DNA ve RNA mikrodizileri nükleik asitler ve proteinler arasındaki etkileşimleri incelemek için çok yararlıdır, ama aynı zamanda sıra kitaplıklarının hazırlanması için uygun bir yöntemdir. Fotolitografi yüz binlerce benzersiz dizinin paralel olarak sentezlenmesine olanak sağlar ve şu anda mikrodiziler üzerinde RNA sentezi için tek doğrudan yöntemdir. Mikrodizilerin in situ fotolitografik sentezi de kimyasal olarak modifiye oligonükleotidlere genişletilebilir, örneğin peptit nükleik asitlerin iki ana floro su.
Mikrodizi üretim ve işleme sürecini görmek, bu karmaşık makinenin bilinen standart katı faz DNA sentezinden nasıl geliştirildiğini anlamada yardımcı olabilir. Bu yordamı metin protokolünde açıklandığı gibi mikrodizi tasarımı ve slayt işlevselleştirmesi ile başlatın. DNA sentezleyici UV LED'ini ve soğutma fanını açın.
Gelen UV ışığının odak noktasına bir UV yoğunluk ölçer takın ve açın. Bilgisayarda, WiCell Controller yazılımını başlatın. Mikromere cihazı açın ve başharfe çevirin.
DMD'ye sağ tıklayıp yük görüntüsünü seçerek tüm beyaz maske dosyalarını yükleyin. UVS simgesine sağ tıklayın ve UV deklanşöraçık seçin. Yoğunluk ölçerdeki güç değerini okuyun ve 60 saniye sayın.
60 saniye sonra güç değerini yeniden okuyun ve başlangıç ve bitiş değerlerini not edin. UV deklanşörünü seçerek deklanşörü kapatın ve yoğunluk ölçeri kapatın. Santimetre karemiliwatt ortalama UV yoğunluğu değerini hesaplayın.
WiCell yazılımında, iş, sıra ve protokol dosyalarını kendi alt pencerelerine yükleyin ve sıra ve protokol dosyalarını DNA sentezleyicisine göndermek için gönder'i tıklatın. Sentez hücresini monte etmek için hücrenin kuvars bloğuna kalın bir perfloroelastomer conta yerleştirin. Daha sonra ilk contanın üzerine delinmiş, işlevsel leştirilmiş bir mikroskop kaydırağı yerleştirin ve slaytlar üzerindeki deliklerin sentez hücresinin giriş ve çıkış borusuyla bağlantı kurduğunu doğrulayın.
İki deliği çevreleyen, delinmiş kaydırağın üzerine ikinci, ince bir politetrafloroetilen conta yerleştirin. Son olarak, ikinci conta üstüne ikinci, işlevsel ama delinmemiş slayt yerleştirin. Şimdi monte edilmiş çift substrat hücresinin üzerine 4 vidalı metal bir çerçeve yerleştirin Vidayı tork tornavida kullanarak aynı bağlama kuvvetine sıkın.
Giriş ve çıkış tüplerini DNA sentezleyicisine takın. Asetonitril yıkama hattını asal olarak takın ve asetonitrilin yüzeylerden doğru akışını doğrulayın. Asetonitril priming yedi döngügeçtikten sonra atık hattında asetonitril hacmini ölçün.
Bu hacim iki mililitre olmalıdır. Sentez hücresini gelen UV ışığının odak düzlemine takın. Kütüphane hazırlama durumunda, hücrenin arkasına ekstra bir giriş ve çıkış hattı takın ve arka odayı betakaroten çözeltisinin iki mililitresiyle doldurun.
Önce WiCell yazılımında Çalıştır'a tıklayarak senteze başlayın. İş dosyasındaki ilk bekleme komutunda DNA sentezleyicisine basın. Düzenli mikrodizilerin sentezinden sonra, hücreyi synthesizer'dan ayırın ve hücreyi sökün.
Sentez numarasını cam slaytlara takmak için elmas bir kalem kullanın. Her slaydın sentezedilmeyen yüzündeki sayıyı etch. Slaytları 50 mililitrelik santrifüj tüplere aktarın ve daha fazla kullanıma kadar kurutulmuş bir alanda saklayın.
Kütüphane mikrodizilerinin sentezinden sonra, önce betakaroten çözeltisini odadan boşaltın, sonra drenajdan önce beş mililitre metilen klorür dederek odayı iki kez yıkayın. DNA mikroarry deprotection için, etanol 20 mililitre ve EDA 20 mililitre ile boyama cam kavanoz doldurun. DNA'ya özel mikro diziliyi kavanoza dikey olarak yerleştirin, kapağı kapatın ve slaytları oda sıcaklığında iki saat boyunca korumak için bırakın.
İki saat sonra, cımbız kullanarak slaytları alın ve çift distile su ile iyice durulayın. Bir kurutucu onları depolamadan önce birkaç saniye için bir mikrodizi santrifüj slaytlar kuru. RNA mikrodizi deprotection için, 50 mililitrelik santrifüj tüp 20 mililitre trietilamin ve 30 mililitre asetonitrile kuru bir çözüm hazırlamak.
Santrifüj tüpüiçine bir RNA mikrodizi slayt aktarın, kapağı kapatın ve plastik sızdırmazlık filmi ile sarın. Yavaşça oda sıcaklığında bir saat ve 30 dakika boyunca bir orbital shaker üzerinde santrifüj tüp sallayın. Daha sonra, birkaç saniye mikrodizi santrifüj içinde kurutmadan önce 20 mililitre kuru asetonitril ile iki kez kaydırak çıkarın ve yıkayın.
İlk deprotection adımını takiben RNA kaydırakları hidrazin hidrat çözeltisine aktarın, kapağı kapatın ve plastik sızdırmazlık filmi ile sarın. Bir yörünge shaker hafifçe sallayarak iki saat sonra, slayt çıkarın ve kuru asetonitril 20 mililitre ile iki kez yıkayın. Sonra birkaç saniye mikrodizi santrifüj kuru.
Eğer RNA mikrodizi de DNA nükleotitleri içeriyorsa, üçüncü bir korumasız adım ile devam edin. 5 dakika oda sıcaklığında 5 dakika sonra bire bir EDA-etanol çözeltisi içeren 50 mililitrelik bir tüpe DNA/RNA mikrodizisini ekleyin, kaydırağı çıkarın ve 20 mililitre steril suyla mikrodiziyi iki kez yıkayın. Bir mikrodizi santrifüj slayt kuru ve bir kurutucu saklayın.
1.5 mililitrelik steril mikrosantrifüj tüpünde, metin protokolünde açıklandığı gibi Cy3 etiketli DNA içeren hibridizasyon tamponunu hazırlayın. Karışımı ve girdap çözeltisi. Hibritleştirme çözeltisinde her slayt ve pipet üzerine kendi kendine yapışkan 300 mikrolitre hibridizasyon odasını dikkatlice yerleştirin.
Yapışkan nokta ile odanın delikleri kapak ve alüminyum folyo tüm slayt sarın. Mikrodizi kaydırağı hibridizasyon fırınına yerleştirin, kapağını kapatın ve seçilen hibridizasyon sıcaklığında iki saat boyunca yavaşça döndürülsün. İki saat sonra, slayt ı ayırın, alüminyum folyo kaldırmak, hibridizasyon çözeltisi pipet, ve dikkatle hibridizasyon odası yırtmak.
Slaytları 30 mililitre Katı Olmayan Yıkama Tamponu içeren bir santrifüj tüpüne aktarın. Oda sıcaklığında iki dakika şiddetle çalkalayın. Kaydırağı 30 mililitre Sıkı Yıkama Tamponu içeren bir santrifüj tüpüne aktarın ve bir dakika boyunca şiddetle sallayın.
Son olarak, son yıkama tampon 30 mililitre içeren bir santrifüj tüp içine slayt aktarın. Birkaç saniye çalkalayın. Bir mikrodizi santrifüj slayt kuru.
Şimdi, kuru mikrodiziyi, sentez alanını aşağı bakacak şekilde mikrodizi tarayıcının slayt tutucuya yerleştirin. DNA kitaplıklarını korumak ve ayırmak için, slaytı 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne dekolte çözeltisine daldırın. Tüpü kapatın ve oda sıcaklığında iki saat boyunca orbital shaker'da hafifçe dönmeden önce plastik sızdırmazlık filmi ile sarın.
İki saat sonra, slaydı çıkarın ve havanın kurumasına izin vermeden önce 20 mililitre lik kuru asetonitile iki kez yıkayın. Bir pipet ile, şimdi fark sentez alanı üzerinde steril su 100 mikrolitre uygulayın. 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarmadan önce çözeltiyi birkaç kez yukarı ve aşağı borulayın.
İşlemi tekrarlayın ve aynı tüp eluate mikrodizi birleştirmek. Talaşı buharlaştırArak kuruluk için elüat ve sonra nükleaz içermeyen H2O 10 mikrolitre içine yeniden çözünür. Burada gösterilen bir melezizasyon tahlili sonuçları 25mer dizisinin DNA ve RNA sürümleriiçeren bir mikrodizi üzerinde yapılan.
Bu tsam, cy3 floresanının uyarma, emisyon spektrumuna karşılık gelen yeşil bir formatta görünür ve floresan yoğunluğu rasgele birimlerhalinde kaydedilir. Deneyler arasında mutlak floresan değerlerinde önemli değişkenlik vardır. Aynı üretim parametreleri ve aynı post-sentetik işleme kullanılarak üç bağımsız sentezin sonuçları gösterilmiştir.
25mer DNA, tamamlayıcı Cy3 etiketli DNA iplikçik hibrid, floresan sinyalleri 20, 000 ila 30, 000 arasında değişen herhangi bir yerde, çok nadiren yukarıda veya altında verecektir. 25mer RNA, aynı Cy3 etiketli DNA komplemanı için hibridize edildiğinde, 15, 000 ila 20, 000 arasında değişen ilgili özellikleri floresan yoğunlukları verecektir. Ancak, RNA/DNA dublekslerinin floresan yoğunluğu zaman zaman 8,000'in altına düşer, buna karşılık gelen DNA/DNA dubleksleri 20, 000 ila 30, 000 aralığında floresan olacaktır.
Bu gibi durumlarda, RNA sonuçları sub-optimal olarak kabul edilebilir. Diğer RNA tabanlı deneylerde olduğu gibi RNA mikrodizilerinin bozulmaya karşı hassas olduğunu ve steril koşullar altında ele alınması gerektiğini unutmamak gerekir. Mikrodizilerden toplanan nükleik asit kütüphaneleri DNA veya RNA diziliminde ve DNA'daki dijital bilgilerin kodlanmasında kullanılabilir.
NED doğrudan bakılması gereken yoğun bir UV ışığı üretir. Bu nedenle, cihaz kullanımdayken koruyucu gözlük takmak tavsiye edilir.
