Protokolümüz hemositlerde fagositik olayları değerlendirmek ve ölçmek için etkili ve tekrarlanabilir bir yaklaşım sağlar. Bu tekniğin en büyük avantajı, tek tek sineklerde genotipler arasındaki fagositik süreçlerdeki değişimleri tespit etmemizi sağlayan fagositik olayları tek tek hemositler içinde ölçebilmektir. Diseksiyon yapmak zor olabilir, bu nedenle bu tekniği ilk kez uygularken, tam prosedürü gerçekleştirmeden önce mümkün olduğunca diseksiyonlar yapın.
Enjeksiyon için cam iğneler hazırlayarak başlayın. Bir milimetrelik şırıngayı mineral yağla doldurun ve nano-enjektörle birlikte verilen 30 göstergeli hipodermik iğneyi takın. 30 gauge iğneyi çekilen kılcal iğnenin künt ucuna yerleştirin ve mineral yağla doldurun.
30 gauge iğneyi yavaşça çıkarın ve hava kabarcıklarının oluşmadığından emin olun. Kolluğu çıkarın ve mühürlü O-halkasını girintinyukarı bakacak şekilde yerleştirin. Metal piston üzerine büyük O-halka yerleştirin, sonra sıkma olmadan collet yeniden.
Metal pistonu yağ dolu cam iğnenin künt ucuna takın ve yavaşça daha büyük O-halkasına sokarak aşağı doğru itin. Sonra güvenli kadar kollet sıkın. İğneyi floro veya pH'ya duyarlı parçacıklarla doldurduktan sonra, sinekleri toraksın sternopleural plakasında enjekte edin.
Yeşil boya sinek gidiyor eğer enjeksiyon başarılı olur. Enjekte edilen sinekleri ilk ve son sineğin enjekte edildiği zamanı belirterek yeni bir besin şişesine yerleştirin. Tüm sinekler yiyeceklere sıkışmalarını önlemek için iyileşene kadar şişeyi yan tarafına yatırın.
Sinek ventral tarafını bir diseksiyon stereomikroskopu altında yönlendirin. Sonra toraks içine bir böcek iğnesi yerleştirin ve başka bir genital yakın karın en arka ucundan. Tüm sinekler sabitlendikten sonra, sinekleri kapsayacak kadar diseksiyon ortamı eklemek için bir transfer pipeti kullanın.
Mitelik makasla başı çıkarın ve karın daki arka pimin hemen üzerinde yatay bir kesi yapın, sonra da karının en ön ucunda başka bir kesi yapın. Karın boşluğunu açacak iki yatay kesiyi birbirine bağlayan dikey bir kesi yapın. Dorsal damar önlemek için emin olun, iç organları ve doku kaldırmak için forceps kullanın.
Gerekirse, miğkül kesme uçlarını sabitlemek için ek iğneler kullanın. Sonra mığla makas ile toraks çıkarın. Diseksiyon ortamını atın ve bir mililitre %4 PFA ile değiştirin, bu da diseksiyonları mümkün olduğunca ışıktan koruyarak.
20 rpm sallanan oda sıcaklığında 15 dakika diseksiyon düzeltin. Sonra fiksatif kaldırın ve 1X PBST bir mililitre ekleyin. İstenirse, diseksiyonları antikorlarla lekeleyin.
Bir mikroskop slayt üzerinde cuticles monte ettikten sonra, onları ventral tarafı yönlendirmek için forceps kullanın, ve sırt damarı görünür olduğundan emin olun. Genç ve yaşlı sinekler dorsal damar boyunca hemositlerin floresan görüntüleme siperatile fagositoz yapabilme yeteneği açısından değerlendirildi. Perikardin karşı bir antikor sadece dorsal damar boyunca hücrelerin sayılır sağlamak için kullanılmıştır.
Floresan etiketli E.coli partiküllerinin uzunluğu bir mikrometre ve hemositlerin çapı 10 mikrometre olduğundan, sadece DAPI pozitif çekirdeğin ortalanmış 10 mikrometre çapındaki floresan olaylar sayılmıştır. ImageJ yazılımı daha sonra olayları ölçmek için kullanılmıştır. Bu yordamı denerken, sineğin gerçekten enjekte edildiğini görselleştirmek ve zamanlamanın çok önemli olduğunu hatırlamak önemlidir.
Enjeksiyon ve diseksiyonları zamanında tamamlamak deneysel hatayı ve fagositik hızdaki olası değişimleri en aza indirmeye yardımcı olacaktır. Bu teknik, araştırmacıların hücresel bağışıklık, farklı kan hücrelerinin popülasyonları veya başarılı bir bağışıklık yanıtı sırasında fagositoyu AMP üretiminden ayırt etme gibi çeşitli araştırma konularını keşfetmelerine olanak sağlayacaktır.
