Bu çalışma kısmen O.S.A.'ya yönlendirilen UCSD başlangıç fonları tarafından desteklenmiştir.

1. C. quinquefasciatus koloni yetiştirme
<ol><li>Böcek yurdu kafeslerinde C. quinquefasciatus yetişkinlerinin birden fazla kolonisi kurun. NOT: Koloniler Cornell Üniversitesi20'deDr. Laura Harrington tarafından sağlanmıştır. Culex sivrisineklerinin yetiştirilmesi için ayrıntılı protokoller diğer literatürde bulunabilir21.<ol>
<li>Sivrisinekleri 25 ± 1 °C'de% 30 nemde 12:12 saat gündüz:gece döngüsü ile koruyun.</li>
		<li>Kafese fitili olan bir şeker çözelti kabı sokarak veya pamuk toplarını şeker çözeltisi ile doyurarak ve kafesin içine yerleştirerek% 20 şeker çözeltisi reklam libitum sağlayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sivrisineklerin kan beslemeden önce en az 3 gün çiftleşmelerine izin verin(Şekil 2A).</li>
</ol>2. C. quinquefasciatus blastoderm öncesi evre embriyoların toplanması
<ol><li>Eklozyondan 3-6 gün sonra, dişilere sentetik bir zardan 1-2 mL sitratlanmış sığır kan unu sağlayın ve bir kan besleme sisteminde yaklaşık 40 ° C'ye ısıtın (Şekil 2B). Culex sivrisinekleri için kullanılabilecek alternatif kan besleme protokolleri de vardır (örneğin, bkz.hakem 21). NOT: C. quinquefasciatus kuş kanı tercihi ile bilinir. Bazı laboratuvarlar kan yemek kaynakları21 , 22,23için uyuşturulmuş canlı kuşlar veya kuş kanı kullanır. Bununla birlikte, bu özellik birden fazla nesil için seçilirse, koloniler sığır kanı veya küçük kemirgenlerle beslenmek için eğitilebilir / seçilebilir.<ol>
<li>Kadınların kan beslemeden sonra en az 3 gün dinlenmesine izin verin, mikroenjeksiyon deneyleri için yumurtlamayı teşvik etmeden önce oogenez ve yumurta olgunlaşması geçirin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Embriyonik mikroenjections gününde, organik olarak aşılanmış yumurtlama suyu ile bir yumurtlama kabı oluşturun. Yumurtlama suyu, tavşan dışkısı (50 g/L), ayrışan ot (4,5 g/L) veya balık yemi (25 g/L) fermente edilerek 5 veya daha fazla gün boyunca sudayapılmalıdır 24,25.</li>
	<li>Yumurtlama kabını kafese yerleştirin ve tüm kafesi karanlık bir yere yerleştirin (Şekil 2C).</li>
	<li>Her 30 dakikada bir, yumurta salları için fincanı kontrol edin.<ol>
<li>Yumurta salları varsa, salları bir boya fırçası ile kepçeleyarak toplayın ve ıslak bir filtre kağıdına yerleştirin (Şekil 2D,E).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. C. quinquefasciatus blastoderm öncesi evre embriyolarının hizalanması
<ol><li>Yumurtaları salın üzerine bastırarak ve ince uçlu bir boya fırçası ve toskunluk kullanarak yumurtaları ayrı ayrı sataşarak sallardan ayırın (Şekil 2E).</li>
	<li>Tek tek yumurtaları, cam bir slaydın üstüne yerleştirilmiş ince bir çift taraflı yapışkan bant şeridine hizalayın (Şekil 2F).</li>
	<li>Hizalama yaparken, daha kolay erişilebilirlik için her yumurtanın ön tarafını aynı yöne yönlendirmeye çalışın. NOT: Çift taraflı yapışkan bant içermeyen alternatif bir yumurta hizalama yöntemi daha önce yayınlanan bir Nasonia vitripennis embriyo mikroenjeksiyonprotokolünde bulunabilir 26.</li>
	<li>Yumurtaları halokarbon yağ karışımı ile örtün. NOT: Halokarbon karışımı, iki halokarbon reaktifi ve suyu (9:1:20, halokarbon 700 : halokarbon 27 : Ultra saf su) hafifçe karıştırarak ve ardından halokarbon yağının su doygunluğunu kolaylaştırmak için karışımı gece boyunca 25οC'de inkübe ederek önceden hazırlanabilir.</li>
</ol>4. Mikroenjections için iğne hazırlama
<ol><li>Bir cam mikropipette puller kullanarak alümilikat kılcal cam iğneleri oluşturun.<ol>
<li>İğne çekmenin kullanım kılavuzundan alınan talimatlara göre, iğne çekme makinesine bir aluminosilikat kılcal cam yerleştirin. NOT: Kuvars ve borosilikat kılcal iğneler de kullanılabilir, ancak bu deney için alüminasilikat, nispeten uygun fiyatlılığı ve dayanıklılığı nedeniyle tercih edilir.</li>
		<li>Irdat'ı 516'ya, Hızı 100'e, Gecikmeyi 70'e, 97'ye ve Basıncı iğne çekeceğinde 500'e ayarlayın.</li>
		<li>Çekme talimatlarına göre iğne çekmeyi etkinleştirin ve ek iğneler için gerektiği gibi tekrarlayın. NOT: Enjeksiyon işlemi sırasında, iğneler genellikle tıkanır veya yanlışlıkla kırılır, bu nedenle tek bir deney için ek iğnelerin çekilmesi şiddetle tavsiye edilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dönen elmas aşındırıcı plaka üzerindeki çekilen iğnenin ucuna 50° açıyla yaklaşık 10 sn boyunca hafifçe dokunarak iğne ucunu eğimli yapın. NOT: İğneyi eğimli hale getirmek, sıvının akmasını sağlamak için açar ve aynı zamanda embriyoya daha kolay nüfuz etmek için daha keskin bir uç oluşturur. Uygun bir iğne örneği önceki bir makalede görülebilir26.</li>
	<li>Çekilen ve eğimli iğneleri petri kabına modelci kilinin çizgilerine gömerek saklayın. NOT: İğne uçları için en iyi kaliteyi sağlamak için iğneler enjeksiyon zamanına mümkün olduğunca yakın bir şekilde taze çekilmeli ve eğimlenmelidir.</li>
</ol>5. Enjeksiyon karışımının yüklenmesi
<ol><li>Genom modifikasyon reaktiflerinden (örneğin, 200 ng/μL sgRNA ve 200 ng/μL Cas9 karışımı) oluşan enjeksiyon karışımını veya tercih edilen enjeksiyon çözeltilerini hazırlayın ve buz üzerinde tutun. NOT: Bu karışım yumurtaların atılmasını beklerken hazırlanabilir. Cas9 ve sgRNA üretimi ve mikroenjeksiyon için hazırlık hakkında daha fazla ayrıntı önceki yayınlarda bulunabilir27,28,29,30.</li>
	<li>Bir mikro doldurucu ucu kullanarak enjeksiyon iğnesine 2 μL enjeksiyon karışımı yükleyin.</li>
</ol>6. Mikroenjeksiyon kurulumu
<ol><li>Doldurulmuş enjeksiyon iğnesini elektronik bir mikroenjektöre bağlı olarak kurulmuş bir mikromanipülatöre yerleştirin.</li>
	<li>Hizalanmış yumurtaları içeren cam slaydı bileşik bir mikroskop aşamasına yerleştirin.</li>
	<li>Mikromanipülatör ve bileşik mikroskobu kullanarak, iğneyi embriyonun arka ucuna 25-35 ° açıyla nişan almak için hizalayın.</li>
</ol>7. Embriyo mikroenjeksiyon (Şekil 2G)
<ol><li>İğneyi embriyoya dikkatlice yerleştirin ve karışımı embriyo hacminin yaklaşık% 10'u kadar bir miktara enjekte edin (yumurtaların büyüklüğüne bağlı olarak 700-800 pL). NOT: Enjekte ederken yumurta hafifçe şişmelidir, ancak çok fazla sıvı enjekte edilirse yumurta patlayabilir veya sitoplazmik sıvı dışarı sızabilir.</li>
	<li>Bir seferde yaklaşık 20 yumurta enjekte edin, ardından embriyo kurtarma prosedürlerini durdurun ve gerçekleştirin. NOT: Enjekte ederken, iğnelerin tıkanma veya kırılma olasılığı yüksektir. İğneden akan enjeksiyon sıvısı eksikliği ile belirlenebilecek bir tıkanıklık meydana gelirse, ya elektronik mikroenjektör üzerindeki temiz fonksiyonla iğneyi temizlemeyi deneyin ya da iğneyi yeniden beveling deneyin. Her iki adım da işe yaramazsa, hazırlanan yumurtaların nemlendirilmesini sağlarken hızla yeni bir iğneye geçin.</li>
</ol>8. Embriyo kurtarma ve kuluçkalama
<ol><li>Yumurtaları en az 5 dakika bozulmadan bırakın. Enjeksiyondan 20 dakika sonra, temiz bir boya fırçası ile hafifçe fırçalayarak halokarbon yağını dikkatlice çıkarın (Şekil 2H).</li>
	<li>Yumurtaları bir boya fırçası kullanarak hafifçe kaldırın ve bir fincan çift damıtılmış suya yerleştirin (Şekil 2I). Yumurtaları su yüzeyinde tutmaya özen edin.</li>
	<li>Yumurtaları kuluçka için günlük 7 gün boyunca kontrol edin (Şekil 2J).</li>
	<li>Normal larva yetiştirme prosedürlerini izleyin21.</li>
</ol>9. Genom modifikasyonu taraması
<ol><li>Enjekte edilen sivrisinekleri stereoskop kullanarak mutant fenotipler içintarayın ( Şekil 2K).<ol>
<li>Kolayca tanınabilir bir fenotipe sahip olmayan mutasyonları PCR amplifikasyonu, T7 Endonuclease I tahlil ve hedef bölgenin alt kavunlanmasıyla doğrulayın31.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mikrop içindeki kalıtsal mutasyonları tespit etmek için enjekte edilen bireyler arasında ek haçlar kurun.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Final Cumulative Maps and Data | West Nile Virus. CDC Available from: <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/westnile/statsmaps/cumMapsData.html#eight">https://www.cdc.gov/westnile/statsmaps/cumMapsData.html#eight</a> (2019)</li><li>APHIS | West Nile Virus (WNV). USDA Available from: <a target="_blank" href="https://www.aphis.usda.gov/aphis/ourfocus/animalhealth/animal-disease-information/equine/wnv">https://www.aphis.usda.gov/aphis/ourfocus/animalhealth/animal-disease-information/equine/wnv</a> (2020)</li><li>Luke George, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+impacts+of+West+Nile+virus+on+North+American+bird+populations.">Persistent impacts of West Nile virus on North American bird populations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (46), 14290-14294 (2015).</li><li>van Riper, C., van Riper, S. G., Lee Goff, M., Laird, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Epizootiology+and+Ecological+Significance+of+Malaria+in+Hawaiian+Land+Birds.">The Epizootiology and Ecological Significance of Malaria in Hawaiian Land Birds.</a> Ecological Monographs. 56 (4), 327-344 (1986).</li><li>Liao, W., Atkinson, C. T., LaPointe, D. A., Samuel, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitigating+Future+Avian+Malaria+Threats+to+Hawaiian+Forest+Birds+from+Climate+Change.">Mitigating Future Avian Malaria Threats to Hawaiian Forest Birds from Climate Change.</a> PloS One. 12 (1), 0168880 (2017).</li><li>Martins, W. F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic+analysis+of+insecticide+resistance+in+the+lymphatic+filariasis+vector+Culex+quinquefasciatus.">Transcriptomic analysis of insecticide resistance in the lymphatic filariasis vector Culex quinquefasciatus.</a> Scientific Reports. 9 (1), 11406 (2019).</li><li>Norris, L. C., Norris, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insecticide+resistance+in+Culex+quinquefasciatus+mosquitoes+after+the+introduction+of+insecticide-treated+bed+nets+in+Macha,+Zambia.">Insecticide resistance in Culex quinquefasciatus mosquitoes after the introduction of insecticide-treated bed nets in Macha, Zambia.</a> Journal of Vector Ecology: Journal of the Society for Vector Ecology. 36 (2), 411-420 (2011).</li><li>Corbel, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+insecticide+resistance+mechanisms+in+Anopheles+gambiae+and+Culex+quinquefasciatus+from+Benin,+West+Africa.">Multiple insecticide resistance mechanisms in Anopheles gambiae and Culex quinquefasciatus from Benin, West Africa.</a> Acta tropica. 101 (3), 207-216 (2007).</li><li>Yadoul&#233;ton, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insecticide+resistance+status+in+Culex+quinquefasciatus+in+Benin.">Insecticide resistance status in Culex quinquefasciatus in Benin.</a> Parasites &amp; Vectors. 8, 17 (2015).</li><li>Atyame, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wolbachia-based+population+control+strategy+targeting+Culex+quinquefasciatus+mosquitoes+proves+efficient+under+semi-field+conditions.">Wolbachia-based population control strategy targeting Culex quinquefasciatus mosquitoes proves efficient under semi-field conditions.</a> PloS One. 10 (3), 0119288 (2015).</li><li>Atyame, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+incompatibility+as+a+means+of+controlling+Culex+pipiens+quinquefasciatus+mosquito+in+the+islands+of+the+south-western+Indian+Ocean.">Cytoplasmic incompatibility as a means of controlling Culex pipiens quinquefasciatus mosquito in the islands of the south-western Indian Ocean.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 5 (12), 1440 (2011).</li><li>Almeida, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Wolbachia+on+fitness+of+Culex+quinquefasciatus+(Diptera;+Culicidae).">Effects of Wolbachia on fitness of Culex quinquefasciatus (Diptera; Culicidae).</a> Infection, Genetics and Evolution: Journal of Molecular Epidemiology and Evolutionary Genetics in Infectious Diseases. 11 (8), 2138-2143 (2011).</li><li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+confinable+gene+drive+system+in+the+human+disease+vector+Aedes+aegypti.">Development of a confinable gene drive system in the human disease vector Aedes aegypti.</a> eLife. 9, 51701 (2020).</li><li>Phuc, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Late-acting+dominant+lethal+genetic+systems+and+mosquito+control.">Late-acting dominant lethal genetic systems and mosquito control.</a> BMC Biology. 5, 11 (2007).</li><li>Kyrou, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CRISPR-Cas9+gene+drive+targeting+doublesex+causes+complete+population+suppression+in+caged+Anopheles+gambiae+mosquitoes.">A CRISPR-Cas9 gene drive targeting doublesex causes complete population suppression in caged Anopheles gambiae mosquitoes.</a> Nature Biotechnology. 36 (11), 1062-1066 (2018).</li><li>Gantz, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+Cas9-mediated+gene+drive+for+population+modification+of+the+malaria+vector+mosquito+Anopheles+stephensi.">Highly efficient Cas9-mediated gene drive for population modification of the malaria vector mosquito Anopheles stephensi.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (49), 6736-6743 (2015).</li><li>Buchman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+resistance+to+Zika+virus+in+transgenic+expressing+a+polycistronic+cluster+of+synthetic+small+RNAs.">Engineered resistance to Zika virus in transgenic expressing a polycistronic cluster of synthetic small RNAs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (9), 3656-3661 (2019).</li><li>Buchman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broad+dengue+neutralization+in+mosquitoes+expressing+an+engineered+antibody.">Broad dengue neutralization in mosquitoes expressing an engineered antibody.</a> PLoS Pathogens. 16 (1), 1008103 (2020).</li><li>Isaacs, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+resistance+to+Plasmodium+falciparum+development+in+transgenic+Anopheles+stephensi.">Engineered resistance to Plasmodium falciparum development in transgenic Anopheles stephensi.</a> PLoS Pathogens. 7 (4), 1002017 (2011).</li><li>Liu, N., Li, T., Reid, W. R., Yang, T., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+Cytochrome+P450+genes:+their+constitutive+overexpression+and+permethrin+induction+in+insecticide+resistant+mosquitoes,+Culex+quinquefasciatus.">Multiple Cytochrome P450 genes: their constitutive overexpression and permethrin induction in insecticide resistant mosquitoes, Culex quinquefasciatus.</a> PloS One. 6 (8), 23403 (2011).</li><li>Kauffman, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rearing+of+Culex+spp.+and+Aedes+spp.+Mosquitoes.">Rearing of Culex spp. and Aedes spp. Mosquitoes.</a> Bio Protocols. 7 (17), 2542 (2017).</li><li>Richards, S. L., Anderson, S. L., Yost, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+blood+meal+source+on+the+reproduction+of+Culex+pipiens+quinquefasciatus+(Diptera:+Culicidae).">Effects of blood meal source on the reproduction of Culex pipiens quinquefasciatus (Diptera: Culicidae).</a> Journal of Vector Ecology: Journal of the Society for Vector Ecology. 37 (1), 1 (2012).</li><li>Kitzmiller, J. B., Micks, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+Rearing+Culex+Mosquitoes.">Techniques for Rearing Culex Mosquitoes.</a> American Midland Naturalist. 52 (1), 253 (1954).</li><li>Mordue, A. J., Blackwell, A., Hansson, B. S., Wadhams, L. J., Pickett, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioural+and+electrophysiological+evaluation+of+oviposition+attractants+for+Culex+quinquefasciatus+say+(Diptera:+Culicidae).">Behavioural and electrophysiological evaluation of oviposition attractants for Culex quinquefasciatus say (Diptera: Culicidae).</a> Experientia. 48 (11-12), 1109-1111 (1992).</li><li>Allgood, D. W., Yee, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oviposition+preference+and+offspring+performance+in+container+breeding+mosquitoes:+evaluating+the+effects+of+organic+compounds+and+laboratory+colonisation.">Oviposition preference and offspring performance in container breeding mosquitoes: evaluating the effects of organic compounds and laboratory colonisation.</a> Ecological Entomology. 42 (4), 506-516 (2017).</li><li>Li, M., Bui, M., Akbari, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryo+Microinjection+and+Transplantation+Technique+for+Nasonia+vitripennis+Genome+Manipulation.">Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation.</a> Journal of Visualized Experiments. (130), e56990 (2017).</li><li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+heritable+germline+mutations+in+the+jewel+wasp+Nasonia+vitripennis+using+CRISPR/Cas9.">Generation of heritable germline mutations in the jewel wasp Nasonia vitripennis using CRISPR/Cas9.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-7 (2017).</li><li>Li, M., Akbari, O. S., White, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Efficient+Site-Specific+Mutagenesis+in+Malaria+Mosquitoes+Using+CRISPR.">Highly Efficient Site-Specific Mutagenesis in Malaria Mosquitoes Using CRISPR.</a> Genes, Genomes, Genetics. 8 (2), 653-658 (2018).</li><li>Li, M., Bui, M., Yang, T., White, B. J., Akbari, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+Cas9+Expression+Yields+Highly+Efficient+Genome+Engineering+in+a+Major+Worldwide+Disease+Vector,+Aedes+aegypti.">Germline Cas9 Expression Yields Highly Efficient Genome Engineering in a Major Worldwide Disease Vector, Aedes aegypti.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (49), 10540-10549 (2017).</li><li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+generation+of+heritable+germline+mutations+in+the+disease+vector+Culex+quinquefasciatus+using+clustered+regularly+interspaced+short+palindrome+repeats-associated+protein+9.">Methods for the generation of heritable germline mutations in the disease vector Culex quinquefasciatus using clustered regularly interspaced short palindrome repeats-associated protein 9.</a> Insect Molecular Biology. 29 (2), 214-220 (2020).</li><li>New England Biolabs Determining Genome Targeting Efficiency using T7 Endonuclease I. NEB Available from: <a target="_blank" href="https://www.neb.com/protocols/2014/08/11/determining-genome-targeting-efficiency-using-t7-endonuclease-i">https://www.neb.com/protocols/2014/08/11/determining-genome-targeting-efficiency-using-t7-endonuclease-i</a> (2020)</li></ol>

Sivrisinek vektör kontrolü için genetik olarak tasarlanmış araçlar üretme çabalarıyla, yaygın sivrisinek hastalığı vektörleri için embriyo mikroenjeksiyon protokolleri geliştirmeye ve optimize etmeye ihtiyaç vardır. Aedes ve Anopheles sivrisinekleri için yöntemler geliştirilmiş olsa da, Culex için özel olarak tasarlanmış bir protokol minimal olarak araştırıldı. Genel olarak sivrisinek embriyo enjeksiyon protokolleri 3 genel adıma ayrılabilir: 1) embriyo toplama ve hazırlama, 2) embriyo enjeksiyonu ve 3) enjeksiyon sonrası iyileşme. Mutantların başarılı bir şekilde üretilebilmesi için, üç adımın da hedef türler için optimize edilmesi gerekir. Embriyo mikroenjeksiyon için bu değiştirilmiş protokol, Culex sivrisineklerinin başarılı genom mühendisliği için özeldir.
Embriyo toplamayı en üst düzeye çıkarmak embriyo mikroenjeksiyon protokollerinde yaygın bir darboğazdır. Kısa sürede toplanan yumurta sayısını artırmak için, sivrisinekler kan unu sonrası 2-3 gün boyunca bir yumurtlama substratından kısıtlandı. C. quinquefasciatus'un memeli kaynaklarının veya memeli kanıyla beslenen membranların aksine kuş kan kaynaklarını tercih etme eğiliminde olduğunu belirtmek önemlidir. Bununla birlikte, birçok araştırmacı kan beslemek için güvenilir bir canlı kuş veya kuş kanı kaynağı elde etmekte zorlanabilir, bu nedenle laboratuvar stokları daha erişilebilir kan kaynaklarıyla beslenmek için uyarlanabilir. C. quinquefasciatus ve diğer çoğu Culex vektörü için yumurtlama ipuçları sağladığından, yumurtlama substratı için besin bakımından zengin su kullanmak da çok önemlidir. Mikroenjeksiyon için uygun sayıda yumurtanın mevcut olduğundan emin olmak için laboratuvarlar arasında optimize edilmesi gerekebilecek besin bakımından zengin su üretmek için birçok yöntem vardır. Örneğin, bu yöntem 5 veya daha fazla gün boyunca deiyonize suda fermente edilen tavşan dışkısı ile en başarılı olsa da, diğer araştırmacılar besin kaynağı olarak ot veya balık yemi ve hatta bazıları damıtılmış su ile daha fazla başarıya sahiptir21.
Culex sivrisinekleri sallara yumurta grupları bıraktığından, yumurta toplamak oldukça basittir. Yumurtalar, tüm salı bir boya fırçasıyla kepçeleyarak basitçe toplanabilir. Yumurta ayrımı daha karmaşıktır, ancak başarılı enjeksiyon için gereklidir. Yumurtalar, boya fırçası veya toskun ile yumurtalar arasında hafif aşağı doğru basınç uygulanarak saldan dikkatlice ayrılabilir. Bazı uygulamalarla, birden fazla kullanıcı tek yumurtaları yumurta sallarından güvenilir bir şekilde ayırabildi. Her yumurtayı ayırdıktan sonra, yumurtalar mikroenjeksiyon sırasında yumurtaları stabilize eden çift taraflı yapışkan bantta aynı yönde hizalanır. Yumurtalar konik arka uca enjekte edilir ve halokarbon yağının eklenmesi, manipülasyon sırasında yumurtaları nemli tutar.
Mikroenjeksiyon sırasında embriyo hasarını sınırlamak için enjeksiyon iğnelerinin uygun mukavemete sahip olması ve uygun bir açıyla eğimli olması gerekir. 50° açıyla 10 saniye boyunca eğimli alümilikat iğneler en iyi sonuçlara sahipti, ancak borosilikat ve kuvars iğneler daha az dayanıklı ve daha pahalı olsalar da da çalışabilir. Ek olarak, uygun iğne eğimi Cas9 ve sgRNA karışımlarının daha iyi akışını kolaylaştırır ve embriyoya daha kolay nüfuz etmek için daha keskin bir nokta oluşturur. Çoğu durumda, eğim, tıkanmış iğneleri değiştirmek için zaman ve çaba harcamak yerine tıkanmış iğneleri hızlı bir şekilde düzeltmenin etkili bir yoludur.
Enjeksiyondan sonra, yumurtalar en az 5 dakika bozulmadan kalmalı ve halokarbon yağı hemen ardından temiz bir boya fırçası ile hafifçe fırçalanarak çıkarılmalıdır. Halokarbon yağının çıkarılmasından sonra, enjekte edilen yumurtalar, tipik olarak enjeksiyondan sonraki 3 gün içinde meydana gelen yumurtadan çıkmak için suya yerlenebilir. Pratik ve yeterli sayıda yumurta ile, bu protokol C. quinquefasciatus'ta tutarlı somatik ve germline mutasyonları elde edebilir ve diğer Culex sivrisineklerine kolayca adapte olması gereken kadar çok yönlüdür.

C. quinquefasciatus, genellikle güney evi sivrisinek olarak bilinen, Batı Nil virüsü (WNV), Japon ensefalit, Saint Louis ensefaliti ve Doğu at ensefaliti dahil olmak üzere çok sayıda patojenin yetkin bir vektörüdür. Özellikle, 1999'da New York'ta ilk kez tespit edildiğinden beri, WNV, 1999 ve 2018 yılları arasında yaklaşık 2.300 ölümle sonuçlanan 50.000'den fazla insan vakası ve 2008-2019 yılları arasında bildirilen 4.500'den fazla at vakası ile kıta Amerika Birleşik Devletleri (ABD) genelinde önemli bir vektör kaynaklı hastalık halinegelmiştir. Buna ek olarak, Kuzey Amerika'da bulunan en az 23 kuş türü, WNV3'ünbir sonucu olarak kurtarılamaz olarak sınıflandırılan en az 12 tür ile WNV enfeksiyonlarından etkilenmiştir. WNV'nin insan, at ve kuş popülasyonları üzerindeki etkisi, vektörlerinin fırsatçı beslenme davranışından kaynaklanmaktadır. Tipik olarak, kuşlar WNV için birincil konaktır ve insanlar ve atlar tesadüfi veya çıkmaz konaklardır. C. quinquefasciatus tarafından vektörlenen bazı patojenler sadece kuş sıtma paraziti, Plasmodium relictumgibi kuşları enfekte eder. Hawaii'de, C. quinquefasciatus kuş sıtmasının ana vektörüdür ve birçok yerli kuş türünün neslinin tükenmesine neden olmuştur4,5.
C. quinquefasciatustarafından bulaşan hastalıkları kontrol etmek için, araştırmacılar ve vektör kontrol ajansları insektisit uygulaması6gibi yaygın olarak kurulmuş sivrisinek popülasyon kontrol araçlarını kullanmıştır , ancak, bu yöntemler türlere özgü değildir ve birçok C. quinquefasciatus popülasyonunda insektisitlere karşı direnç yüksek olduğu için sınırlıetkilidir. Wolbachiatabanlı nüfus kontrol stratejileri gibi diğer kontrol teknikleri son yıllardageliştirilmiştir 10,11, ancak Wolbachia enfeksiyonu ile ilişkili fitness maliyetleri bu vektör için bu yaklaşımın fizibilitesini sınırlamak12. Aedes aegypti13 , 14, Anopheles gambiae15 ve Anopheles stephensi16gibi diğer sivrisinek türlerinde geliştirilen genetik tabanlı kontrol yöntemleri de vardır , patojene dirençli sivrisineklerin geliştirilmesi de dahil olmak üzere17,18,19, gerekli genom mühendisliği araçları ise C. quinquefasciatus için de geliştirilebilir bu tür için geliştirilmiştir. Bununla birlikte, C. quinquefasciatus biyolojisi, bu vektörde benzer genetik teknolojilerin geliştirilmesini zorlaştıran diğer Aedes ve Anopheles sivrisinek vektörlerinden büyük ölçüde farklıdır. CRISPR tabanlı genom mühendisliği teknolojilerinin ortaya çıkmasıyla, hassas genom mühendisliği giderek daha önemsiz, uygun fiyatlı ve uyarlanabilir hale geldi ve sonuç olarak çok çeşitli türlerde yeni genetik araçların geliştirilmesine yol açtı.
CRISPR tabanlı teknolojilerle mutasyonlar üretmek için, istenen lociyi tamamlayan Cas9 proteini ve sentetik kılavuz RNA (sgRNA) karışımı, blastoderm öncesi evre embriyolara mikroenjakt edilir. C. quinquefasciatus dişileri yumurtalarını yüzen bir sal yapısına bağlı gruplar halinde bıraktıklarından (Şekil 1), Aedes ve Anopheles sivrisineklerinin bir özelliği olan ovipositing bireysel yumurtaların aksine, embriyo mikroenjections bu türlerde giderek daha karmaşık hale gelir. Culex larvaları da su yüzeyi ile temas halinde olan her yumurtanın ön tarafından ortaya çıkar (Şekil 1), bu nedenle yumurta yönelim sonrası manipülasyon bu türlerde önemlidir. Burada Cas9 proteini ve sgRNA'nın C. quinquefasciatus embriyolarına mikroenjeksiyonu için tasarlanmış ayrıntılı bir protokolü açıklıyoruz. Bu protokol, zamanında yumurta toplama ve yumurta hayatta kalma için anahtar olan belirli adımlarla embriyo sağkalım ve genom mutasyon oranlarını iyileştirmek için Culex biyolojisine özgü özellikleri barındıracak şekilde tasarlanmıştır.

<table><tbody><tr><td>9 oz clear plastic pet cup</td><td>Karat</td><td>C-KC9</td><td>Insect Rearing and Egg Collection</td></tr><tr><td>Aluminosilicate glass capillary tubing 1mm(outside diameter) X 0.58mm (inner diameter)</td><td>Sutter Instruments</td><td>BF100-58-10</td><td>Microinjection, borosilicate and quartz needles could also be used but we prefered aluminosilicate</td></tr><tr><td>Blood</td><td>Colorado Serum Company</td><td>31025</td><td>The colony took multiple generations to adapt to this blood source. Other blood sources are likely just as appropriate. See protocol notes on blood source selection.</td></tr><tr><td>Bugdorm</td><td>Bugdorm</td><td>4F2222</td><td>Insect Rearing Cage</td></tr><tr><td>Cas9 Protein with NLS</td><td>PNABio</td><td>CP01</td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>Compound Microscope</td><td>Olympus BX41</td><td></td><td>Microinjection, for embryo injection</td></tr><tr><td>Diamond abrasive plate (0.7u to 2.0u tip sizes)</td><td>Sutter Instruments</td><td>104E</td><td>Microinjection, to be used with beveler</td></tr><tr><td>DNase/RNase-Free distilled Water</td><td>Invitrogen</td><td>10977-015</td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>Double-sided Tape</td><td>Scotch</td><td>B084NVQGXD</td><td>Microinjection, embryo alignment</td></tr><tr><td>Femtojet 4x or 4i programmable microinjector</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>Femtotips Microloader tips</td><td>Fisher Scientific</td><td>E5242956003</td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>Filter Paper</td><td>Whatman</td><td>1001-090</td><td>Microinjection, embryo collection</td></tr><tr><td>Fine-tip paintbrush</td><td>ZEM</td><td>2595</td><td>Microinjection, embryo alignment</td></tr><tr><td>Halocarbon oil 27</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8773</td><td>Microinjection, embryo alignment</td></tr><tr><td>Halocarbon oil 700</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8898</td><td>Microinjection, embryo alignment</td></tr><tr><td>Hemotek</td><td>Hemotek</td><td>PS5</td><td>Line Maintenance</td></tr><tr><td>Microelectrode Beveler</td><td>Sutter Instruments</td><td>BV10</td><td>Microinjection, needle beveling</td></tr><tr><td>Micropipette Puller</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-1000 or P-2000</td><td>Microinjection, needle pulling</td></tr><tr><td>Microscope Slides</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550-A3</td><td>Microinjection, embryo alignment</td></tr><tr><td>Non-Drying Modeling Clay</td><td>Jovi</td><td>B0025Z71IM</td><td>Microinjection, needle storage</td></tr><tr><td>Stereo Microscope</td><td>Olympus</td><td>SZ51</td><td>Microinjection, for embryo alignment</td></tr><tr><td>Sugar</td><td>Domino</td><td></td><td>20% sugar solution for adult sugar source.</td></tr><tr><td>T7 Endonuclease I</td><td>NEB</td><td>M0302</td><td>Preparation of microinjection materials</td></tr><tr><td>TOPO TA Cloning Kit</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>K451020</td><td>Preparation of microinjection materials</td></tr><tr><td>Ultra-fine tip forceps</td><td>Fisher Scientific</td><td>16-100-121</td><td>Microinjection, embryo alignment</td></tr></tbody></table>

embryo microinjection techniques for efficient site-specific mutagenesis in culex quinquefasciatus

Culex quinquefasciatus, kuş sıtması, Batı Nil virüsü (WNV), Japon ensefalit, Doğu at ensefaliti, lenfatik filariasis ve Saint Louis ensefaliti gibi çeşitli vektör kaynaklı hastalıkların vektörüdür. Özellikle, kuş sıtması çok sayıda endemik ada kuşu türünün neslinin tükenmesinde önemli bir rol oynarken, WNV Amerika Birleşik Devletleri'nde önemli bir vektör kaynaklı hastalık haline gelmiştir. C. quinquefasciatus biyolojisi hakkında daha fazla bilgi edinmek ve genetik kontrol araç kutularını genişletmek için, bu türdeki genom mühendisliği için daha verimli ve uygun fiyatlı yöntemler geliştirmemiz gerekir. Bununla birlikte, Culex sivrisineklerine özgü bazı biyolojik özellikler, özellikle yumurta salları, genom mühendisliği için gerekli mikroenjeksiyon işlemlerinin yapılmasını zorlaştırmıştır. Bu zorlukları ele almak için, Culex sivrisineklerinin benzersiz özellikleriyle ilişkili teknik engelleri azaltmaya odaklanan optimize edilmiş bir embriyo mikroenjeksiyon protokolü geliştirdik. Bu prosedürler, C. quinquefasciatus'ta başarılı mikroenjeksiyon için gerekli olan yumurta toplama, yumurta salı ayırma ve diğer elleçleme prosedürleri için optimize edilmiş yöntemleri göstermektedir. CRISPR/Cas9 genom düzenleme teknolojisi ile birleştiğinde, bu prosedürler, bu önemli, ancak şu anda yetersiz olan hastalık vektöründe gelişmiş genom mühendisliği yapmak ve genetik kontrol teknolojileri geliştirmek için gerekli olan bölgeye özgü, verimli ve kalıtsal germline mutasyonları elde etmemizi sağlar.

Daha önce yayınlanan deneylerde bu yöntem, koyu göz pigmentasyonunun gelişimi için kritik olan bir genin somatik ve germline mutasyonlarını başarıyla üretmek için kullanılmıştır, beyaz (CPIJ005542)30 (Tablo 1). CRISPR/Cas9 tarafından üretilen somatik mutasyonlar, enjekte edilen bireylerin pupal evre gözlerinde pigmentasyon kaybı taraması ile puanlandı (G0). Somatik mutasyonlar genellikle bazı hücrelerin mutant fenotipe sahip olduğu mozaik fenotipler olarak mevcuttu. Örneğin, beyaz genin somatik mutasyonları, pigmentasyondan yoksun fenotipler ve vahşi tip pigmentli fenotip30ile ommatidia karışımı ile sonuçlandı. Bununla birlikte, beyaz genin germline mutasyonu olduğunda, yeni nesil (G1)tam beyaz gözlü fenotipi miras haline geldi. Germline mutasyon oranları mozaik G0 bireyleri arasında geçiş yaparak ve tamamen beyaz gözlü yavrular için puanlama ile belirlendi (G1). Bu deneyler% 64 ila% 82 embriyo sağkalım oranının yanı sıra% 37 ila% 57 somatik mutajensis oranı ve% > 61 germline mutajensis oranı (Tablo 1)ile sonuçlandı. Aynı gendeki birden fazla lociyi hedeflemek için sgRNA'ları çoklayıcı yaparak, somatik ve germline mutajensis oranları yukarı doğru% 86'ya kadar yükseldi(Tablo 1). Ek olarak, birçok nesil boyunca, beyaz mutantların canlı homozigöz stokları laboratuvarda başarıyla tutulmuştur.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61375/61375fig01.jpg"> Şekil 1: C. quinquefasciatus yumurta salı ve tek yumurta morfolojisi. Dorsal (A), lateral (B) ve ventral (C) C quinquefasciatus yumurta sallarının manzarası. C. quinquefasciatus dişileri yumurtalarını daha soğanlı ön tarafı su yüzeyine dokunurken, daha sivri arka su yüzeyinden(D)uzağa bırakırlar. A- ön; P- posterior <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61375/61375fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61375/61375fig2v2.jpg"> Şekil 2: Mikroenjeksiyon ile C. quinquefasciatus mutantları oluşturmak için zaman çizelgesi. Mikroenjeksiyon için C. quinquefasciatus kolonisi hazırlama ve embriyo toplama zaman çizelgesi (A-D). Toplanan yumurtalar daha sonra aynı yönde hizalanır ve halokarbon yağı (F)ile kaplanır . Yumurtalar daha sonra enjekte edilir (G) ve halokarbon yağını(H)çıkarmadan önce en az 5 dakika dinlenmesine izin verilir. Yumurtalar daha sonra kuluçka (J) için temiz bir su kaynağına (I) aktarılır ve mutant fenotipler (K) için taranır. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61375/61375fig2v2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td colspan="3">Beka</td>
			<td colspan="3">Somatik mozaikçilik (G0)</td>
			<td>Germline mutajensis (G1)</td>
		</tr>
<tr>
<td>sgRNA</td>
			<td>#injected</td>
			<td>♂</td>
			<td>♀</td>
			<td>Toplam (%)</td>
			<td>♂</td>
			<td>♀</td>
			<td>Toplam (%)</td>
			<td>G1 mutantlar (%)</td>
		</tr>
<tr>
<td>wsgRNA-1</td>
			<td>50</td>
			<td>15</td>
			<td>20</td>
			<td>35(70)</td>
			<td>7(47)</td>
			<td>13(65)</td>
			<td>20(57)</td>
			<td>128(69)</td>
		</tr>
<tr>
<td>wsgRNA-2</td>
			<td>50</td>
			<td>9</td>
			<td>32</td>
			<td>41(82)</td>
			<td>3(33)</td>
			<td>12(38)</td>
			<td>15(37)</td>
			<td>51(61)</td>
		</tr>
<tr>
<td>wsgRNA-3</td>
			<td>50</td>
			<td>17</td>
			<td>15</td>
			<td>32(64)</td>
			<td>7(41)</td>
			<td>8(53)</td>
			<td>15(47)</td>
			<td>157(72)</td>
		</tr>
<tr>
<td>wsgRNA-1/wsgRNA-2</td>
			<td>50</td>
			<td>7</td>
			<td>16</td>
			<td>23(46)</td>
			<td>5(71)</td>
			<td>12(75)</td>
			<td>17(74)</td>
			<td>123(79)</td>
		</tr>
<tr>
<td>wsgRNA-1/wsgRNA-3</td>
			<td>50</td>
			<td>13</td>
			<td>9</td>
			<td>22(44)</td>
			<td>10(77)</td>
			<td>6(67)</td>
			<td>16(73)</td>
			<td>72(81)</td>
		</tr>
<tr>
<td>wsgRNA-2/wsgRNA-3</td>
			<td>50</td>
			<td>17</td>
			<td>10</td>
			<td>27(54)</td>
			<td>13(76)</td>
			<td>8(80)</td>
			<td>21(78)</td>
			<td>101(85)</td>
		</tr>
<tr>
<td>wsgRNA-1/wsgRNA-2/wsgRNA-3</td>
			<td>50</td>
			<td>11</td>
			<td>10</td>
			<td>21(42)</td>
			<td>9(82)</td>
			<td>9(90)</td>
			<td>18(86)</td>
			<td>149(86)</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1: Beyazı hedefleyen tek ve çoklamalı gRNA'larla enjekte edilen embriyoların sağkalım ve mutasyon oranları. Tablo30'dan izin atılmış olarak yeniden yazdırılır

Watch this Scientific Journal Video about Embryo Microinjection Techniques for Efficient Site-Specific Mutagenesis in Culex quinquefasciatus at JoVE.com

Embryo Microinjection Techniques for Efficient Site-Specific Mutagenesis in Culex quinquefasciatus

Bu protokol, CRISPR/Cas9 gen düzenleme araçlarıyla çalışmak üzere optimize edilmiş Culex quinquefasciatus embriyoları için mikroenjeksiyon prosedürlerini açıklar. Bu teknik, bu yetersiz hastalık vektörde genetik teknolojiler oluşturmak için kullanılabilecek bölgeye özgü, kalıtsal, germline mutasyonlarını verimli bir şekilde üretebilir.

Culex quinquefasciatus'ta Verimli Bölgeye Özgü Mutagenezi için Embriyo Mikroenjeksiyon Teknikleri

Culex quinquefasciatus is a vector of a diverse range of vector-borne diseases such as avian malaria, West Nile virus (WNV), Japanese encephalitis, ...

embryo-microinjection-techniques-for-efficient-site-specific

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

Embryo Microinjection Techniques for Efficient Site-Specific Mutagenesis in Culex quinquefasciatus

5.4K Görüntüleme.  University of California, San Diego. Bu protokol, CRISPR/Cas9 gen düzenleme araçlarıyla çalışmak üzere optimize edilmiş Culex quinquefasciatus embriyoları için mikroenjeksiyon prosedürlerini açıklar. Bu teknik, bu yetersiz hastalık vektörde genetik teknolojiler oluşturmak için kullanılabilecek bölgeye özgü, kalıtsal, germline mutasyonlarını verimli bir şekilde üretebilir.

Video: Embryo Microinjection Techniques for Efficient Site-Specific Mutagenesis in Culex quinquefasciatus

Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) is a pest species with extremely high agricultural relevance. This is due to its reproductive behavior: females damage the external surface of fruits and vegetables when they lay eggs and the hatched larvae feed on their pulp. Wild C. capitata populations are traditionally controlled through insecticide spraying and/or eco-friendly approaches, the most successful being the Sterile Insect Technique (SIT). The SIT relies on mass-rearing, radiation-based sterilization and field release of males that retain their capacity to mate but are not able to generate fertile progeny. The advent and the subsequent rapid development of biotechnological tools, together with the availability of the medfly genome sequence, has greatly boosted our understanding of the biology of this species. This favored the proliferation of new strategies for genome manipulation, which can be applied to population control.
In this context, embryo microinjection plays a dual role in expanding the toolbox for medfly control. The ability to interfere with the function of genes that regulate key biological processes, indeed, expands our understanding of the molecular machinery underlying medfly invasiveness. Furthermore, the ability to achieve germ-line transformation facilitates the production of multiple transgenic strains that can be tested for future field applications in novel SIT settings. Indeed, genetic manipulation can be used to confer desirable traits that can, for example, be used to monitor sterile male performance in the field, or that can result in early life-stage lethality. Here we describe a method to microinject nucleic acids into medfly embryos to achieve these two main goals.

Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) is a worldwide pest of agriculture. A deeper understanding of its biology is key to control medfly populations and thus reduce economic impact. Embryo microinjection is a fundamental tool allowing both germ-line transformation and reverse genetics studies in this species.

Dünya Tarım Pest Böcek Embriyo Mikroenjeksiyon yoluyla Nükleik Asitler teslim edilmesi,<em&gt; Ceratitis capitata</em

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) is a pest species with extremely high agricultural relevance. ...

Genetik

Microinjection of A. aegypti Embryos to Obtain Transgenic Mosquitoes

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue fever.  The techniques for correctly preparing microinjection needles, dessicating embryos, and performing microinjection are demonstrated.

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue fever. The techniques for correctly preparing microinjection needles, dessicating embryos, and performing microinjection are demonstrated.

Transgenik Sivrisinekler Edinme A. aegypti Embriyolar Mikroenjeksiyon

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue ...

Biyoloji

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex determination, venom synthesis, and host-symbiont interactions, among others. A major limitation of working with this organism is the lack of effective protocols to perform directed genome modifications. An important part of genome modification is delivery of editing reagents, including CRISPR/Cas9 molecules, into embryos through microinjection. While microinjection is well established in many model organisms, this technique is particularly challenging to perform in N. vitripennis primarily due to its small embryo size, and the fact that embryonic development occurs entirely within a parasitized blowfly pupa. The following procedure overcomes these significant challenges while demonstrating a streamlined, visual procedure for effectively removing wasp embryos from parasitized host pupae, microinjecting them, and carefully transplanting them back into the host for continuation and completion of development. This protocol will strongly enhance the capability of research groups to perform advanced genome modifications in this organism.

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Microinjection of Nasonia vitripennis embryos is an essential method for generating heritable genome modifications. Described here is a detailed procedure for microinjection and transplantation of Nasonia vitripennis embryos, which will greatly facilitate future genome manipulation in this organism.

Embriyo mikroenjeksiyon ve Nasonia vitripennis genom manipülasyon için transplantasyonu tekniği

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex ...

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance to man of conventional invertebrate model systems and the complexity of genomes in vertebrates are critical challenges to modeling human normal and pathological conditions. The chordate Ciona intestinalis is an invertebrate chordate that emerged from a common ancestor with the vertebrates and may represent features at the interface between invertebrates and vertebrates. A common body plan with much simpler cellular and genomic composition should unveil gene regulatory network (GRN) links and functional genomics readouts explaining phenomena in the vertebrate condition. The compact genome of Ciona, a fixed embryonic lineage with few divisions and large cells, combined with versatile community tools foster efficient gene functional analyses in this organism. Here, we present several crucial methods for this promising model organism, which belongs to the closest sister group to vertebrates. We present protocols for transient transgenesis by electroporation, along with microinjection-mediated gene knockdown, which together provide the means to study gene function and genomic regulatory elements. We extend our protocols to provide information on how community databases are utilized for in silico design of gene regulatory or gene functional experiments. An example study demonstrates how novel information can be gained on the interplay, and its quantification, of selected neural factors conserved between Ciona and man. Furthermore, we show examples of differential subcellular localization in embryonic cells, following DNA electroporation in Ciona zygotes. Finally, we discuss the potential of these protocols to be adapted for tissue specific gene interference with emerging gene editing methods. The in vivo approaches in Ciona overcome major shortcomings of classical model organisms in the quest of unraveling conserved mechanisms in the chordate developmental program, relevant to stem cell research, drug discovery, and subsequent clinical application.

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

We present transient transgenesis and gene knockdown in Ciona intestinalis, a chordate sister group to vertebrates, using microinjection and electroporation techniques. Such methods facilitate functional genomics in this simple invertebrate that features rudimentary characteristics of vertebrates, including notochord and head sensory epithelia, and many orthologs of human disease associated genes.

Kordalı embriyo Mikroenjeksiyon ve Elektroporasyon<em&gt; Ciona intestinalis</em

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance ...

Gelişim Biyolojisi

Sand Fly (Phlebotomus papatasi) Embryo Microinjection for CRISPR/Cas9 Mutagenesis

Sand flies are the natural vectors for Leishmania species, protozoan parasites producing a broad spectrum of symptoms ranging from cutaneous lesions to visceral pathology. Deciphering the nature of the vector/parasite interactions is of primary importance for better understanding of Leishmania transmission to their hosts. Among the parameters controlling the sand fly vector competence (i.e. their ability to carry and transmit pathogens), parameters intrinsic to these insects were shown to play a key role. Insect immune response, for example, impacts sand fly vector competence to Leishmania. The study of such parameters has been limited by the lack of methods of gene expression modification adapted for use in these non-model organisms. Gene downregulation by small interfering RNA (siRNA) is possible, but in addition to being technically challenging, the silencing leads to only a partial loss of function, which cannot be transmitted from generation to generation. Targeted mutagenesis by CRISPR/Cas9 technology was recently adapted to the Phlebotomus papatasi sand fly. This technique leads to the generation of transmissible mutations in a specifically chosen locus, allowing to study the genes of interest. The CRISPR/Cas9 system relies on the induction of targeted double-strand DNA breaks, later repaired by either Non-Homologous End Joining (NHEJ) or by Homology Driven Repair (HDR). NHEJ consists of a simple closure of the break and frequently leads to small insertion/deletion events. In contrast, HDR uses the presence of a donor DNA molecule sharing homology with the target DNA as a template for repair. Here, we present a sand fly embryo microinjection method for targeted mutagenesis by CRISPR/Cas9 using NHEJ, which is the only genome modification technique adapted to sand fly vectors to date.

Sand Fly Phlebotomus papatasi Embryo Microinjection for CRISPR/Cas9 Mutagenesis

This protocol details the steps of CRISPR/Cas9 targeted mutagenesis in sand flies: embryo collection, injection, insect rearing, and identification as well as selection of mutations of interest.

CRISPR/Cas9 Mutagenesis için Kum Sineği (Phlebotomus papatasi) Embriyo Mikroenjeksiyonu

Sand flies are the natural vectors for Leishmania species, protozoan parasites producing a broad spectrum of symptoms ranging from cutaneous lesions to ...

Microinjection Method for Anopheles gambiae Embryos

Embryo microinjection techniques are essential for many molecular and genetic studies of insect species. They provide a means to introduce exogenous DNA fragments encoding genes of interest as well as favorable traits into the insect germline in a stable and heritable manner. The resulting transgenic strains can be studied for phenotypic changes resulting from the expression of the integrated DNA to answer basic questions or used in practical applications. Although the technology is straightforward, it requires of the investigator patience and practice to achieve a level of skill that maximizes efficiency. Shown here is a method for microinjection of embryos of the African malaria mosquito, Anopheles gambiae. The objective is to deliver by microinjection exogenous DNA to the embryo so that it can be taken up in the developing germline (pole) cells. Expression from the injected DNA of transposases, integrases, recombinases, or other nucleases (for example CRISPR-associated proteins, Cas) can trigger events that lead to its covalent insertion into chromosomes. Transgenic An. gambiae generated from these technologies have been used for basic studies of immune system components, genes involved in blood-feeding, and elements of the olfactory system. In addition, these techniques have been used to produce An. gambiae strains with traits that may help control the transmission of malaria parasites.

Microinjection Method for Anopheles gambiae Embryos

Microinjection techniques are essential to introduce exogenous genes into the genomes of mosquitoes. This protocol explains a method used by the James laboratory to microinject DNA constructs into Anopheles gambiae embryos to generate transformed mosquitoes.

Anopheles gambiae Embriyoları için Mikroenjeksiyon Yöntemi

Embryo microinjection techniques are essential for many molecular and genetic studies of insect species. They provide a means to introduce exogenous DNA ...

Drosophila'da phiC31 İntegraz Aracılı Embriyo Transgenezi

Embryo Microinjection for Transgenesis in Drosophila

Transgenesis in Drosophila is an essential approach to studying gene function at the organism level. Embryo microinjection is a crucial step for the construction of transgenic flies. Microinjection requires some types of equipment, including a microinjector, a micromanipulator, an inverted microscope, and a stereo microscope.&#160;Plasmids isolated with a plasmid miniprep kit are qualified for microinjection. Embryos at the pre-blastoderm or syncytial blastoderm stage, where nuclei share a common cytoplasm, are subjected to microinjection. A cell strainer eases the process of dechorionating embryos. The optimal time for dechorionation and desiccation of embryos needs to be determined experimentally. To increase the efficiency of embryo microinjection, needles prepared by a puller need to be beveled by a needle grinder. In the process of grinding needles, we utilize a foot air pump with a pressure gauge to avoid the capillary effect of the needle tip. We routinely inject 120-140 embryos for each plasmid and obtain at least one transgenic line for around 85% of plasmids. This article takes the phiC31 integrase-mediated transgenesis in Drosophila as an example and&#160;presents a detailed protocol for embryo microinjection for transgenesis in Drosophila.

Yazar Spotlight: Drosophila'da Transgenez için Embriyo Mikroenjeksiyonunun Optimize Edilmesi

This article takes the phiC31 integrase-mediated transgenesis in Drosophila as an example and presents an optimized protocol for embryo microinjection,&#160;a crucial step for creating transgenic flies.

Drosophila'da Transgenez için Embriyo Mikroenjeksiyonu

Transgenesis in Drosophila is an essential approach to studying gene function at the organism level. Embryo microinjection is a crucial step for the ...

Zygote Microinjection for Creating Gene Cassette Knock-in and Flox Alleles in Mice

CRISPR-Cas technology has enabled the rapid and effortless generation of genetically modified mice. Specifically, mice and point mutant mice are readily produced by electroporation of CRISPR factors (and single-stranded oligo DNA donors) into the zygote. In contrast, gene cassette (&#62;1 kb) knock-in and floxed mice are mainly generated by microinjection of CRISPR factors and double-stranded DNA donors into zygotes. Genome editing technologies have also increased the flexibility of genetically modified mice production. It is now possible to introduce the intended mutations in the target genomic regions in a number of beneficial inbred mouse strains. Our team has produced over 200 gene cassette knock-in mouse lines, and over 110 floxed mouse lines by zygote microinjection of CRISPR-Cas9 following requests from several countries, including Japan. Some of these genome editing used BALB/c, C3H/HeJ, and C57BL/6N inbred strains, however most used C57BL/6J. Unlike the electroporation method, genome editing by zygote microinjection in various inbred strains of mice is not that easy. However, gene cassette knock-in and floxed mice on single inbred genetic backgrounds are as critical as genetic humanized, fluorescent reporter, and conditional knockout mouse models. Therefore, this article presents the protocol for the zygote microinjection of CRISPR factors and double-stranded DNA donors in C57BL/6J mice for generating gene cassette knock-in and floxed mice. This article exclusively focuses on nuclear injection rather than cytoplasmic injection. In addition to zygote microinjection, we outline the timeline for the production process and peripheral techniques such as induction of superovulation and embryo transfer.

The present protocol describes zygote microinjection of CRISPR-Cas9 and donor DNA to efficiently produce gene cassette knock-in and floxed mice.

Farelerde gen kaseti knock-in ve flox alelleri oluşturmak için zigot mikroenjeksiyonu

CRISPR-Cas technology has enabled the rapid and effortless generation of genetically modified mice. Specifically, mice and point mutant mice are readily ...

Culex quinquefasciatus'ta Verimli Bölgeye Özgü Mutagenezi için Embriyo Mikroenjeksiyon Teknikleri

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Dünya Tarım Pest Böcek Embriyo Mikroenjeksiyon yoluyla Nükleik Asitler teslim edilmesi,

Transgenik Sivrisinekler Edinme A. aegypti Embriyolar Mikroenjeksiyon

Embriyo mikroenjeksiyon ve Nasonia vitripennis genom manipülasyon için transplantasyonu tekniği

Kordalı embriyo Mikroenjeksiyon ve Elektroporasyon

CRISPR/Cas9 Mutagenesis için Kum Sineği (Phlebotomus papatasi) Embriyo Mikroenjeksiyonu

Anopheles gambiae Embriyoları için Mikroenjeksiyon Yöntemi

Drosophila'da Transgenez için Embriyo Mikroenjeksiyonu

Drosophila'da Transgenez için Embriyo Mikroenjeksiyonu

Drosophila'da Transgenez için Embriyo Mikroenjeksiyonu

Farelerde gen kaseti knock-in ve flox alelleri oluşturmak için zigot mikroenjeksiyonu