The authors would like to thank all the members of the "Insect Genetics and Genomics" Laboratory, in particular to Lorenzo Ghiringhelli who has worked at developing, adapting and maintaining the rearing of the medfly over the past thirty years. Part of the representative results of this paper have been reprinted from N. Biotechnology, 25(1) by Scolari F. et al., Fluorescent sperm marking to improve the fight against the pest insect Ceratitis capitata (Wiedemann; Diptera: Tephritidae), 76-84, 2008, with permission from Elsevier (License number 3796240759880). This work received support from Cariplo-Regione Lombardia "IMPROVE" (FS).

1. Deney Seti-up <ol><li> insectary gereksinimler <ol><li> Tüm C. bakımı capitata ömrü 25 ° C,% 65 nem ve 12/12 saat aydınlık / karanlık fotoperiyot de aşamaları. </li><li> Bir 6 L kafes yaklaşık 1,500-2,000 medfly pupa yerleştirin. Ovipozisyon 42 uyarmak için yeterince küçük delikleri olan bir tarafında örgü pirinç ile bir kafes kullanın. kılcal hareket aracılığı ile su ile sinekler sağlamak Cage tabanında küçük bir açıklıktan sünger şerit yerleştirin. Yetişkinler (Şekil 1A) için besin kaynağı olarak maya ve şeker (1:10) bir karışımı kullanın. maya miktarını artırmak (1&#39;e kadar: Şeker: 3, maya) kadın yumurtalarını bırakmak için başarısız gerekir. </li><li> ağ üzerinden yatırılan yumurtaları toplamak için kafesinin altında su ile dolu bir tabak koyun. bakire kadın yumurtlamaya gibi sinekler Mikroenjeksiyon deneyleri için yumurta toplama önce en az 6-7 gün eski kadar bekleyin. Bu kadın evlendirilen olacaktır sağlayacaktırve yumurta döllenmiş olacağı. </li><li> ince, net süzgeç ile suyun süzülmesi ile yumurta toplamak. Standart Konukçu (1.5 LH 2, O, 100 mi HCI,% 1 ihtiva eden bir plastik kutu içinde süzgeçten yumurta transferi geniş spektrumlu antimikrobiyal madde 50 mi etanol içinde eritildi, 5 g, 400 g şeker, 175 g minerali giderilmiş bira mayası, 1 Pasteur pipeti kullanarak) yumuşak buğday kepeği kg. </li><li> Hava sirkülasyonuna izin vermek için net kapakla kapatılmış saydam bir kap içinde her kutuyu yerleştirin ve kepek tabakası içeren pupa devresi (Şekil 1B) lehine. </li><li> Yaklaşık 10 gün sonra, larva gıda ortaya ve pupa devresi için kepek tabakası içine aşağı atlamak 3. instar larvaları kontrol edin. </li><li> 24 saat sonra, yumuşak bir fırça kullanarak küçük bir fincan pupa toplamak ve yeni bir yetişkin kafesine aktarabilirsiniz. Yetişkinler normalde 10 gün gelmesine sonra ortaya çıkar. Gelişmekte olan sinek ptilinum, th üzerinde kendi kafasına bulunan bir şişme cebi kullanırantenleri e tabanı, puparium sonuna kapalı zorlamak için. Çıkması sonrasında, ptilinum kalıcı geri kafasının içinde çöker. </li></ol></li><li> Microinjected larvalar için 1 L gıda hazırlanması <ol><li> 300 mi H2O 2.5 g agar çözülür </li><li> Sıcak 500 ml H 2 sıcak karıştırma plaka üzerinde Ç ve 4 g Sodyum benzoat çözülür, 4.5 ml% 37 HCI, 42 g maya özütü ve 115 gr kurutulmuş havuç tozu. </li><li> karışımına, 10 ml mutlak etanol içinde çözülmüş 2.86 g geniş spektrumlu antimikrobiyal elemanın bir solüsyonunu ilave edin. </li><li> Petri yuvarlak 15 cm orta dağıtın ve soğumaya bırakın. Gerekirse, 4 ° C&#39;de saklayın. </li></ol></li><li> slayt hazırlama <ol><li> Bir mikroskop lamı (75 x 26 mm 2) çift taraflı bant 2 cm şerit yerleştirin ve bir çini işaretleyici ile kenarları işaretleyin, petrol yayılmasını ve enjekte edilen embriyoların sonucu kuruma önlemek için. </li></ol></li><li><stRong&gt; Nükleik Asit Hazırlama <ol><li> Ticari olarak temin edilebilen kitler 34 kullanılarak plazmid DNA izole edin. etanol kullanılarak plazmid çökelti ve arzu edilen konsantrasyonda, enjeksiyon tamponu (0.1 mM fosfat tamponu pH 7.4, 5 mM KCI) &#39;de yeniden askıya. </li><li> Fenol-kloroform kullanılarak uzun dsRNA sentezlenmiş in vitro arındırmak, izopropanol kullanarak çöktürmek ve enjeksiyon tamponu 43 yeniden askıya. </li></ol></li></ol> 2. Embriyo Hazırlık <ol><li> 6-7 günlük yetişkin ihtiva eden bir kafes altında su ile dolu bir tepsiye yerleştirin. </li><li> kadın 30 dakika boyunca yumurtlamaya ve daha sonra ince bir süzgeç kullanarak suyun filtre embriyolar toplamak için izin verin. Her zaman embriyoların kuruma önlemek için suda süzgeç tutun. </li><li> ticari% 50 çamaşır suyu çözeltisi içinde 5 saniye boyunca süzgeç yükselmekte tarafından embriyolar Dechorionate. </li><li> art arda en az (temiz ultra saf suda süzgecin yükselmekte dikkatle embriyolar yıkayın4-5 kez). Son olarak, temiz ultra saf suya süzgeç yerleştirin. Maksimum 2 saat içinde embriyolar kullanın. NOT: Mikroenjeksiyon zamanlaması önce Hücreselleştirmeden nükleer bölünmelerin bir aşamasında, ön blastoderm embriyolar içine enjekte etmek gerekliliği ile ilgilidir. Bu enjekte DNA alınması-up gereken çekirdeklerin içine özellikle gamet kaynaklı olacak primordial germ hücre çekirdekleri içine sağlar. Medfly Hücreselleştirmeden 9 ve 12 saat 45,46 arasında yer alır, oysa Drosophila, kutup hücre Hücreselleştirmeden, blastoderm oluşumu yaklaşık 30 dakika, daha sonra 44 meydana gelen döllenmeden sonra yaklaşık 90 dakika ile (25 ° C&#39;de), başlar. </li><li> Satır Embriyo yönelimi <ol><li> ince bir fırça kullanarak, yaklaşık 50 embriyo toplamak ve su ile ıslatılmış siyah filtre kağıdı bir disk üzerine koyun. </li><li> Diseksiyon stereomikroskop altında, çift taraflı bant üst yüzeyi üzerine üst üste embriyolar düzenlemekince bir fırça (000) kullanılarak mikroskop lamı (Şekil 1C). NOT: Enjeksiyon germ-line köken olacak arka kutupta, yapılır gibi tüm aynı yönde embriyolar hizalayın; arka kutup mikropil bölgeye tersidir. </li><li> klorotrifloroetilen yağı tabakası yağı çin işaretleyici sınırları (1.3 bakınız) dökmek değil emin olan embriyolar örtün. Not: yağ embriyolar kapak, önce bir başka aşama gerçekleştirilebilir: embriyolar sıvı içeriğini azaltmak ve böylece enjekte DNA çözeltisi girişini kolaylaştırmak için bir kaç dakika için kurutulmuş olabilir. Bu yüksek bir sıvı basıncının bir sonucu olarak, enjeksiyon ya da enjekte çözeltinin aşırı sızıntıya sırasında embriyonun patlama önlemeye yardımcı olabilir. </li></ol></li></ol> 3. Embriyo Mikroenjeksiyon <ol><li> plazmid DNA ya da bir mikropipet kullanılarak dsRNA çözeltisi (1-2 ug / ul) ile bir iğne (1-2 ul) doldurun. </li><li&gt; Enjeksiyon süresi (0.5 sn) kontrol mikroenjeksiyon aparatı, iğne bağlayın basıncı (800 hPa) ve karşı basınç (150 hPa). </li><li> Iğne (Şekil 1D) hareketlerini kontrol etmek için bir mikro manipülatörün kullanılması, bir stereo mikroskop altında mikroenjeksiyon gerçekleştirin. slayt taşımak için mikroskop sahne kullanın. <ol><li> kapsam sahnede slayt yerleştirin. </li><li> Embriyo (Şekil 1E) arka kutupta içine iğne ucu yerleştirin. </li><li> pedalıyla mikroenjeksiyon sistemini aktive ederek çözüm enjekte edilir. püskürtülen sıvı embriyo hafif harekete yol açar, iç basınç bir artışa neden olur. </li><li> hemen pedalını ve bırakın, ama nazikçe, embriyo iğne çıkarılır. </li><li> Enjeksiyon yerinde biraz sitoplazmik kaçağı gözlemleyin. NOT: nedeniyle mikroenjeksiyon pro DNA / dsRNA / siRNA ve mortalite potansiyel öldürücü etkileri arasında ayrım yapmak içinkendisi mıknatıslarından çıkan, kontrol deneyleri gerçekleştirilmelidir. Bu karşıt genetik deneylerde durumunda, sadece tampon enjeksiyon içerir, ya da bir yeşil fluoresan protein (GFP) iki-şeritli RNA (dsRNA GFP) veya siRNA -türevli. </li></ol></li><li> Enjeksiyon, 25 ° C&#39;de inkübe embriyolar sonra. </li></ol> 4. Post-enjeksiyon İşlemleri <ol><li> İki gün enjeksiyonundan sonra, bir stereo mikroskop altında yumurtadan larva (Şekil 1F) için slaytlar kontrol edin. Larvalar yağda hareket ama en kısa sürede larva gıda transfer edilmesi gerekir olabilir. Bu nedenle, bir gün slaytlar birkaç kez kontrol edin. </li><li> ince bir fırça (000) kullanarak, yavaşça havuç tabanlı larva gıda yumurtadan larva transferi. Her bir Petri kabı başına 200 larva en fazla aktarın. </li><li> % 65 nem (25 ° C) larvaları kuluçkaya yatmaktadır. Kapak hava değişimi zarar, çanak yapışmaz emin olun. </li><li> Kapaklı Petri kapları tutmaklarvalara hava akımı hala böylece çoğunlukla kapattı. Aşırı kurumayı önlemek günlük yemekler kontrol etmek ve gerekirse, buharlaşma telafi etmek için su ekleyin. </li><li> net-kapakla kapatılmış bir açık kapta Petri kapları yerleştirin ve kepek tabakası içeren gelmesine lehine. Rutin insectary yetiştiriciliği için olduğu gibi, 3. instar larvaları larva gıda dışında atlama ve kepek pupa. </li><li> (Bu Nesil 0, G0 olan) pupa toplamak ve yetişkin yetiştirme ve tarama için küçük bir kafese koyun. Arka standart larva gıda döl. </li><li> Enjekte bireyler genellikle kimeralardır olarak germ-line dönüştürme deneylerinde durumunda, bir sonraki nesilde mümkün dönüştürülmüş bireyler (G1) kontrol edin. Transpozisyon olaylar, gerçekten de, mikrop hattı ya da soma da oluşturacak embriyonik Sinsityum çekirdekleri, herhangi meydana gelmiş olabilir. <ol><li> Kısa bir süre sonra ortaya çıkması, CO 2 kullanılarak G1 bireyleri uyutmak ve transf kontrolBir Epifloresans stereomicroscope altında ormation olaylar. ise yeşil floresan ekranına EYFP filtre kullanmak (.. EMM 535/30 Dahili 500/20); (EMM 605/75.. Dahili 546/12) kırmızı floresan varlığında taranması için, DsRedwide filtre kullanın . </li><li> karşı cinsten vahşi tip yetişkin ile küçük bir kafes içinde dönüştürülmüş bireyleri yerleştirin ve yeni, başlangıçta heterozigot, gerginlik kaynaklanır. </li></ol></li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Böcek embriyolar nükleik asitlerin mikro enjeksiyonu gen fonksiyonu ve biyo teknolojik uygulamalarda analizi hem de kolaylaştırır evrensel bir tekniktir. böcek türlerinin artan sayıda genom dizilerinin yakın zamanlı henüz bilinmeyen fonksiyonun genlerin fonksiyonel karakterizasyonu için araçlar için acil bir ihtiyaca yol açar. RNA enterferans moleküler fonksiyonları 49 anlaması için en değerli yöntemlerden biri olduğu kanıtlanmıştır ve embriyo mikroenjeksiyon bu çalışmaları kolaylaştırır gelmiştir. Plazmid DNA enjeksiyonu transposaz-aracılı gen ekleme kullanılarak böcek genom değiştirmek için kullanılabilir ve, daha da en son, genom düzenleme araçları (ör TALEN CRISPR / Cas9, HEGs). Bu teknikler zaten eradikasyon ya da yabani nüfusun değiştirilmesi w hem amaçlayan haşere kontrol programları için kullanılabilecek çok sayıda böcekler türlerin soylarının gelişimini sağladıi değiştirilmiş biyolojik özelliklere sahip böcekler. Bu protokol, plazmid DNA ya da dsRNA ile ya medfly embriyo mikro enjeksiyon için optimize edilmiş bir yöntem açıklanmaktadır. kullanılabilirliği köklü ve maliyet-etkin medfly yetiştiriciliği yanı sıra bu türlerin cinsiyet tayini ve Hücreselleştirmeden sürecini okuyan araştırmacılar tarafından yılda elde edilen kapsamlı moleküler bilgi için yarı kuru larva orta ölçüde güvenilir kurulmasını kolaylaştırmak embriyo mikroenjeksiyon protokolü. Özellikle, yetiştirme protokolü embriyo maksimum doğurganlık ve canlılık sağlamak için optimize edilmiştir. Bu olası enjekte edilen embriyoların en az sayıda canlı yetişkin elde etme olasılığını arttırmak için önemlidir. Farklı protokolleri, arka &#39;enjekte larva tarif havuç tabanlı Konukçu olarak medfly yetiştirme için kullanılabilir. Bununla birlikte, bu yöntem daha pahalı ve bunun hazırlanması daha zaman alıcı olanRutin yetiştirme için kullanılan diğer medya. Mikroenjeksiyon kullanımına önemli bir engel embriyoların mekanik manipülasyonu kaynaklanan spesifik olmayan bir hasardır. Bu tür embriyolar enjekte hacimleri, enjeksiyon yerinde ve tampon yönlendirmek için kullanılan fırça ile embriyo zarının delici olarak embriyolar, hayatta kalma etkileyen birden çok değişken içerir ve iğne tipi 50 kullanılır. Bu parametrelerin bazıları, enjekte hacimleri ve tampon madde olarak, optimize edilmiştir. iğneler halinde, aynı zamanda, bir çekme aleti kullanmak içi üretilebilir, ve bu ideal protokolü belirlemek için bir optimizasyon adım gerektirir. Mikroenjeksiyon işlemi büyük sakıncaları arasında da dechorionation şudur: Bu adım (yani, daha az kaygan) ve enjeksiyon kolaylaştırmak için, çamaşır suyu uzun süre maruz kalmanın ağır etkileyebilir embriyonik canlılık işleyicisi yumurta kolaylaştırmak için gerekli olmasına rağmen. foBu nedenle r, biz burada açıklamak protokol koryon ve hayatta kalma oranı kaldırılması arasında iyi bir uzlaşma olarak kurulmuştur çok kısa dechorionation süresi (5 sn) kullanımını bildirir. Arka sonraki hayat sahnesinde kullanılan protokoller de geçerlidir. Enjekte embriyolardan yumurtadan larva en kısa sürede yağ kaldırılması gerekir. Petrol embriyoların kuruma önlemek için, ama larvalara zararlı olabilir gerçekten önemlidir. larvaları, yağa harcanan zamanı ortadan kaldırmak için kullanılan yöntem ve kullanılan gıdaların türü final hayatta kalma oranını tehlikeye düşürebilecek beri dikkat edilmesi gereken tüm önemli değişkenlerdir. yetişkin ve larva tarama yaparken, immobilizasyon yöntemleri de önemli olabilir. Medfly yetişkin CO2 buz veya kullanılarak immobilize edilebilir, ancak uzun süreli maruz kalma, yetişkin hayatta kalmak için zararlı olabilir. Embriyo mikroenjeksiyon bir alternatif olarak, oral uygulama kanıtlanmıştırRNAi deneyleri gerçekleştirmek için daha az invazif ve potansiyel olarak yüksek verim yöntemi. Bu mikroenjeksiyon için uygun, hem de alan popülasyonlarının RNAi aracılı haşere kontrolü için olmayan türler, özellikle etkili olabilir. İlk başarılı dönüşümü floresan testis ile birden suşları kurulmasına yol açmıştır medfly genomun, bir transposase aracılı gen ekleme yoluyla: protokolün olası uygulamaları örnekleri açıklandığı gibi bu yazıda, iki olgu bildirilmiştir. Benzer bir prosedür kullanılarak mikroenjeksiyon, demonte etkileri yetişkin aşamaya kadar görünür olmak üzere dsRNA enjekte edilmesi de mümkündür. medfly embriyolar için güvenilir bir mikroenjeksiyon protokolü kurulması Steril Böcek de dahil olmak üzere, klasik yaklaşımlara alternatif veya tamamlayıcı stratejiler olarak, vahşi sinekleri kontrol etmek için bir araç olarak genetiği değiştirilmiş suşları dikkate yolu açtıTekniği. Son olarak, zebra balığı embriyolarının otomatik mikroenjeksiyon için teknolojinin son gelişmeler potansiyel medfly ve diğer ilgili zararlıların 51 transgenik suşları oluşturmak için önemli alaka ile yüksek verimlilik sağlama sistemlerinin gelişmesine yardımcı olabilir.

Akdeniz meyve sineği (medfly) Ceratitis capitata kozmopolit bir tür yaygın zarar meyve ve ekili bitkileri olduğunu. Bu tür genera Bactrocera ve Anastrepha ait olanlar gibi bazı böcek türleri içerir Tephritidae ailesine aittir. Medfly Bu ailenin en çok çalışılan türler olduğunu ve böcek istilaları 1 çalışma için değil, aynı zamanda zararlı yönetimi stratejileri 2 optimize etmek için değil, sadece bir model haline gelmiştir. Medfly 300&#39;den fazla vahşi türler ve ekili bitkiler 3,4 saldırabilir bir multivoltine türdür. hasar yetişkin ve larva aşamaları hem kaynaklanır: çiftleşen dişiler mikroorganizmalar ticari kalitesini etkileyecek izin yumurtlama için meyve yüzeyini delip, pestil üzerinde larva besleme oysa. Üç larva aşamasından sonra, larvalar konak ortaya ve toprağa pupa. Ceratitiscapitata Afrika, Orta Doğu, Batı Avustralya, Orta ve Güney Amerika, Avrupa ve Amerika Birleşik Devletleri 5 alanlar dahil olmak üzere neredeyse tüm dünyada dağıtımı görüntüler. En yaygın stratejiler medfly enfestasyonlar insektisit kullanımını içerir sınırlamak için (örneğin, Malathion, Spinosad) ve çevre dostu Steril Böcek Tekniği (SIT) 6. İkinci yaklaşım, radyoterapi iyonizan maruz steril hale erkeklerin yüz binlerce vahşi serbest bırakılmasını gerektirir. Yabani dişilere, sterilize erkeklerin birleşme en sonunda ortadan kaldırılması neden popülasyon boyutu bir azalmaya neden hiçbir döl sonuçlanır. SIT dünya çapında birden fazla kampanya etkili olduğu kanıtlanmıştır rağmen, onun büyük dezavantajları yetiştirme ve tahliye edilecek böcekler milyonlarca sterilizasyon yüksek maliyetleri içerir. serbest bireylerin işaretleme sırasında alanda yakalanan yabani böcekler steril ayırmak gerekirfaaliyetlerinin izlenmesi ve şu anda floresan tozu kullanılarak elde edilir. Bu prosedürler, yüksek maliyetli ve istenmeyen yan etkileri 7 vardır. sipariş optimize etmek ve / veya bu zararlının kontrolünde daha etkili yaklaşımlar geliştirmek için, medfly biyoloji ve genetik yaygın olarak dünya çapında sayısız araştırmacılar tarafından incelenmiştir. Medfly genom dizisinin 8,9 kullanılabilirliği, gen fonksiyonları üzerinde yeni araştırmalar kolaylaştıracaktır. RNA interferans gibi çalışmalar için güçlü bir araç olup, dsRNA (çift zincirli RNA) veya siRNA&#39;nın (küçük müdahale edici RNA) mikroenjeksiyon yoluyla elde edilebilir. Bu teknik göstermek için, örneğin, kullanılmış olduğunu C cinsiyet tespiti moleküler kaskad capitata kısmen Drosophila 10&#39;dakine göre muhafaza edilir. Protokollerin geliştirilmesi C. izin medfly embriyolar Microinject için capitata olmayan ilk olmak-Drosophilid Sinek türleri genetiği değiştirilmiş olması. Bunu yumurta 11 kuruma hem morfolojik ve direnç açısından, Drosophila benzer olduğu için, protokol önce D. geliştirilmiş ön blastoderm embriyolara plazmid DNA teslim melanogaster 12,13 Başlangıçta C. kullanım için uyarlanmıştır capitata. Bu ilk deneyler transpoze edilebilir elemanın Minos 11 göre medfly germ çizgili transformasyon sağladı. Daha sonra, özgün sistem diğer transpozon tabanlı yaklaşımlar kullanılarak 14 modifiye edildi. Bu Lepidoptera Trichoplusia ni 15 den piggyBac durumdur. Protokol beri daha da optimize edilmiştir ve bu diğer birçok Diptera 22-31 de diğer tephritid türlerinin 16-21 dönüşümü ve izin verdi. Bütün bu sistemler tipik bir ikili vektör / yardımcı plazmid dönüşüm sistemi kullanımına dayanmaktadır: Yapay arızalı transpoİstenen genleri içeren oğulları plasmid DNA içine monte transposaz enzimi 32 tedarik böcek genomuna entegre edilir. Transgenik medfly çizgilerin bir dizi doğruluğunu geliştirmek olabilir, floresan sperm ile suşlar erkek sadece döl üreten ve böylece ilave cinsiyet tayini stratejilerini gerektirmeyen ve suşları, ölümcül uyaran bir koşullu dominant letal geni taşıyan suşlar dahil birden çok özellik ile oluşturulan edilmiştir SİT izleme aşamasında 33-37 arasında. Transgenik organizmaların vahşi salma sivrisinekler, sadece 38,39 karşı Pilot testlerinde meydana gelse de, en az bir adet işletme alanı 40 kullanımları için transgenik medfly bir çok suş veya değerlendirmektedir. Embriyo mikroenjeksiyon ayrıca (CR gibi transkripsiyon aktivatörü gibi efektör nükleazların (Talens), kümelenmiş düzenli interspaced kısa yineleyen tekrarlar gibi yeni genom düzenleme araçları, gelişimini desteklemek içinISPR) / CRISPR ilişkili protein 9 nükleaz (Cas9) ve yeni evrimsel ve gelişimsel çalışmaları sağlayacak, hem de mevcut biyoteknolojik araç kutusu genişleyen olacak homing endonükleaz genler (HEGs). Genom düzenleme yaklaşımları zaten sivrisinekler 41 gen-sürücü sistemleri nesil izin ve medfly onların transferi yakındır. Burada her şeyden önce bahsedilen uygulamalarda yararlı olabilir medfly embriyolar nükleik asitlerin microinjecting için evrensel bir protokol açıklar.

<table><tbody><tr><td>1 x injection Buffer</td><td></td><td></td><td>0.1 mM phosphate buffer pH 7.4, 5&amp;nbsp;mM KCl</td></tr><tr><td>Construct Plasmid</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Helper Plasmid</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>dsRNA</td><td></td><td></td><td>Phenol-Chloroform purified</td></tr><tr><td>Standard Larval food</td><td></td><td></td><td>1.5 L H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, 100 ml HCl 1%, 5 g broad-spectrum antimicrobial agent used in pharmaceutical products dissolved in 50&amp;nbsp;ml of ethanol, 400 g sugar, 175 g demineralized brewer&#039;s yeast, 1 kg soft wheat bran</td></tr><tr><td>Carrot Larval Food</td><td></td><td></td><td>2.5 g agar, 4 g sodium benzoate, 4.5 ml 37% HCl, 42 g yeast extract, 115 g carrot powder, 2.86&amp;nbsp;g broad-spectrum antimicrobial agent , water to 1 L</td></tr><tr><td>Adult Food</td><td></td><td></td><td>yeast extract and sugar (1:10)</td></tr><tr><td>Microscope slides</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z692247</td><td></td></tr><tr><td>Injection needles&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5242956000</td><td></td></tr><tr><td>Microloaders</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td></td></tr><tr><td>Double slided tape</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Whatman Black circle paper</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z695505</td><td></td></tr><tr><td>Bleach</td><td></td><td></td><td>Diluite 1:2 before use</td></tr><tr><td>Paintbrush (000)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Narishige</td><td>MN-153</td><td></td></tr><tr><td>Microinjector</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Femtojet</td></tr><tr><td>Adult cages</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chlorotrifluoroethylene oil</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8898</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Ceratitis capitata&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td>The strain used is ISPRA</td></tr></tbody></table>

delivery of nucleic acids through embryo microinjection in the worldwide agricultural pest insect, ceratitis capitata

Akdeniz meyve sineği (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) son derece yüksek tarımsal alaka ile bir haşere türüdür. Bu, üreme davranışları nedeniyle: Onlar yumurta ve hamuru üzerinde yumurtadan larva yemi yatıyordu zaman kadın meyve ve sebzelerin dış yüzeyine zarar. Vahşi C. capitata popülasyonları geleneksel püskürtme ve / veya çevre dostu yaklaşımlar, en başarılı Steril Böcek Tekniği (SIT) olmak insektisit ile kontrol edilir. SIT kitle yetiştirme, radyasyon bazlı sterilizasyon ve çiftleşmek için kapasitelerini korumak ama verimli döl üretmek mümkün değildir erkeklerin alan salınımı dayanır. gelişi ve birlikte medfly genom dizisinin durumu ile biyoteknolojik araçlar müteakip hızlı bir gelişme, bu türün biyolojisi anlayışımızı artırdı ölçüde olmuştur. Bu genom manipülasyon, ca için yeni stratejiler çoğalmasını tercihn nüfus kontrolü uygulanabilir. Bu bağlamda, embriyo mikroenjeksiyon medfly kontrolü için araç kutusunu genişleyen ikili bir rol oynar. Anahtar biyolojik süreçleri düzenleyen genlerin fonksiyonu ile müdahale yeteneği, gerçekten, medfly invaziv altında yatan moleküler makine anlayışımızı genişler. Bundan başka, tohum-hattı dönüşümü gerçekleştirmek için yeteneği, yeni SIT ayarları gelecek alan uygulamalar için test edilebilir çok sayıda transgenik soylarının üretilmesini kolaylaştırır. Gerçekten de, genetik manipülasyon, örneğin, alanda erkek steril performansını izlemek için kullanılabilir istenen özellikleri kazandırmak için kullanılabilir, ya da erken yaşam aşamalı öldürücülüğü neden olabilir. İşte bu iki temel hedeflere ulaşmak için medfly embriyolar içine nükleik asitlerin Microinject için bir yöntem açıklanmaktadır.

Burada sırasıyla ilgi genin işlevsel karakterizasyonu yönelik embriyo mikroenjeksiyon iki uygulama (Olgu 1) rapor ve transgenik suşlar nesil (Olgu 2) de. embriyoların içine dsRNA teslim gen fonksiyonunu çözülmeye. Innexin-5 geninin, böceklerde, erkek ve dişi gonadlar 43,47,48 spesifik olarak ifade edilen bir boşluk kavşak kodlar. yakından ilgili türler için mevcut bilgilere dayanarak, dsRNA indüklenen gen susturma medfly dişi ve erkek germ çizgili ablasyonu ile sonuçlanması bekleniyordu. 2.400 embriyo sayısı 548 larva yumurtadan ve 216 yetişkin (yayınlanmamış veriler) hayatta olan bir 2 ug / ml dsRNA karışımı enjekte edilmiştir. yetişkin, testis ve overler yaklaşık% 75&#39;inde altında develo ya olduğu ortaya çıktıped ya da tamamen yok (Şekil 2). Kontrol grubu ile karşılaştırıldığında her iki cinsiyet bireylerin arka kısmında innexin-5 kopya miktarı miktarının, genin önemli ölçüde daha düşük bir ifade doğruladı. floresan spermatozoa ile transgenik suşları nesil. Medfly floresan etiketli sperm ile transjenik suşların plazmid DNA ile embriyolar enjekte Scolari ve arkadaşları 34 ile oluşturulmuştur. , Bir &quot;yardımcı plazmit&quot; piggyBac transposaz kodlanan Karışım, sabit göreli oranlarda karıştırılır iki plazmid ihtiva Diğer, &quot;Donör plazmid&quot;, yapay transpozon içeren ve iki floresan belirteçler taşınan bir özel testislerde, kadın ve erkek soma diğer dile getirdi. T sorumlu Beta 2-tübülin geninin promoteri,Estes özgü sentezleme, turboGFP (# 1260 yapı) ya da DsRedExpress sırasıyla (# 1261 yapı) floresan proteinleri kodlama sekansları ile ATG kaynaştırıldı. 821 embriyoların toplam sayısı, enjekte 205 larva yumurtadan hangi ve 37 yetişkin hayatta edildi. (- Lisans Numarası 3796240759880 Elsevier elde edilen bu verileri yeniden Lisans) 9 kadın ve 8 erkek geçitleri floresan Döl 34 verdi 6 olan, set-up bulundu. Başarılı dönüşüm, yeşil ve kırmızı flüoresan testis sırasıyla (Şekil 3) ile suşların gelişmesine yol açmıştır. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54528/54528fig1.jpg" /> Şekil 1. insectary ekipman ve embriyolar. (A) Standart 1,500-2,000 yetişkin içeren kafes yetiştirme. kadın pirinç ile yumurta kafesin önünde örgü yatıyordu. Yumurta, su toplanır. SoldakiKafesin yan, yumurta filtrelemek için kullanılan süzgeç görülebilir. (B) standart larva içeren gıda larvaların İki kutu. kutuları gelmesine kolaylaştırmak için kepek içeren daha büyük bir şeffaf plastik kutu yerleştirilir; kutusunu kapsayan net kaldırıldı. (C) Embriyolar sıralar halinde düzenlenmiştir. slayt üzerinde çift taraflı bant kenarlarının beyaz Çin markör ile işaretlendi. Kasette hizalanmış Yumurta klorotrifloroetilen yağı ile ele alınacaktır. (D) Mikroenjeksiyon aparatı (solda) bir micromanipulator (sağda) ile donatılmış bir stereomikroskop bağlı. (E) Embriyo direkleri; siyah ok (mikropil bulunur) ön direğe gösterir ise kırmızı ok, arka kutba (enjeksiyon yerinde) gösterir. Ölçek çubuğu = 500 mikron. Yağda hareket (F) Yumurtadan larva. Ölçek çubuğu = 500 mikron. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54528/54528fig1large.jpg" target="_blank">Plea</a>se, bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın. <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54528/54528fig2.jpg" /> Şekil 2. Erkek ve az gelişmiş gonadlar kadın. Kadın (solda) ve erkek (sağ) üreme yolları disseke. Yukarıda: Normal gonadlar ile yabani tip bireyler. Aşağıda: az gelişmiş gonadlar bireylere müdahale etti. DERGİLER: Bay Aksesuar Bezler; Sp: spermateka. Ölçek çubuğu = 500 mikron. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54528/54528fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54528/54528fig3.jpg" /> Şekil 3. Transgenik sırasıyla yapı # 1260 ve # 1261, dönüştürülmüş floresan testis ve sperm. Yetişkin erkeklerde ile erkekler. Oklar fluo işaretrescent testisler. # 1261 erkek kırmızı testisler ve yeşil organları göstermek ise # 1260 erkek, kırmızı gövde ve yeşil testisler göstermektedir. Ölçek çubuğu = 2 mm. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54528/54528fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata at JoVE.com

Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) is a worldwide pest of agriculture. A deeper understanding of its biology is key to control medfly populations and thus reduce economic impact. Embryo microinjection is a fundamental tool allowing both germ-line transformation and reverse genetics studies in this species.

Dünya Tarım Pest Böcek Embriyo Mikroenjeksiyon yoluyla Nükleik Asitler teslim edilmesi,<em&gt; Ceratitis capitata</em

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) is a pest species with extremely high agricultural relevance. ...

delivery-nucleic-acids-through-embryo-microinjection-worldwide

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

8.9K Görüntüleme.  University of Pavia. The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) is a worldwide pest of agriculture. A deeper understanding of its biology is key to control medfly populations and thus reduce economic impact. Embryo microinjection is a fundamental tool allowing both germ-line transformation and reverse genetics studies in this species.

Video: Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

Laser-assisted Cytoplasmic Microinjection in Livestock Zygotes

Cytoplasmic microinjection into one-cell embryos is a very powerful technique. As an example, it enables the delivery of genome editing tools that can create genetic modifications that will be present in every cell of an adult organism. It can also be used to deliver siRNA, mRNAs or blocking antibodies to study gene function in preimplantation embryos. The conventional technique for microinjecting embryos used in rodents consists of a very thin micropipette that directly penetrates the plasma membrane when advanced into the embryo. When this technique is applied to livestock animals it usually results in low efficiency. This is mainly because in contrast to mice and rats, bovine, ovine, and porcine zygotes have a very dark cytoplasm and a highly elastic plasma membrane that makes visualization during injection and penetration of the plasma membrane hard to achieve. In this protocol, we describe a suitable microinjection method for the delivery of solutions into the cytoplasm of cattle zygotes that has proved to be successful for sheep and pig embryos as well. First, a laser is used to create a hole in the zona pellucida. Then a blunt-end glass micropipette is introduced through the hole and advanced until the tip of the needle reaches about 3/4 into the embryo. Then, the plasma membrane is broken by aspiration of cytoplasmic content inside the needle. Finally, the aspirated cytoplasmic content followed by the solution of interest is injected back into the embryonic cytoplasm. This protocol has been successfully used for the delivery of different solutions into bovine and ovine zygotes with 100% efficiency, minimal lysis, and normal blastocysts development rates.

This protocol shows how to perform cytoplasmic microinjection in farm animal zygotes. This technique can be used to deliver any solution into the one-cell embryo such as genome editing tools to generate knockout animals.

Lazer destekli Hayvancılık Zigotlann Sitoplazmik Mikroenjeksiyon

Cytoplasmic microinjection into one-cell embryos is a very powerful technique. As an example, it enables the delivery of genome editing tools that can ...

Genetik

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex determination, venom synthesis, and host-symbiont interactions, among others. A major limitation of working with this organism is the lack of effective protocols to perform directed genome modifications. An important part of genome modification is delivery of editing reagents, including CRISPR/Cas9 molecules, into embryos through microinjection. While microinjection is well established in many model organisms, this technique is particularly challenging to perform in N. vitripennis primarily due to its small embryo size, and the fact that embryonic development occurs entirely within a parasitized blowfly pupa. The following procedure overcomes these significant challenges while demonstrating a streamlined, visual procedure for effectively removing wasp embryos from parasitized host pupae, microinjecting them, and carefully transplanting them back into the host for continuation and completion of development. This protocol will strongly enhance the capability of research groups to perform advanced genome modifications in this organism.

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Microinjection of Nasonia vitripennis embryos is an essential method for generating heritable genome modifications. Described here is a detailed procedure for microinjection and transplantation of Nasonia vitripennis embryos, which will greatly facilitate future genome manipulation in this organism.

Embriyo mikroenjeksiyon ve Nasonia vitripennis genom manipülasyon için transplantasyonu tekniği

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex ...

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance to man of conventional invertebrate model systems and the complexity of genomes in vertebrates are critical challenges to modeling human normal and pathological conditions. The chordate Ciona intestinalis is an invertebrate chordate that emerged from a common ancestor with the vertebrates and may represent features at the interface between invertebrates and vertebrates. A common body plan with much simpler cellular and genomic composition should unveil gene regulatory network (GRN) links and functional genomics readouts explaining phenomena in the vertebrate condition. The compact genome of Ciona, a fixed embryonic lineage with few divisions and large cells, combined with versatile community tools foster efficient gene functional analyses in this organism. Here, we present several crucial methods for this promising model organism, which belongs to the closest sister group to vertebrates. We present protocols for transient transgenesis by electroporation, along with microinjection-mediated gene knockdown, which together provide the means to study gene function and genomic regulatory elements. We extend our protocols to provide information on how community databases are utilized for in silico design of gene regulatory or gene functional experiments. An example study demonstrates how novel information can be gained on the interplay, and its quantification, of selected neural factors conserved between Ciona and man. Furthermore, we show examples of differential subcellular localization in embryonic cells, following DNA electroporation in Ciona zygotes. Finally, we discuss the potential of these protocols to be adapted for tissue specific gene interference with emerging gene editing methods. The in vivo approaches in Ciona overcome major shortcomings of classical model organisms in the quest of unraveling conserved mechanisms in the chordate developmental program, relevant to stem cell research, drug discovery, and subsequent clinical application.

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

We present transient transgenesis and gene knockdown in Ciona intestinalis, a chordate sister group to vertebrates, using microinjection and electroporation techniques. Such methods facilitate functional genomics in this simple invertebrate that features rudimentary characteristics of vertebrates, including notochord and head sensory epithelia, and many orthologs of human disease associated genes.

Kordalı embriyo Mikroenjeksiyon ve Elektroporasyon<em&gt; Ciona intestinalis</em

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance ...

Gelişim Biyolojisi

Embryo Microinjection Techniques for Efficient Site-Specific Mutagenesis in Culex quinquefasciatus

Culex quinquefasciatus is a vector of a diverse range of vector-borne diseases such as avian malaria, West Nile virus (WNV), Japanese encephalitis, Eastern equine encephalitis, lymphatic filariasis, and Saint Louis encephalitis. Notably, avian malaria has played a major role in the extinction of numerous endemic island bird species, while WNV has become an important vector-borne disease in the United States. To gain further insight into C. quinquefasciatus biology and expand their genetic control toolbox, we need to develop more efficient and affordable methods for genome engineering in this species. However, some biological traits unique to Culex mosquitoes, particularly their egg rafts, have made it difficult to perform microinjection procedures required for genome engineering. To address these challenges, we have developed an optimized embryo microinjection protocol that focuses on mitigating the technical obstacles associated with the unique characteristics of Culex mosquitoes. These procedures demonstrate optimized methods for egg collection, egg raft separation and other handling procedures essential for successful microinjection in C. quinquefasciatus. When coupled with the CRISPR/Cas9 genome editing technology, these procedures allow us to achieve site-specific, efficient and heritable germline mutations, which are required to perform advanced genome engineering and develop genetic control technologies in this important, but currently understudied, disease vector.

Embryo Microinjection Techniques for Efficient Site-Specific Mutagenesis in Culex quinquefasciatus

This protocol describes microinjection procedures for Culex quinquefasciatus embryos that are optimized to work with CRISPR/Cas9 gene editing tools. This technique can efficiently generate site-specific, heritable, germline mutations that can be used for building genetic technologies in this understudied disease vector.

Culex quinquefasciatus'ta Verimli Bölgeye Özgü Mutagenezi için Embriyo Mikroenjeksiyon Teknikleri

Culex quinquefasciatus is a vector of a diverse range of vector-borne diseases such as avian malaria, West Nile virus (WNV), Japanese encephalitis, ...

RNA Interference in Aquatic Beetles as a Powerful Tool for Manipulating Gene Expression at Specific Developmental Time Points

RNA interference (RNAi) remains a powerful technique that allows for the targeted reduction of gene expression through mRNA degradation. This technique is applicable to a wide variety of organisms and is highly efficient in the species-rich order Coleoptera (beetles). Here, we summarize the necessary steps for developing this technique in a novel organism and illustrate its application to the different developmental stages of the aquatic diving beetle Thermonectus marmoratus. Target gene sequences can be obtained cost-effectively through the assembly of transcriptomes against a close relative with known genomics or de novo. Candidate gene cloning utilizes a specific cloning vector (the pCR4-TOPO plasmid), which allows the synthesis of double-stranded RNA (dsRNA) for any gene with the use of a single common primer. The synthesized dsRNA can be injected into either embryos for early developmental processes or larvae for later developmental processes. We then illustrate how RNAi can be injected into aquatic larvae using immobilization in agarose. To demonstrate the technique, we provide several examples of RNAi experiments, generating specific knockdowns with predicted phenotypes. Specifically, RNAi for the tanning gene laccase2 leads to cuticle lightening in both larvae and adults, and RNAi for the eye pigmentation gene white produces a lightening/lack of pigmentation in eye tubes. In addition, the knockdown of a key lens protein leads to larvae with optical deficiencies and a reduced ability to hunt prey. Combined, these results exemplify the power of RNAi as a tool for investigating both morphological patterning and behavioral traits in organisms with only transcriptomic databases.

RNA interference is a widely applicable, powerful technique for manipulating gene expression at specific developmental stages. Here, we describe the necessary steps for implementing this technique in the aquatic diving beetle Thermonectus marmoratus, from the acquisition of gene sequences to the knockdown of genes that affect structure or behavior.

Belirli Gelişimsel Zaman Noktalarında Gen İfadesi Manipüle Etmek Için Güçlü Bir Araç Olarak Su Böcekleri RNA Girişim

RNA interference (RNAi) remains a powerful technique that allows for the targeted reduction of gene expression through mRNA degradation. This technique is ...

Çevre

Injecting Gryllus bimaculatus Eggs

Altering gene function in a developing organism is central to different kinds of experiments. While tremendously powerful genetic tools have been developed in traditional model systems, it is difficult to manipulate genes or messenger RNA (mRNA) in most other organisms. At the same time, evolutionary and comparative approaches rely on an exploration of gene function in many different species, necessitating the development and adaptation of techniques for manipulating expression outside currently genetically tractable species. This protocol describes a method for injecting reagents into cricket eggs to assay the effects of a given manipulation on embryonic or larval development. Instructions for how to collect and inject eggs with beveled needles are described. This relatively straightforward technique is flexible and potentially adaptable to other insects. One can gather and inject dozens of eggs in a single experiment, and survival rates for buffer-only injections improve with practice and can be as high as 80%. This technique will support several types of experimental approaches including injection of pharmacological agents, in vitro capped mRNA to express genes of interest, double-stranded RNA (dsRNA) to achieve RNA interference, use of clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) in concert with CRISPR-associated protein 9 (Cas9) reagents for genomic modification, and transposable elements to generate transient or stable transgenic lines.

Injecting Gryllus bimaculatus Eggs

Here we present a protocol to inject cricket eggs, a technique which serves as a foundational method in many experiments in the cricket, including, but not limited to, RNA interference and genomic manipulation.

Enjekte Gryllus bimaculatus Yumurta

Altering gene function in a developing organism is central to different kinds of experiments. While tremendously powerful genetic tools have been ...

Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

The western corn rootworm (WCR) is an important pest of corn and is well known for its ability to rapidly adapt to pest management strategies. Although RNA interference (RNAi) has proved to be a powerful tool for studying WCR biology, it has its limitations. Specifically, RNAi itself is transient (i.e. does not result in long-term Mendelian inheritance of the associated phenotype), and it requires knowing the DNA sequence of the target gene. The latter can be limiting if the phenotype of interest is controlled by poorly conserved, or even novel genes, because identifying useful targets would be challenging, if not impossible. Therefore, the number of tools in WCR&#39;s genomic toolbox should be expanded by the development of methods that could be used to create stable mutant strains and enable sequence-independent surveys of the WCR genome. Herein, we detail the methods used to collect and microinject precellular WCR embryos with nucleic acids. While the protocols described herein are aimed at the creation of transgenic WCR, CRISPR/Cas9-genome editing could also be performed using the same protocols, with the only difference being the composition of the solution injected into the embryos.

Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

Here we present protocols for collecting and microinjecting precellular western corn rootworm embryos for the purpose of performing functional-genomic assays such as germline transformation and CRISPR/Cas9-genome editing.

Western Mısır Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, embriyo mikroenjeksiyon Germline dönüştürme veya CRISPR/Cas9 genom düzenleme

The western corn rootworm (WCR) is an important pest of corn and is well known for its ability to rapidly adapt to pest management strategies. Although ...

Biyomühendislik

Microinjection of Corn Planthopper, Peregrinus maidis, Embryos for CRISPR/Cas9 Genome Editing

The corn planthopper, Peregrinus maidis, is&#160;a pest of maize and a vector of several maize viruses. Previously published methods describe the triggering of RNA interference (RNAi) in P. maidis through microinjection of double-stranded RNAs (dsRNAs) into nymphs and adults. Despite the power of RNAi, phenotypes generated via this technique are transient and lack long-term Mendelian inheritance. Therefore, the P. maidis toolbox needs to be expanded to include functional genomic tools that would enable the production of stable mutant strains, opening the door for researchers to bring new control methods to bear on this economically important pest. However, unlike the dsRNAs used for RNAi, the components used in CRISPR/Cas9-based genome editing and germline transformation do not easily cross cell membranes. As a result, plasmid DNAs, RNAs, and/or proteins must be microinjected into embryos before the embryo cellularizes, making the timing of injection a critical factor for success. To that end, an agarose-based egg-lay method was developed to allow embryos to be harvested from P. maidis females at relatively short intervals. Herein are provided detailed protocols for collecting and microinjecting precellular P. maidis embryos with CRISPR components (Cas9 nuclease that has been complexed with guide RNAs), and results of Cas9-based gene knockout of a P. maidis eye-color gene, white, are presented. Although these protocols describe CRISPR/Cas9-genome editing in P. maidis, they can also be used for producing transgenic P. maidis via germline transformation by simply changing the composition of the injection solution.

Microinjection of Corn Planthopper, Peregrinus maidis, Embryos for CRISPR/Cas9 Genome Editing

Herein are protocols for collecting and microinjecting precellular corn planthopper embryos for the purpose of modifying their genome via CRISPR/Cas9-based genome editing or for the addition of marked transposable elements through germline transformation.

Mısır Planthopper Mikroenjeksiyonu, Peregrinus maidis, CRISPR / Cas9 Genom Düzenleme için Embriyolar

The corn planthopper, Peregrinus maidis, is&#160;a pest of maize and a vector of several maize viruses. Previously published methods describe the ...

A Method for Microinjection of Patiria minata Zygotes

Echinoderms have long been a favorite model system for studies of reproduction and development, and more recently for the study of gene regulation and evolution of developmental processes. The sea star, Patiria miniata, is gaining prevalence as a model system for these types of studies which were previously performed almost exclusively in the sea urchins, Strongylocentrotus purpuratus and Lytechinus variegatus. An advantage of these model systems is the ease of producing modified embryos in which a particular gene is up or downregulated, labeling a group of cells, or introducing a reporter gene. A single microinjection method is capable of creating a wide variety of such modified embryos. Here, we present a method for obtaining gametes from P. miniata, producing zygotes, and introducing perturbing reagents via microinjection. Healthy morphant embryos are subsequently isolated for quantitative and qualitative studies of gene function. The availability of genome and transcriptome data for this organism has increased the types of studies that are performed and the ease of executing them.

A Method for Microinjection of Patiria minata Zygotes

Methods that produce morphant embryos are essential to study developmental mechanisms and gene regulatory networks. The sea star Patiria miniata is an emerging model system for these studies. Here we present a protocol for obtaining gametes, producing cultures of embryos, and rapid microinjection of zygotes from this species.

Mikroenjeksiyonu Bir Yöntem<em&gt; Patiria Minata</em&gt; Zigotların

Echinoderms have long been a favorite model system for studies of reproduction and development, and more recently for the study of gene regulation and ...

Biyoloji

Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis

The jewel wasp, Nasonia vitripennis, has become an efficient model system to study epigenetics of haplo-diploid sex determination, B-chromosome biology, host-symbiont interactions, speciation, and venom synthesis. Despite the availability of several molecular tools, including CRISPR/Cas9, functional genetic studies are still limited in this organism. The major limitation of applying CRISPR/Cas9 technology in N. vitripennis stems from the challenges of embryonic microinjections. Injections of embryos are particularly difficult in this organism and in general in many parasitoid wasps, due to small embryo size and the requirement of a host pupa for embryonic development. To address these challenges, Cas9 ribonucleoprotein complex delivery into female&#160;ovaries by adult injection, rather than embryonic microinjection, was optimized, resulting in both somatic and heritable germline edits. The injection procedures were optimized in pupae and female wasps using either ReMOT Control (Receptor-Mediated Ovary Transduction of Cargo) or BAPC (Branched Amphiphilic Peptide Capsules). These methods are shown to be effective alternatives to embryo injection, enabling site-specific and heritable germline mutations.

Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis

Here, we describe methods for efficient pupal and adult injections in Nasonia vitripennis as accessible alternatives to embryo microinjection, enabling functional analysis of genes of interest using either RNA-silencing via RNA interference (RNAi) or gene knockout via CRISPR/Cas9 genome editing.

Nasonia vitripennis'te RNAi ve CRISPR Gen Düzenleme için Pupal ve Yetişkin Enjeksiyonları

The jewel wasp, Nasonia vitripennis, has become an efficient model system to study epigenetics of haplo-diploid sex determination, B-chromosome biology, ...

Dünya Tarım Pest Böcek Embriyo Mikroenjeksiyon yoluyla Nükleik Asitler teslim edilmesi,

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler