Damlacıklardan bir milyondan fazla üniforma parmak büyüklüğünde substrat üzerinde üretilmektedir. Ve tek DNA molekülleri her damlacık içine rastgele dağıtılır. Protein verimi bir damlacıktaki molekül sayısıile orantılıdır.
Tekniğimiz karmaşık protein ekspresyonu ve saflaştırma olmadan enzim aktivitesinin hızlı ve nicel ölçümü için kullanılabilir. Başlamak için, bir boyama raf üzerinde bir kapak cam ayarlayın ve sekiz azı lı sodyum hidroksit raf yerleştirin. Kapak camı ve boyama rafını oda sıcaklığında 15 dakika sonicate edin.
Boyama rafını sodyum hidroksitten çıkarın ve kapak camı 10 kez suyla durulayın. Kapak camı hava tabancasıyla kurulayın. Sonra fırında ve beş dakika boyunca 200 derece santigrat bir sıcak tabakta kapak cam kuru.
%0.05 aminosilane çözeltisi hazırlayın. Kapak camı bu çözeltiye batırın ve oda sıcaklığında bir saat kuluçkaya yatırın. Kapak camı saf suda beş kez durulayın.
Sonra bir hava tabancası kullanarak kapak cam kuru. Beş dakika boyunca 80 derece santigrat sıcak tabakta pişirin. Kapak cam yüzeyini spin kaplama için özelleştirilmiş bir vakum lu aynaya yerleştirin.
Cam substratının ortasına 70 ila 90 mikrolitre tip-A CYTOP polimer dağıtın. Sonra hemen polimer spin-coat. İlk polimer kaplama son mikrohaznöz dizinin kalitesine zarar verir.
Hava kabarcıkları tanıtmadan kapak camın ortasına polimer dağıtın. Köşelerde tutarak kaplamalı cam almak ve alüminyum folyo üzerine yerleştirin. 80 derece santigrat 30 dakika ve sonra 200 derece santigrat başka bir saat için pişirin.
Substrat merkezinde 0,2 ila 0,3 mililitre fotodirenç dağıtın. Hemen 60 saniye boyunca 6, 000 rpm photoresist spin-coat. Substrat kenarlarından fazla fotodirenç kaldırmak için etanol batırılmış bir silme kullanın.
Beş dakika boyunca 110 derece santigrat de substrat pişirin. Foto-rehidratasyon için, substrat 42-60% bağıl nem de 30 dakika bekletin maske hizalayıcı içine substrat yükleyin ve bir vakum temas modunda 25 saniye maruz. Daha sonra maruz kalan fotodirenç çözmek için beş dakika geliştirici substrat batırın.
Saf su kullanarak substratı 10 kez durulayın. Daha sonra hava tabancasını kullanarak substratı iyice kurulayın. Substratı reaktif iyon aşındırma makinesinin reaksiyon odasına yerleştirin ve fotodirenç kaplı CYTOP'u oksijen plazması ile aşındırın.
Gravürden sonra, oda sıcaklığında beş dakika boyunca aseton içinde substrat sonicating tarafından kalan photoresist kaldırın. Sonra beş dakika boyunca propanol içine substrat sonicate. Durulayın, sonicate, ve tekrar saf su kullanarak substrat durulayın el yazması açıklandığı gibi.
Sonra bir hava tabancası ile substrat kuru. Masaüstü kesici kullanarak, tanımlanan mikrokanal şekilleri içine çift kaplamalı yapışkan Kapton film bandı kesti. PDMS'nin kalıplanmasında usta olarak hizmet vermek için kesilmiş bant parçalarını düz bir Petri kabının dibine yerleştirin.
PDMS karışımını bant desenli Petri kabına dökün. Sonra petri kabını mini vakum odasına yerleştirin ve PDMS karışımını 1-3 saat ayırın. Sonra 60 derece santigrat bir fırında Petri çanak yerleştirin ve PDMS tedavi etmek için bir gecede bırakın.
PDMS iyileştikten sonra, Petri kabından kürlenmiş elastomeri soyun ve PDMS mikrokanal bloklarını kesmek için düz kablo kesici kullanın. Sonra her mikrokanalın her iki ucunda bir delik yumruk. Önceden hazırlanmış substrat mikrooda dizisi için bir alana sahip olacaktır.
PDMS mikrokanalını substratın bu kısmına yerleştirin. Ardından PDMS mikrokanalındaki deliklerden birine 200 mikrolitrelik pipet ucu takın. İlk olarak, CFPS reaksiyon çözümünü bir PCR tüpte hazırlayın.
Daha sonra, 200 mikrolitre filtre olmayan pipet ucu kullanarak çözeltinin 10 mikrolitresini çekin. Pipet ucunu PDMS mikrokanalının giriş deliğine takın ve çözelti mikrokanal çıkışından taşana kadar pipet pistonuna bastırın. FemDA cihazını önceden soğutulmuş alüminyum bir bloğa aktarın.
Mikrohazus dizi alanının yarı saydamdan saydama hızla döndüğünü doğrulayın. Önceden soğutulmuş floş yağı 300 mikrolitre çizin ve hemen mikrokanal giriş deliğinin pipet ucuna yağ aktarın. Floş yağı mikrokanala taşınır ve mikroodaların dışında bulunan aşırı reaksiyon çözeltisini dışarı taşır.
Aynı anda cihazdan iki takılı pipet ipucukaldırın. Cihazı hemen alüminyum bloktan parafin filmine taşıyın. Sızdırmazlık yağını içeren hazırlanan pipet ucunu PDMS mikrokanalının girişine takın ve yağ prizinden taşana kadar enjekte edin.
Femtolitre damlacıkları yağ tarafından ayrı ayrı mikroodalarda kapatılır. Defodaklanmış BF görüntüsünü açın. Her çerçeveden düzgün sürekli arka planlar kaldırmak için İşlem menüsünden Arka Planı Çıkar'ı seçin.
Yuvarlanan top yarıçapı için 20 girin. Önizleme kutusunu işaretleyin ve Tamam'ı seçin. Tüm görüntüleri işleyip işlemeyecekleri sorulduğunda Evet'i seçin.
Ardından, gürültüyü azaltmak için İşlem, Filtreler, Ortanca'yı seçin. Pikselyarıçapı için 2.0 girin. Önizleme kutusunu işaretleyin ve Tamam'ı seçin.
Tüm görüntüleri işleyip işlemeyecekleri sorulduğunda Evet'i seçin. Ardından, mikroodaların görüntülerini görüntünün arka planından ayırmak için Görüntü, Ayarla, Eşik'i seçin. Eklentiler menüsünden FemDA, FemDA Analysis'i seçin.
Tek bir mikro haznenin yaklaşık minimum ve maksimum piksel sayılarını girdi. Mikroodaların beklenen minimum ve maksimum daireselliği ve başlangıç ve bitiş karesi numaraları, ardından mikro odaları algılamak için Yatırım Getirisi Oluştur'u seçin. Başarıyla algılanan ROI'lar açılır menü ROITable'da gösterilir.
FemDA Çözümleme penceresinde, YG maskesi uygula'yı seçin. Mikro odaların doğru şekilde algılanıp algılanmadıgini görmek için görüntüyü inceleyin. Floresan görüntüsünü açın ve öne getirin.
Floresan resmine ROI'ları eklemek için YG maskesini tekrar uygula'yı tıklatın. FemDA Çözümleme penceresinde, görüntü uç noktası verilerini çözümlemek için Tek Çekim'i seçin. İlgili damlacık ortalama yoğunluğunu hesaplamak için her YG'nin üst uç piksellerini kullanmak için üst piksel sayısı için N girin.
Ardından, algılanan tüm damlacıkların ortalama yoğunluklarını hesaplamak için yoğunluğu ölçü'ye tıklayın. YGTable floresan görüntüden yeni verilerle güncelleştirilir ve histogram yeni bir pencerede görüntülenir. Metin Olarak Kaydet düğmesini tıklatarak verileri dışa aktarın.
Floresan solüsyon FemDA mikroodalarında kapsüllenmiş ve damlacık boyutu ile ilişkili floresan yoğunluğu mikroskopi ile ölçüldü. Damlacıkların dar boy dağılımı saptadı. Konfokal mikroskopiden elde edilen yeniden yapılan 3Boyutlu görüntü de zaman içinde tutarlı damlacık boyutunu gösterdi.
Damlacıklar oda sıcaklığında buharlaşma kaybı veya damlacıklar arasında çapraz kontaminasyon olmaksızın en az 24 saat stabildi. Floresan protein mNeonGreen FemDA sentezlendi. Ve yığın görüntü verileri eşzamanlı deodaklanmış parlak alan görüntüsü yardımıyla analiz edildi.
Her damlanın floresan yoğunluğu protein verimi ile ölçüldüğünde, histogram damlacık başına eşit olmayan sayıda DNA molekülü önerir. Farklı sayıda DNA molekülü içeren damlacıkların olasılığı Poisson dağılımına mükemmel bir uydu. FemDA'da her beş dakikada bir çekilen görüntülerle alkali fosfataz enziminin sentezi de gerçekleştirildi.
Reaksiyon, damlacıkların floresan yoğunluğunun daha önceki bir zaman noktalarında benzer bir şekilde gizli bir dağılım gösterdiğini ve histogram sonuçlarının damlacıklarda DNA moleküllerinin eşit olmayan sayılarının doğruladığını gösterdi. Tek tek damlacıklarda kapsüllenmiş tek DNA molekülü daha da kurtarılabilir, güçlendirilebilir ve sıralı olarak en yüksek protein taraması mümkün kılabilir. Küçük hacimli ve yüksek stabilite içeren damlacık tekniği, belirli biyobelirteçlerle kanser hastalıklarının hızlı ve hassas moleküler tanısına olanak sağlar.
