Nuestro protocolo proporciona un enfoque eficaz y repetible para evaluar y cuantificar eventos fagocíticos en hemocitos. La principal ventaja de esta técnica es que podemos cuantificar eventos fagocíticos dentro de hemocitos individuales lo que nos permite detectar variaciones en los procesos fagocíticos entre genotipos en moscas individuales. Realizar disecciones puede ser difícil, por lo que al realizar esta técnica por primera vez, practique las disecciones tanto como sea posible antes de llevar a cabo el procedimiento completo.
Comience preparando agujas de vidrio para inyección. Llene una jeringa de un milímetro con aceite mineral y adjunte la aguja hipodérmica del calibre 30 provista del nanoinyector. Inserte la aguja del calibre 30 en el extremo romo de una aguja capilar tirada y llénala con aceite mineral.
Retire lentamente la aguja del calibre 30 asegurándose de que no se formen burbujas de aire. Retire la pinza y coloque la junta tórica sellada con la sangría hacia arriba. Coloque la junta tórica más grande en el émbolo metálico y, a continuación, vuelva a colocar la pinza sin apretarla.
Inserte el émbolo metálico en el extremo romo de la aguja de vidrio llena de aceite y empújelo suavemente hacia abajo insertándolo en la junta tórica más grande. A continuación, apriete el collet hasta que esté seguro. Después de llenar la aguja con partículas sensibles al fluoro o al pH, inyecte las moscas en la placa esternopleural del tórax.
La inyección es exitosa si el tinte verde está entrando en la mosca. Coloque las moscas inyectadas en un vial de alimentos nuevo, teniendo en cuenta el momento en que se inyectó la primera y la última mosca. Colocar el vial de lado hasta que todas las moscas se hayan recuperado para evitar que se atasquen en el alimento.
Oriente el lado ventral de la mosca hacia arriba bajo un estereomicroscopio diseccionado. Luego inserte un pasador de insecto en el tórax y otro a través del extremo más posterior del abdomen cerca de los genitales. Una vez que todas las moscas han sido ancladas, utilice una pipeta de transferencia para agregar suficientes medios de disección para cubrir las moscas.
Retire la cabeza con tijeras de cutícula, y haga una incisión horizontal directamente por encima del pasador posterior en el abdomen, luego otra en el extremo más anterior del abdomen. Haga una incisión vertical que conecte las dos incisiones horizontales que abrirán la cavidad abdominal. Utilice fórceps para extraer los órganos y tejidos internos, asegurándose de evitar el vaso dorsal.
Si es necesario, utilice pasadores adicionales para fijar los extremos de corte de la cutícula. A continuación, retire el tórax con las tijeras de cutícula. Deseche el medio de disección y reemplácelo por un mililitro de 4%PFA, protegiendo las disecciones de la luz tanto como sea posible.
Fije las disecciones durante 15 minutos a temperatura ambiente mientras se balancea a 20 rpm. A continuación, quite el fijador y agregue un mililitro de 1X PBST. Si lo desea, manche las disecciones con anticuerpos.
Después de montar las cutículas en un portaobjetos del microscopio, utilice fórceps para orientarlas hacia arriba y asegúrese de que el vaso dorsal sea visible. Las moscas jóvenes y envejecidas fueron evaluadas por la capacidad específica de la edad para llevar a cabo la fagocitosis mediante imágenes fluorescentes de hemocitos a lo largo del vaso dorsal. Se utilizó un anticuerpo contra la pericardiina para asegurar que sólo se contaran las células a lo largo del vaso dorsal.
Dado que las partículas de E. coli con etiqueta fluorescente tienen un micrómetro de longitud y los hemocitos tienen 10 micrómetros de diámetro, solo se contaron eventos fluorescentes dentro de un diámetro de 10 micrómetros centrados en un núcleo DAPI positivo. El software ImageJ se utilizó entonces para cuantificar los eventos. Al intentar este procedimiento, es importante visualizar que la mosca se inyectó realmente y recordar que el tiempo es crítico.
Completar las inyecciones y dissecciones de manera oportuna ayudará a minimizar el error experimental y las posibles variaciones en la tasa fagocítica. Esta técnica permitirá a los investigadores explorar una variedad de temas de investigación, incluyendo preguntas sobre inmunidad celular, diferentes poblaciones de células sanguíneas o distinguir la fagocitosis de la producción de AMP durante una respuesta inmune exitosa.
