNA interference in embryonic kidney organ culture.</a> Methods Mol Biol. 886, 295-303 (2012).</li><li>Sax&#233;n, L., Lehtonen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+kidney+in+organ+culture.">Embryonic kidney in organ culture.</a> Differentiation. 36 (1), 2-11 (1987).</li><li>Bard, J. B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+the+mouse+kidney+embryogenesis+writ+small.">The development of the mouse kidney embryogenesis writ small.</a> Curr Opin Genet Dev. 2, 589-595 (1992).</li><li>Davies, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+cold+storage+and+transport+of+viable+embryonic+kidney+rudiments.">A method for cold storage and transport of viable embryonic kidney rudiments.</a> Kidney Int. 70 (11), 2031-2034 (2006).</li><li>Batourina, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distal+ureter+morphogenesis+depends+on+epithelial+cell+remodeling+mediated+by+vitamin+A+and+Ret.">Distal ureter morphogenesis depends on epithelial cell remodeling mediated by vitamin A and Ret.</a> Nat Genet. 32 (1), 109-115 (2002).</li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Bu el yazması, fare embriyosundan gelişen metanefrik anlagen&#39;in izole edilmesi ve organ öncüllerinin kültürlenmesi için bir yöntem açıklamaktadır. Bu yöntem, Grobstein 8 ve Saxén 9 , 10 tarafından geliştirilen standart bir tekniktir ve diğerleri 11 , 12 tarafından uyarlanmış ve değiştirilmiştir. Yöntemin başarısı, eksplantların sağkalımı ve endüktif potansiyelin, uzamış diseksiyon süresi ile azalması nedeniyle, çoğunlukla diseksiyonun süresine bağlıdır. Çevredeki dokudan böbrek rudimanını temizlerken mezenşime zarar vermemek için dikkatli olunmalıdır. Metanefrik mesenşimin hasar görmesi, eksplantların yetersiz büyümesinin sebebi olur. Bununla birlikte, diseksiyon hızı ve ince motor becerileri uygulama ile büyük ölçüde gelişir. Sunulan protokoldeki kimyasal olarak tanımlanmış ortam,Primer hücre ve in vitro organ kültüründe serum içeren madde içerir ve eksplantların büyümesini ve hayatta kalmasını desteklemek için insülin transferrin-selenyum ile takviye edilmiş 1: 1 (h / h) DMEM ve Ham&#39;s F-12 karışımı içerir. Glukoz ve amino asit alımı, lipogenezis ve hücre içi ulaşım insülin tarafından kolaylaştırılır. Selenyum, glutatyon peroksidazının bir kofaktörüdür ve antioksidan olarak işlev görür. Transferrin demir taşıyıcıdır ve oksijen radikallerine karşı koruma sağlar. Embriyonik böbrek kültüründe, transferin, ortama ilavesi, tübü diferansiasyonunu ve timidin birleşmesini doz bağımlı bir şekilde arttırır ve maksimum 50 μg / mL&#39;lik bir etki sağlar13. Dolayısıyla, insan-holo- transferrin ilave olarak, yaklaşık 55 ug / mL&#39;lik bir nihai transferrin konsantrasyonuyla sonuçlandırılır. Eagle Minimal Essential Medium ile daha basit ama kimyasal olarak daha az tanımlanmış bir bileşim kullanan birçok protokol(MEM) veya DMEM ve% 10 serum ( örn., Fetal sığır serumu, FBS) de 12,13,14,15 çok tatmin edici sonuçlar verir. Bununla birlikte, farklı FBS lotları arasındaki farklılıklar olabilir. Bu varyasyonlardan kaçınmak ve serumda Eph sinyali veren büyüme faktörlerinin muhtemel etkileşimini dışlamak için, serumdan arınmış ortam seçildi. Serumsuz besiyeri kullanılıp kullanılmayacağı, deneysel düzene ve bilimsel soruna bağlıdır. Nihai amaç terapötik uygulamalardığında, serum-serbest kültür koşulları özellikle gereklidir. Bu protokole dahil olan anti-fungal ajan olan Amfoterisin B atlanabilir. Sunulan örnekte kültür süresi 3 gündür, ancak metanefrik böbrek esasları 10 gün 15&#39;e kadar kültürlenebilir. 3 günden fazla kültürlerde, ortam 48 saatte bir değiştirilmelidir. Ölenlerin gelişimiIn vitro çalışmalarda pre-borular agrega, böbrek veziküllerin ve virgül ve S-şekilli cisimlerin in vivo dizileri yeniden özetlenir. In vitro 3 gün sonra, glomerüler benzeri yapılar 15 , 16 oluşturdu. Daha uzun kültürlerde, ekstraktör alanı, üreter tomurcuğunun dallanmasına bağlı olarak daha da artar. Yaklaşık 5 günlük kültürde nefronlar distal, orta ve proksimal bölmelere 16 ayrılmıştır. Tekniğin göreli kolaylığı ve maliyet etkinliğine rağmen, çok yönlü uygulamalara izin verilirken, deneyler planlanırken ve sonuçların yorumlanmasında bazı hususlar akılda tutulmalıdır. Kültür organlarında bulunan ekstraselüler matriks ve bazal membran nedeniyle, eksojen ajanların ve parçacıkların difüzyonu sınırlıdır ( 17) . Dahası, yapay kültür şartları ve manipülasyonları, metabolizmada değişikliğe neden olabilirDokunun ism ve in vivo durum 15 , 18 farklı hücre davranışı. En belirgin olan, eksplantların kan dolaşımının olmaması ve glomerüllerin avasküler olması; Nefronlar bölünmüş halde olmasına rağmen, bölgeye ayrılma ve bir medulla oluşumu ve Henle döngüleri eksik 14 , 19 . Böylelikle, embriyonik böbrek kültürünün uygulama spektrumu boru yapıları, dallanma morfolojisi ve mezenkimal epitelyal etkileşimlerle sınırlıdır. Sonuç olarak, böbrek fonksiyonlarını hedef alan bilimsel sorular ele alınamıyor. Böbrek referanslarının kaplanmış cam üzerinde düşük hacimde büyüyen kültür yönteminin son modifikasyonları, Henle 15&#39;in genişletilmiş döngüleri ile bile kortiko-medüller zonasyona kadar organotipik gelişimi sağladı. Ayrıca, son zamanlarda, yaşamanın saklanması ve korunması için bir yönteminEmbriyonik böbrekler yayınlandı. Bu yöntem, embriyonik böbrek örneklerinin E11.5&#39;te birkaç gün taşınmasını sağlar ve daha sonra kültürlenmelerine izin verir. Bu özellikle işbirliklerine ilgi duyuyor 20 . Tüm böbrek rudım kültürünün doğası ileri görüntüleme teknikleri de dahil olmak üzere çeşitli metodolojik uyarlamalara izin verir. Canlı görüntüleme sırasında rahatsız edici hareketlerden kaçınmak için, yüzen aracın yerine yerleştirilmiş bir iç filtre gibi sabit bir filtre ile değiştirilmesi önerilir. Sunulan teknoloji, tüm ürogenital sistemi içeren kültür dokusu bloklarına kadar genişletilmiştir. Bu genişletilmiş kültürü kullanarak, mesaneye üreter girişi araştırılabilir 21 .

The mammalian kidney is derived from two primordial structures with mesodermal origin: the tubular epithelial ureteric bud and the metanephric mesenchyme. During nephrogenesis, the ureteric bud invades the metanephric mesenchyme and branches to form the collecting system. The metanephric mesenchyme gives rise to the epithelial elements of the nephrons. These processes occur in a precisely timed and spatially coordinated manner and are initiated by reciprocal inductive mechanisms. Both tissue components communicate and affect the other's cell morphogenesis. 
In the 1920s, it was Boyden who performed the in vivo obstruction of the mesonephric duct in chicken, providing the first indication of inductive interactions as separated nephric blastema fail to differentiate1. At about the same time, the first successful attempts to culture chicken nephric rudiments in a hanging drop were published. Subsequently, the organ culture was developed to study tissue interactions in mammalian organogenesis. In the 1950s, Grobstein developed a technique in which metanephric rudiments could be cultured on a filter. This technique was modified by Sax&#233;n, who placed the filter on a Trowell-type screen in a culture dish1. Over the years, many modifications and applications for organ culture have emerged. The method described here is based on Sax&#233;n's technique but is simplified, as the filters float free on the medium and the diameter of the culture well only slightly exceeds the diameter of the filter, limiting unwanted movement of the filter.
Whole-organ culture is a classical, cheap, and simple but powerful tool to investigate cellular processes and intercellular communication during organogenesis. Organ culture allows for treatment with biological agents, such as growth factors, antibodies, antisense oligonucleotides, viruses, and peptides, as well as with pharmaceutical compounds and other chemicals. Also, gene function may be studied using explants derived from genetically modified mice or using inducible gene inactivation technology, such as the Cre-loxP system. This allows for the study of genetic mutations that cause embryonic lethality prior to the development of the kidney. Organ culture can also be combined with fluorescent tagging for gene function or lineage tracing and modern imaging techniques, which enable real-time monitoring of cell behavior2.
In the specific example provided here, the effect of EphrinB2-activated Eph-receptor signaling on the branching morphology of the ureteric bud was investigated. The morphology of the EphA4/EphB2 double-knockout mice suggested several severe defects in kidney development, which were detectable as early as embryonic day 11 (E11) and involved the ureteric bud, the ureter, and the common nephric duct3. Signaling via Eph receptors requires the clustering of the ligand-receptor dimer4. To over-activate Eph signaling, the kidney rudiments from E11.5 mouse embryos were cultured in the presence of clustered recombinant EphrinB2-Fc. EphrinB2 is a known ligand for the EphA4 receptor, which is expressed in the ureteric bud tips3.

<table><tbody><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21331020</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140148</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX Supplement</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, calcium, magnesium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14040117</td><td>use for dissection</td></tr><tr><td>holo-Transferrin human</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0665</td><td></td></tr><tr><td>Insulin-Transferrin-Selenium (ITS -G) (100x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>41400045</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Amphotericin B solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2942</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Sodium azide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8032</td><td></td></tr><tr><td>Thimerosal</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5125</td><td></td></tr><tr><td>Propyl gallate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>2370</td><td></td></tr><tr><td>Mowiol 4-88</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81381</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Biotinylated Dolichorus Biflorus Agglutinin</td><td>Vector Laboratories</td><td>B-1035</td><td></td></tr><tr><td>Alexa488 conjugated Streptavidin</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>016-540-084</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Mouse Ephrin-B2 Fc Chimera Protein, CF</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>496-EB</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Human IgG1 Fc, CF</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>110-HG-100</td><td></td></tr><tr><td>Goat Anti-Human IgG Fc Antibody</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>G-102-C</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline tablets</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td>use for fixation and immunostaining</td></tr><tr><td>Dumont #5, biologie&lt;br/&gt; tips, INOX, 11 cm</td><td>agnthos.se</td><td>0208-5-PS</td><td>2 pairs of forceps are needed</td></tr><tr><td>Iris scissors, straight, 12 cm</td><td>agnthos.se</td><td>03-320-120</td><td></td></tr><tr><td>Dressing Forceps,&lt;br/&gt; straight, delicate, 13 cm</td><td>agnthos.se</td><td>08-032-130</td><td></td></tr><tr><td>Petri dishes Nunclo Delta treated</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>150679</td><td></td></tr><tr><td>TMTP01300 Isopore Membrane Filter, polycarbonate, Hydrophilic, 5.0 &amp;micro;m, 13 mm, white, plain</td><td>MerckMillipore</td><td>TMTP01300</td><td></td></tr><tr><td>Nunclon Multidishes&lt;br/&gt; 4 wells, flat bottom</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6789-1CS</td><td></td></tr><tr><td>Microscope cover glass 24 x 50 mm thickn. No.1.5H 0.17+/-0.005 mm</td><td>nordicbiolabs</td><td>107222</td><td></td></tr><tr><td>Cover glasses No.1.5, 18 mm x 18 mm</td><td>nordicbiolabs</td><td>102032</td><td></td></tr><tr><td>Slides ~76 x 26 x 1, 1/2-w. ground plain</td><td>nordicbiolabs</td><td>1030418</td><td></td></tr><tr><td>VWR Razor Blades</td><td>VWR</td><td>55411-055</td><td></td></tr><tr><td>50 mL centrifuge tubes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430828</td><td></td></tr><tr><td>15 mL centrifuge tubes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430055</td><td></td></tr><tr><td>Whatman prepleated qualitative filter paper, Grade 113V, creped</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WHA1213125</td><td></td></tr><tr><td>Fixed stage research mircoscope</td><td>Olympus</td><td>BX61WI</td><td></td></tr><tr><td>Black 6 inbred mice, male, C57BL/6NTac</td><td>Taconic</td><td>B6-M</td><td></td></tr><tr><td>Black 6 inbred mice,female, C57BL/6NTac</td><td>Taconic</td><td>B6-F</td><td></td></tr><tr><td>Greenough Stereo Microscope</td><td>Leica</td><td>Leica S6 E</td><td></td></tr></tbody></table>

dissection and culture of mouse embryonic kidney

Bu protokolün amacı, fare metanfrizik temellerinin diseksiyonu, izolasyonu ve kültürü için bir yöntem tanımlamaktır. Memeli böbrek gelişimi sırasında iki progenitör doku, üreterik tomurcuk ve metanefrik mezenşim, hücrenin mekanizmalarını birbirleriyle iletişim kurar ve karşılıklı olarak toplayıcı sistemi ve böbreğin nefronlarını oluştururlar. Memeli embriyolar intrauterin olarak büyür ve bu nedenle gözlemci tarafından erişilemez olduğundan, bir organ kültürü geliştirilmiştir. Bu yöntemle böbrek organogenezi sırasında epitelial mezenkimal etkileşimler ve hücresel davranışları incelemek mümkündür. Ayrıca konjenital böbrek ve ürogenital sistem malformasyonlarının kökeni de araştırılabilir. Dikkatle diseksiyon yapıldıktan sonra, metanfrrik temeller, kültür ortamında yüzen ve birkaç gün süreyle bir hücre kültürü inkübatöründe tutulabilen bir filtreye aktarılır. Bununla birlikte, koşullarınYapay ve dokudaki metabolizmayı etkileyebilir. Ayrıca, eksplantda bulunan ekstrasellüler matriks ve bazal membran nedeniyle test maddelerinin penetrasyonu sınırlı olabilir. Organ kültürünün en önemli avantajlarından biri, deneycinin organa doğrudan erişebilmesidir. Bu teknoloji ucuz, basittir ve biyolojik açıdan aktif maddelerin eklenmesi, genetik varyantların incelenmesi ve gelişmiş görüntüleme teknikleri gibi çok sayıda değişikliğe izin verir.

Metanefrik böbrek anlagen E11.5 gebe Black-6 yakın cinsinden farelerden türetilmiş ve kültürlenmiştir. Üç gün sonra üreter tomurcuğu 5 kez dallandı ve başlangıçta T şeklindeki üreter tomurcuğunun dalgalanmasına neden oldu. Her eksplant fotoğraflandı ve dallanma nesillerini belirlemek ve dal başına bitiş noktalarının sayısını hesaplamak için bölümlerin ve uç noktaların sayıları nicelleştirildi ( Şekil 1 ). Image 4. nesil, kontrol eksplantlarının% 35&#39;ine kıyasla, tedavi edilen eksplantların yalnızca% 8&#39;inde ulaşılmıştır ( Şekil 1b ). Buna göre, dal başına bitiş noktası sayısı ve mm2 başına bitiş noktası sayısı azalmıştır. Eksplantlar kümelenmiş EphrinB2 ile tedavi edildi Ek olarak, eksplantların üçte birinde üreter tomurcuklanma ipuçlarında olağan dışı morfoloji vardı ( Şekil 1 ) .Bu sonuçlar EphrinB2&#39;nin kısıtlayıcı bir etkiye sahip olabileceğini düşündürdüBüyük olasılıkla EphA4 ve EphB2 ileri sinyalizasyonunu aktive ederek üretere tomurcuk dallanma işlemi üzerinde. Başarılı bir deney için metanefrik mezenkimin diseksiyon sırasında hasar görmemesi kritik önem taşır. Mezenkitin herhangi bir yaralanması, endüktif potensiyeli azaltır, üreterik tomurcuk dallanmasının azalmasına veya var olmamasına neden olur ve bir önyargı kaynağı olabilir. Şekil 2A&#39;daki örnek, mezenşimin neredeyse eksik olduğu bir eksplant gösterir. Üreter tomurcuğu T aşamasının ötesine geçemedi. Şekil 2B , metanefrik mezenşimin hasarının yetersiz büyümeye ve dallanmaya neden olduğu bir örneği göstermektedir. Her iki eksplant da analiz dışı bırakılmalıdır. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/55715/55715fig1.jpg" /> Şekil 1: E11.5 3 bölgede yetiştirilen ve Kümelenmiş Rekombinant EphrinB2 veya Çıplak İle Tedavi Edilen Metanefrik Böbrek Anlagenİnsan Fc&#39;sini Kontrol Olarak Kullandım. ( A ) Metanfrik böbrek anlagen, E11.5&#39;te parçalandı, 3 delik için kültürlendi ve biyotinlenmiş Dolichorus biflorus aglutinin ve Alexa488-konjüge streptavidin ile boyandı. Eksplantlar, 460-495 nm&#39;lik bir uyarım bandı geçişi, 505 nm&#39;lik bir dikromatik ayna, 510-550 nm&#39;lik bir emisyon bandı geçişi ve 20X Plan-Apokromatik lensler ile geniş alanlı bir epifloresan mikroskop ile görüntülendi. Kümelenmiş rekombinant EphrinB2&#39;nin (clEfrinB2) uygulaması, üreter tomurcuk uçlarının dallanmanın karmaşıklığını ve malformasyonunu azaltmıştır (ok başı). ( B ) Sol grafik, clEphrinB2 ile tedavi edilen ve kontrol eksplantlarındaki dallanma nesillerini göstermektedir. 4. nesil dallanma, işleme yapılan eksplantların sadece% 8&#39;inde ulaşıldı, buna karşın kontrol eksplantlarının% 35&#39;inde idi. Bölme başına bitiş noktası sayısı (orta grafik) ve alan başına bitiş noktası sayısı (sağ grafik) azaldı (dallardaki CNT başına uç noktalar, 2.1 ± 0.09; clEphrinB2, 1.7± 0.08, P = 0.007 **; Kare milimetre başına bitiş noktaları: CNT, 31 ± 0.01; ClEphrinB2, 27 ± 0.02; P = 0.04 *; N = 23). Veriler ortalama ± SEM olarak sunuldu ve eşleştirilmemiş bir Student t testi kullanıldı. Ölçek çubuğu = 100 μm. Bu rakam, Peuckert ve ark. Tarafından değiştirildi . , 2016 3 . <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55715/55715fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/55715/55715fig2.jpg" /> Şekil 2: Disseksiyon sırasında hasar gören, 3 delikli kültürlenen ve Biotinile Dolichorus Biflorus Agglutinin ve Alexa488-konjuge Streptavidin ile boyanan İki E11.5 Metanefrik Böbrek Anlagen örneği. ( A ve B ) Mezenkimanın hasarı yetersiz büyüme ve üreterik tomurcuk dallanması ile sonuçlandı,Eksplantları daha ileri analizlerden diskalifiye etme. ( A ) Metilenfrik böbrek eksplantları 3 div sonra, üreter tomurcuk dallanmaz. Sadece ilk T-kademesi dalı görünür. ( B ) Kötü üreter tomurcuk dallanarak 3 div sonra metanefrik böbrek eksplant. Ölçek çubuğu = 60 μm. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55715/55715fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Dissection and Culture of Mouse Embryonic Kidney at JoVE.com

Dissection and Culture of Mouse Embryonic Kidney

Bu protokol, fare embriyolarından metanefrik temelleri izole etmek ve kültürlemek için bir yöntem açıklamaktadır.

Fare Embriyonik Böbreklerinin Diseksiyonu ve Kültürü

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection, isolation, and culture of mouse metanephric rudiments. 
During mammalian kidney ...

dissection-and-culture-of-mouse-embryonic-kidney

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

11.9K Görüntüleme.  Uppsala University.  Bu protokol, fare embriyolarından metanefrik temelleri izole etmek ve kültürlemek için bir yöntem açıklamaktadır. 

Video: Dissection and Culture of Mouse Embryonic Kidney

Neural Tube Closure in Mouse Whole Embryo Culture

Genetic mouse models are an important tool in the study of mammalian neural tube closure (Gray &amp; Ross, 2009; Ross, 2010). However, the study of mouse embryos in utero is limited by our inability to directly pharmacologically manipulate the embryos in isolation from the effects of maternal metabolism on the reagent of interest. Whether using a small molecule, recombinant protein, or siRNA, delivery of these substances to the mother, through the diet or by injection will subject these unstable compounds to a variety of bodily defenses that could prevent them from reaching the embryo. Investigations in cultures of whole embryos can be used to separate maternal from intrinsic fetal effects on development.
Here, we present a method for culturing mouse embryos using highly enriched media in a roller incubator apparatus that allows for normal neural tube closure after dissection (Crockett, 1990). Once in culture, embryos can be manipulated using conventional in vitro techniques that would not otherwise be possible if the embryos were still in utero. Embryo siblings can be collected at various time points to study different aspects of neurulation, occurring from E7-7.5 (neural plate formation, just prior to the initiation of neurulation) to E9.5-10 (at the conclusion of cranial fold and caudal neuropore closure, Kaufman, 1992). In this protocol, we demonstrate our method for dissecting embryos at timepoints that are optimal for the study of cranial neurulation. Embryos will be dissected at E8.5 (approx. 10-12 somities), after the initiation of neural tube closure but prior to embryo turning and cranial neural fold closure, and maintained in culture till E10 (26-28 somities), when cranial neurulation should be complete.

A method allowing for direct pharmacological manipulation of mouse embryos during neurulation that bypasses maternal metabolism is described. The technique can be adapted to study different aspects of neurulation by varying the time point and pharmacological agent.

Nöral Tüp Kapatma Fare Tüm Embriyo Kültürü

Genetic mouse models are an important tool in the study of mammalian neural tube closure (Gray &amp; Ross, 2009; Ross, 2010).  However, the study of mouse ...

Nörobilim

Organ Culture and Whole Mount Immunofluorescence Staining of Mouse Wolffian Ducts

Tubal morphogenesis is a fundamental requirement for the development of most mammalian organs, including the male reproductive system. The epididymis, an integral part of the male reproductive tract, is responsible for sperm storage, maturation, and transport. The adult epididymis is a highly coiled tube that develops from a simple and straight embryonic precursor known as Wolffian duct (WD). Proper coiling of the epididymis is essential for male fertility, as sperm in the testis are unable to fertilize an oocyte. However, the mechanism responsible for epididymal development and coiling remains unclear, partially due to the lack of whole organ culture and imaging methods. In this study, we describe an in vitro culture system and whole mount immunofluorescence protocol to better visualize the process of WD coiling and development, which may also be applied to study other tubular organs.

We present a method for isolation and culture of the mouse Wolffian duct (WD). We also demonstrate a detailed procedure for whole mount immunostaining of cultured/freshly isolated WDs with fluorescently tagged antibodies. Together, these techniques enable the study of WD development, coiling, and differentiation.

Organ Kültür ve Fare Wolffian Kanallarının Tüm Dağı Immunoflorasan Boyama

Tubal morphogenesis is a fundamental requirement for the development of most mammalian organs, including the male reproductive system. The epididymis, an ...

Gelişim Biyolojisi

Optimization of Renal Organoid and Organotypic Culture for Vascularization, Extended Development, and Improved Microscopy Imaging

Embryonic kidney organotypic cultures, and especially pluripotent stem cell-derived kidney organoids, are excellent tools for following developmental processes and modelling kidney disease. However, the models are limited by a lack of vascularization and functionality. To address this, an improved protocol for the method of xenografting cells and tissues to the chorioallantoic membrane (CAM) of an avian embryo to gain vascularization and restoration of blood flow was developed. The grafts are overlaid with custom-made minireservoirs that fix the samples to the CAM and supply them with culture medium that protects the grafts from drying. The improved culture method allows xenografts to grow for up to 9 days. The manuscript also describes how to provide optimal conditions for long-term confocal imaging of renal organoids and organotypic cultures using the previously published Fixed Z-Direction (FiZD) method. This method gently compresses an embryonic organ or organoid between a glass coverslip and membrane in a large amount of medium and provides excellent conditions for imaging for up to 12 days. Together, these methods allow vascularization and blood flow to renal organoids and organotypic kidney cultures with improved confocal imaging. The methods described here are highly beneficial for studying fundamental and applied functions of kidneys ex vivo. Both methods are applicable to various types of tissues and organoids.

This work describes two methods for studying organ development, an improved xenotransplantation setup on chorioallantoic membrane (CAM) from avian embryos that allows for vascularization of cultured embryonic organs and organoids and a novel fixed z-direction organ culture method with modified experimental conditions that allows for high-resolution time-lapse confocal imaging.

Vaskülarizasyon, Uzatılmış Gelişim ve Geliştirilmiş Mikroskopi Görüntüleme için Renal Organoid ve Organotipik Kültürün Optimizasyonu

Embryonic kidney organotypic cultures, and especially pluripotent stem cell-derived kidney organoids, are excellent tools for following developmental ...

Mouse Embryonic Lung Culture, A System to Evaluate the Molecular Mechanisms of Branching

Lung primordial specification as well as branching morphogenesis, and the formation of various pulmonary cell lineages requires a specific interaction of the lung endoderm with its surrounding mesenchyme and mesothelium. Lung mesenchyme has been shown to be the source of inductive signals for lung branching morphogenesis. Epithelial-mesenchymal-mesothelial interactions are also critical to embryonic lung morphogenesis. Early embryonic lung organ culture is a very useful system to study epithelial-mesenchymal interactions. Both epithelial and mesenchymal morphogenesis proceeds under specific conditions that can be readily manipulated in this system (in the absence of maternal influence and blood flow). More importantly this technique can be readily done in a serumless, chemically defined culture media. Gain and loss of function can be achieved using expressed proteins, recombinant viral vectors and/or analysis of transgenic mouse strains, antisense RNA, as well as RNA interference gene knockdown.

Early embryonic lung organ culture is a very useful system to study epithelial-mesenchymal interactions. Both epithelial and mesenchymal morphogenesis proceeds under specific conditions that can be readily manipulated in this system.

Fare Embriyonik Akciğer Kültür, Dallanma Moleküler Mekanizmalar değerlendirin Bir Sistem

Lung primordial specification as well as branching morphogenesis, and the formation of various pulmonary cell lineages requires a specific interaction of ...

Biyoloji

Microdissection of Primary Renal Tissue Segments and Incorporation with Novel Scaffold-free Construct Technology

Kidney transplantation is now a mainstream therapy for end-stage renal disease. However, with approximately 96,000 people on the waiting list and only one-fourth of these patients achieving transplantation, there is a dire need for alternatives for those with failing organs. In order to decrease the harmful consequences of dialysis along with the overall healthcare costs it incurs, active investigation is ongoing in search of alternative solutions to organ transplantation. Implantable tissue-engineered renal cellular constructs are one such feasible approach to replacing lost renal functionality. Here, described for the first time, is the microdissection of murine kidneys for isolation of living corticomedullary renal segments. These segments are capable of rapid incorporation within scaffold-free endothelial-fibroblast constructs which may enable rapid connection with host vasculature once implanted. Adult mouse kidneys were procured from living donors, followed by stereoscope microdissection to obtain renal segments 200 - 300 &#181;m in diameter. Multiple renal constructs were fabricated using primary renal segments harvested from only one kidney. This method demonstrates a procedure which could salvage functional renal tissue from organs that would otherwise be discarded.

Tissue-engineered renal constructs provide a solution for the organ shortage and deleterious effects of dialysis. Here, we describe a protocol to micro dissect murine kidneys for isolation of cortico-medullary segments. These segments are implanted into scaffold-free cellular constructs, forming renal organoids.

Mikrodiseksiyon birincil böbrek doku parçaları ve roman iskele-Alerjik yapı teknolojisi ile birleşme

Kidney transplantation is now a mainstream therapy for end-stage renal disease. However, with approximately 96,000 people on the waiting list and only ...

Biyomühendislik

Isolation and Culture of Cells from the Nephrogenic Zone of the Embryonic Mouse Kidney

Embryonic development of the kidney has been extensively studied both as a model for epithelial-mesenchymal interaction in organogenesis and to gain understanding of the origins of congenital kidney disease. More recently, the possibility of steering na&iuml;ve embryonic stem cells toward nephrogenic fates has been explored in the emerging field of regenerative medicine. Genetic studies in the mouse have identified several pathways required for kidney development, and a global catalog of gene transcription in the organ has recently been generated <a href="http://www.gudmap.org/">http://www.gudmap.org/</a>, providing numerous candidate regulators of essential developmental functions. Organogenesis of the rodent kidney can be studied in organ culture, and many reports have used this approach to analyze outcomes of either applying candidate proteins or knocking down the expression of candidate genes using siRNA or morpholinos. However, the applicability of organ culture to the study of signaling that regulates stem/progenitor cell differentiation versus renewal in the developing kidney is limited as cultured organs contain a compact extracellular matrix limiting diffusion of macromolecules and virus particles. To study the cell signaling events that influence the stem/progenitor cell niche in the kidney we have developed a primary cell system that establishes the nephrogenic zone or progenitor cell niche of the developing kidney ex vivo in isolation from the epithelial inducer of differentiation. Using limited enzymatic digestion, nephrogenic zone cells can be selectively liberated from developing kidneys at E17.5. Following filtration, these cells can be cultured as an irregular monolayer using optimized conditions. Marker gene analysis demonstrates that these cultures contain a distribution of cell types characteristic of the nephrogenic zone in vivo, and that they maintain appropriate marker gene expression during the culture period. These cells are highly accessible to small molecule and recombinant protein treatment, and importantly also to viral transduction, which greatly facilitates the study of candidate stem/progenitor cell regulator effects. Basic cell biological parameters such as proliferation and cell death as well as changes in expression of molecular markers characteristic of nephron stem/progenitor cells in vivo can be successfully used as experimental outcomes. Ongoing work in our laboratory using this novel primary cell technique aims to uncover basic mechanisms governing the regulation of self-renewal versus differentiation in nephron stem/progenitor cells.

In this report we describe a method for the isolation and culture of the progenitor cell niche from the embryonic mouse kidney that can be used to study signaling pathways regulating stem/progenitor cells of the developing kidney. These cultured cells are highly accessible to small molecule and recombinant protein treatment, and importantly also to viral transduction, which allows efficient manipulation of candidate pathways.

Embriyonik Fare Böbrek Nefrojenik Zone Hücreleri İzolasyon ve Kültür

Embryonic development of the kidney has been extensively studied both as a model for epithelial-mesenchymal interaction in organogenesis and  to gain ...

Isolation and Culture of Embryonic Mouse Neural Stem Cells

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and expansion of NSCs provide a suitable source of cells for neuroscientists to study the function of neurons and glial cells along with their interactions. There are several reported techniques for the isolation of neural stem cells from adult or embryo mammalian brains. During the microsurgical operation to isolate NSCs from different regions of the embryonic CNS, it is very important to reduce the damage to the brain cells to obtain the highest ratio of live and expandable stem cells. A possible technique for stress reduction during isolation of these cells from the mouse embryo brain is the reduction of surgical time. Here, we demonstrate a developed technique for rapid isolation of these cells from the E13 mouse embryo ganglionic eminence. Surgical procedures include harvesting E13 mouse embryos from the uterus, cutting the frontal fontanelle of the embryo with a bent needle tip, extracting the brain from the skull, microdissection of the isolated brain to harvest the ganglionic eminence, dissociation of the harvested tissue in NSC medium to gain a single cell suspension, and finally plating cells in suspension culture to generate neurospheres.

Here, we introduce a novel microsurgical technique for the isolation of neural stem cells from the E13 mouse embryo ganglionic eminence.

Yalıtım ve kültür embriyonik fare nöral kök hücrelerin

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and ...

Mouse Embryonic Development in a Serum-free Whole Embryo Culture System

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in an oxygenated rolling bottle culture system. Mouse embryos at E10.5 were carefully isolated from the uterus with intact yolk sac and in a process involving precise surgical maneuver the embryos were gently exteriorized from the yolk sac while maintaining the vascular continuity of the embryo with the yolk sac. Compared to embryos prepared with intact yolk sac or with the yolk sac removed, these embryos exhibited superior survival rate and developmental progression when cultured under similar conditions. We show that these mouse embryos, when cultured in a defined medium in an atmosphere of 95% O2 / 5% CO2 in a rolling bottle culture apparatus at 37 &#176;&#8203;C for 16-40 hr, exhibit morphological growth and development comparable to the embryos developing in utero. We believe this method will be useful for investigators needing to utilize whole embryo culture to study signaling interactions important in embryonic organogenesis.

Serum utilized in embryo cultures contains unknown components that can affect the outcome of experiments especially in studies involving signaling interactions. Here we utilized a serum-free oxygenated culture system and show that mid-gestation mouse embryos cultured for 16-40 hr&#160;exhibit morphological development comparable to embryos developing in utero.

Serumsuz Tüm Embriyo Kültür Sistemde Fare Embriyonik Development

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in ...

Glomerular Outgrowth as an Ex Vivo Assay to Analyze Pathways Involved in Parietal Epithelial Cell Activation

Parietal epithelial cell (PEC) activation is one of the key factors involved in the development and progression of glomerulosclerosis. Inhibition of pathways involved in parietal epithelial cell activation could therefore be a tool to attenuate the progression of glomerular diseases. This article describes a method to culture and analyze parietal epithelial cell outgrowth of encapsulated glomeruli isolated from mouse kidney. After dissecting isolated mouse kidneys, the tissue is minced, and glomeruli are isolated by sieving. Encapsulated glomeruli are collected, and single glomeruli are cultured for 6 days to obtain glomerular outgrowth of parietal epithelial cells. During this period, parietal epithelial cell proliferation and migration can be analyzed by determining the cell number or the surface area of outgrowing cells. This assay can therefore be used as a tool to study the effects of an altered gene expression in transgenic- or knockout-mice or the effects of culture conditions on parietal epithelial cell growth characteristics and signaling. Using this method, important pathways involved in the process of parietal epithelial cell activation and consequently in glomerulosclerosis can be studied.

This article describes a method for culturing and analyzing glomerular parietal epithelial cell outgrowths of encapsulated glomeruli isolated from mouse kidney. This method can be used to study pathways involved in parietal epithelial cell proliferation and migration.

Parietal Epitel Hücre Aktivasyonunda Yer Alan Yolları Analiz Etmek Için Ex Vivo Analizi olarak Glomerüler Büyüme

Parietal epithelial cell (PEC) activation is one of the key factors involved in the development and progression of glomerulosclerosis. Inhibition of ...

Efficient Dissection and Culture of Primary Mouse Retinal Pigment Epithelial Cells

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to understand the pathophysiology of ocular diseases because of their similarities with human anatomy and physiology. Alterations in the retinal pigment epithelium (RPE), including changes in morphology and function, are common features shared by many ocular disorders. However, successful isolation and culture of primary mouse RPE cells is very challenging. This paper is an updated audiovisual version of the protocol previously published by Fernandez-Godino et al. in 2016 to efficiently isolate and culture primary mouse RPE cells. This method is highly reproducible and results in robust cultures of highly polarized and pigmented RPE monolayers that can be maintained for several weeks on Transwells. This model opens new avenues for the study of the molecular and cellular mechanisms underlying eye diseases. Moreover, it provides a platform to test therapeutic approaches that can be used to treat important eye diseases with unmet medical needs, including inherited retinal disorders and macular degenerations.

This protocol, which was originally reported by Fernandez-Godino et al. in 20161, describes a method to efficiently isolate and culture mouse RPE cells, which form a functional and polarized RPE monolayer within one week on Transwell plates. The procedure takes approximately 3 hours.

Birincil Fare Retina Pigment Epitel Hücrelerinin Verimli Diseksiyonu ve Kültürü

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to ...