Bu çalışma p53lab (BMSI, A*STAR) ve JCO VIP hibesinden (A*STAR) çekirdek bütçe ile desteklendi.

HEK293 hücre hattı protokol için kullanıldı ve Dulbecco'nun %10 Fetal Sığır Serumu, 2 mM L-glutamin ve 100 U/mL penisilin/streptomisin ile desteklenmiş Modifiye Kartal Orta'sında kültürlendi. Hücreler nemlendirilmiş bir ortamda %5 CO2 ile 37 °C'de kültürlendi.
1. eIF4E:eIF4G604-646 tamamlayıcı test yoluyla eIF4F karmaşık bozulmanın nicel değerlendirmesi
<ol><li>Hücre kültürü ve eIF4E geçici transfeksiyon:eIF4G604-646 tamamlayıcı test<ol>
<li>Tüm deneyler için 20'den az pasajlı yeni çözülmüş hücreler kullanın. 1. günde, standart bir hücre sayacı kullanarak hücre numarasını belirleyin ve Trypan mavi dışlama yöntemi13'ü kullanarak toplam uygulanabilir hücreleri sayın.</li>
		<li>2 mL standart büyüme ortamında kuyu başına 0,9 - 1,2 x 10 6 HEK 293 hücreli tohum6 kuyu plakaları. NOT: Yukarıda belirtilen hücre hatları içinde en iyi transfeksiyon verimliliğini elde etmek için, kaplamalı hücrelerin tohumlamadan sonraki gün% 70-90 birleştiğinden emin olun.</li>
		<li>2. günün sabahında, suba-eIF4E ve eIF4G604-646-SubB plazmid ile birlikte lipid bazlı transfeksiyon reaktifi kullanarak hücrelerin eş transfectleri (bkz. Malzeme Tablosu).<ol>
<li>9 μL lipozom bazlı çözeltiyi fenol kırmızısı olmadan 125 μL azaltılmış serum ortamı içeren bir tüpte seyreltin (bkz. Malzeme Tablosu)her transfeksiyon için ve oda sıcaklığında 5 dakika kuluçkaya yatırın.</li>
			<li>Her transfeksiyon tüpü için 125 μL azaltılmış serum ortamında her plazmidden 3 μg seyrelterek DNA'nın ana karışımını hazırlayın.</li>
			<li>DNA ana karışım tüpüne 12 μL arttırıcı reaktif ekleyin, iyice karıştırın ve hemen DNA'yı ekleyin: seyreltilmiş lipozomların her tüpüne 1:1 oranında arttırıcı ana karışımı. Oda sıcaklığında 15 dakika kuluçkaya yatır.</li>
			<li>DNA lipid kompleksini her kuyuya ekleyin ve hücreleri 24 saat boyunca% 5 CO2 ile 37 ° C inkübatörde kuluçkaya yatırın.</li>
		</ol>
</li>
		<li>3. günün sabahında, her birini 1 mL PBS ile iyice durulayın.</li>
		<li>PBS'yi çıkarın ve her kuyudaki hücreleri 37 °C'de 5 dakika boyunca 0,3 mL tripsin ile kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>Her kuyuya % 0 FCS içeren fenol kırmızısı içermeyen azaltılmış serum ortamının 2 mL'sini ekleyerek trypsin'i nötralize edin ve transfected hücreleri 15 mL'lik bir tüpe aktarın. NOT: Fenol kırmızısı luciferaz aktivitesini engelleyebilir; bu nedenle, hücreler bu adımdan itibaren fenol kırmızısı olmadan ortamda ele alınmalıdır.</li>
		<li>Hücreleri 290 x g'da 5 dakika döndürün ve ortamı aspire edin. Hücreleri% 0 FCS içeren fenol kırmızısı olmadan azaltılmış serum ortamının 2 mL'sinde yeniden kullanın. Adım 1.1'de açıklandığı gibi sayın.</li>
		<li>Tohum, %0 FCS içeren fenol kırmızısı olmayan 90 μL orta alanda kuyu başına 30.000 hücre yoğunluğunda 96 kuyu opak plakada HEK 293 hücrelerini trans enfekte etti. 3 farklı bileşik için aynı deneyde 3 teknik çoğaltma elde etmek için, kenarlardaki kuyular hariç hücrelere sahip plakaların tohum 60 kuyusu.</li>
		<li>Transfected hücreleri tohumlamadan hemen sonra, % 10 DMSO bileşik çözeltisinin 10 μL'sini ekleyin (bkz. adım 1.2).</li>
	</ol></li>
	<li>Bileşik hazırlama<ol>
<li>Faiz bileşiği %100 DMSO 'da (v/v) eriterek 1 mM bileşik stok çözümleri hazırlayın. Her bileşik titrasyon için 3 çoğaltmaya sahip olmak için, 1 mM bileşik stok çözeltisinin 8 μL'sini kullanın. NOT: Kullanılan 1 mM stok bileşiği hacmi ihtiyaç duyulandan daha fazladır. Bu, varsa pipetleme hatalarını dikkate almak için yapılır.</li>
		<li>Stok bileşik çözeltisinin 2 kat seri seyreltilmesini, 1 mM'lik stoğun 4 μL'si ile her titrasyon noktası için % 100 DMSO'nun 4 μL'sine gerçekleştirin. NOT: Tam bir bileşik titrasyon için başlangıç stoğundan %100 DMSO'da 9 seri seyreltme gerçekleştirin. Birden fazla bileşiğin test edilmesi gerekiyorsa, bu adımı ve sonraki seyreltmeleri kolaylaştırmak için bir 96 kuyu plakası ve çok kanallı bir pipet kullanın.</li>
		<li>%10 DMSO (v/v) (v/v) içinde 40 μL 10x çalışma çözümleri hazırlamak için 2 kat seri seyreltmenin her noktası için 36 μL HPLC sınıfı steril su ekleyin. 100 μM ila 0,39 μM %10 DMSO stok serisi, hücrelere eklendiğinde %1 DMSO'da 10 μM ila 0,039 μM arasında nihai bir çözüme yol açacaktır. Arıtma kontrolüne gelince, HPLC sınıfı steril suda% 10 DMSO sadece stok çözeltisi hazırlayın.</li>
		<li>Toplam 100 μL hacimde% 1 (v / v) kalıntı DMSO konsantrasyonu ile hedeflenen son konsantrasyonu elde etmek için 96 kuyu opak plakasındaki hücrelere 10 μL 10x çalışma çözeltisi ekleyin ve% 5 v / v atmosferik CO2ile 37 ° C'de 3 saat kuluçkaya yatırın.</li>
	</ol></li>
	<li>Luciferaz kompleasyonu ve uygulanabilirlik tahlilleri<ol>
<li>3 saat ilaçlamadan sonra, 1 hacimli substratı seyreltme reaktifinin 19 hacmiyle birleştirerek luciferaz substrat reaktifini hazırlamaya başlayın (üreticinin talimatlarına bakın). NOT: Luciferaz tahlili, piyasada bulunan bir kit kullanılarak gerçekleştirilir (bkz. Malzeme Tablosu).</li>
		<li>Hemen 25 μL substrat reaktif eklemek için çok kanallı bir pipet kullanın.</li>
		<li>Plakayı oda sıcaklığında yörüngesel bir çalkalayıcıda 50 dakika boyunca 350 rpm'de sallayın.</li>
		<li>Plaka okuyucu kullanarak lüminesansı değerlendirin. Bunu yapmak için ayna okuyucuyu lüminesansa ve emisyon filtresini 455'e ayarlayın. Ölçüm süresi 1 s olan 6,5 mm ölçüm yüksekliği kullanın.</li>
		<li>Hücre canlılığını yok etmek için, 33 μL canlılık tahlil reaktifi ekleyin ve plaka okuyucuyu kullanarak oda sıcaklığında 15 dakika sonra lüminesansı tekrar ölçün.</li>
		<li>Ayna okuyucuyu Lüminesans'a ve emisyon filtresini 600 nm'ye ayarlayarak plaka okuyucu ile lüminesansı değerlendirin. Ölçüm süresi 1 s olan 6,5 mm ölçüm yüksekliği kullanın. NOT: Uygulanabilirlik, üretici talimatlarına göre hücre içi ATP seviyesi hücre içi liziz üzerinde ölçülerek değerlendirilir. Bu durumda çoklama mümkündür, çünkü canlı test farklı bir emisyon dalga boyunda farklı bir luciferaz kullanır.</li>
		<li>Verileri 4 parametreli sığdırma eğrisi denklemine sığdırarak her bileşiğin IC50 değerlerini belirlemek için verileri kullanın: Y = ((A-D)/(1+((x/C)^B))) + D D ve A sayısal değerleri eğri sığdırma işleminde kısıtlanmalıdır: D = eIF4E:4G tamamlama testinden beklenen minimum eğri asemptot veya minimum teorik yanıt seviyesi için Y eksenindeki parlak değer. A = eIF4E:4G tamamlama testinden beklenen maksimal eğri asemptot veya maksimal teorik seviye yanıtı için Y ekseninde parlaklık değeri. NOT: Minimum yanıtın değeri %1 DMSO (v/v) kontrol tedavisinden, maksimum yanıtın değeri ise hücre canlılığı üzerinde hiçbir etkisi olmayan yüksek benzeşimli mTOR inhibitörünün maksimum tepkisinden elde edilir.</li>
	</ol></li>
</ol>2. eIF4E:eIF4G604-646 tahlil inhibisyonunu hücrelerde eIF4F karmaşık bozulması ile ilişkilendiren
<ol><li>Test tarafından ölçülen sinyalin, 1.1 adımında açıklandığı gibi, bileşik, tohum hücreleri tarafından eIF4E-eIF4G etkileşiminin fiziksel bozulmasına karşılık geldiğini onaylamak için.</li>
	<li>Ertesi gün, ortamı fenol kırmızısı içermeyen 1 mL azaltılmış serum ortamı ile değiştirin ve ilgi bileşiği ile 4 saat kuluçkaya yatırın. Toplam 1 mL hacimde %1 (v/v) kalıntı DMSO konsantrasyonu sağlayın. NOT: Sonuçla kolayca bir korelasyona izin vermek için, ölçülen tamamlayıcı test titrasyon eğrisinin başında, orta noktasında ve uç noktasında bileşik konsantrasyonlar kullanın.</li>
	<li>EIF4F ve eIF4E:4EBP1 komplekslerini izole etmek için Lyse hücreleri ve gerçekleştirilen m7GTP aşağı çekme. m7GTP aşağı çekme deneyinin nasıl gerçekleştirileceğine dair ayrıntılı prosedürler başka bir yerde bulunabilir14.</li>
	<li>Batı blot analizi ile m7GTP bağlı eIF4G, eIF4E ve 4EBP1 protein seviyelerini tespit edin ve ardından tamamlayıcı test sinyali inhibisyonu ile eIF4F karmaşık bozulması ile ilişkilidir.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Silvera, D., Formenti, S. C., Schneider, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+control+in+cancer.">Translational control in cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 10 (4), 254-266 (2010).</li><li>Gebauer, F., Hentze, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Mechanism+of+translational+control.">Molecular Mechanism of translational control.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 827-835 (2004).</li><li>Bhat, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+translation+machinery+in+cancer.">Targeting the translation machinery in cancer.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 14 (4), 261-278 (2015).</li><li>Pelletier, J., Graff, J., Ruggero, D., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+eIF4F+translation+initiation+complex:+a+critical+nexus+for+cancer+development.">Targeting the eIF4F translation initiation complex: a critical nexus for cancer development.</a> Cancer Research. 75 (2), 250-263 (2015).</li><li>Montanaro, L., Pandolfi, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation+of+mRNA+translation+in+oncogenesis:+the+role+of+eIF4E.">Initiation of mRNA translation in oncogenesis: the role of eIF4E.</a> Cell Cycle. 11, 1387-1389 (2004).</li><li>Merrick, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=eIF4E:+A+retrospective.">eIF4E: A retrospective.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (40), 24091-24099 (2015).</li><li>Marcotrigiano, J., Gingras, A. C., Sonenberg, N., Burley, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cap-dependent+translation+initiation+in+eukaryotes+is+regulated+by+a+molecular+mimic+of+eIF4G.">Cap-dependent translation initiation in eukaryotes is regulated by a molecular mimic of eIF4G.</a> Molecular Cell. 3 (6), 707-716 (1999).</li><li>Umenaga, Y., Paku, K. S., In, Y., Ishida, T., Tomoo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+function+of+the+second+eIF4E-binding+region+in+N-terminal+domain+of+eIF4G:+comparison+with+eIF4E-binding+protein.">Identification and function of the second eIF4E-binding region in N-terminal domain of eIF4G: comparison with eIF4E-binding protein.</a> Biochemical and Biophysical Research Communication. 414 (3), 462-467 (2011).</li><li>Gr&#252;ner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Structures+of+eIF4E-eIF4G+Complexes+Reveal+an+Extended+Interface+to+Regulate+Translation+Initiation.">The Structures of eIF4E-eIF4G Complexes Reveal an Extended Interface to Regulate Translation Initiation.</a> Molecular Cell. 64 (3), 467-479 (2016).</li><li>Gingras, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hierarchical+phosphorylation+of+the+translation+inhibitor+4E-BP1.">Hierarchical phosphorylation of the translation inhibitor 4E-BP1.</a> Genes and Development. 15 (21), 2852-2864 (2001).</li><li>Dixon, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoLuc+Complementation+Reporter+Optimized+for+Accurate+Measurement+of+Protein+Interactions+in+Cells.">NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells.</a> ACS Chemical Biology. 11 (2), 400-408 (2016).</li><li>Sun, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTOR+kinase+inhibitors+as+potential+cancer+therapeutic+drugs.">mTOR kinase inhibitors as potential cancer therapeutic drugs.</a> Cancer Letters. 340 (1), 1-8 (2013).</li><li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability.">Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Current Protocols in Immunology. , (2001).</li><li>Sekiyama, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanism+of+the+dual+activity+of+4EGI-1:+Dissociating+eIF4G+from+eIF4E+but+stabilizing+the+binding+of+unphosphorylated+4E-BP1.">Molecular mechanism of the dual activity of 4EGI-1: Dissociating eIF4G from eIF4E but stabilizing the binding of unphosphorylated 4E-BP1.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 112 (30), e4036-e4045 (2015).</li><li>Muller, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4E-BP+restrains+eIF4E+phosphorylation.">4E-BP restrains eIF4E phosphorylation.</a> Translation. 1 (2), e25819 (2013).</li><li>Frosi, Y., Usher, R., Lian, D. T. G., Lane, D. P., Brown, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+flux+in+signalling+pathways+through+measurements+of+4EBP1-mediated+eIF4F+complex+assembly.">Monitoring flux in signalling pathways through measurements of 4EBP1-mediated eIF4F complex assembly.</a> BMC Biology. (1), 40 (2019).</li><li>Ran, X., Gestwicki, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+protein-protein+interactions+(PPIs):+An+analysis+of+scaffold+choices+and+buried+surface+area.">Inhibitors of protein-protein interactions (PPIs): An analysis of scaffold choices and buried surface area.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 44, 75-86 (2018).</li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Bu makalede açıklanan yöntem, canlı hücrelerde eIF4G-eIF4E etkileşiminin doğrudan ölçümü yoluyla eIF4F karmaşık montajını nicel olarak izlemek için luciferaz tabanlı bir tamamlayıcılık tahlili kullanır. EIF4E-eIF4G kompleasyon sisteminin kullanımı için ayrıntıları sağladık ve ayrıca sistemin eIF4E-eIF4G etkileşiminin ilaç kaynaklı 4EBP1 aracılı ayrışması ölçümlemede son derece doğru olduğunu gösterdik16. Bu tahlilin verimini kolaylaştırmak için, bu makalede açıklanan deneysel kurulum 96 kuyu mikro plaka formatı kullanımı için tasarlanmıştır.
En iyi sonuçlar için, tahlil yapılırken iki kritik adım göz önünde bulundurulmalıdır. İlk olarak, deneyler arasındaki transfeksiyon verimliliği benzer kalmalıdır. Bu, düşük geçişli sayı hücrelerinin kullanılması ve tohumlama gününde hücrelerin titizlikle sayılmasıyla sağlanabilir. Hücre konfeksiyoni% 70-90'dan azsa lipid bazlı transfeksiyon reaktifi olan hücrelerin transfection yapılması önerilmediğinden, DNA transfeksiyon yapılmadan önce hücre konfeksiyonları da değerlendirilmelidir. İkinci olarak, tamamlayıcı testini bir hücre canlılık tahliliyle çoklamak önemlidir. Bazı bileşikler öncelikle zararlı etkiler yoluyla canlı hücrelerin sayısını azaltarak luciferaz sinyalini etkileyebilir. Bu nedenle, hedef dışı ve spesifik olmayan etkileri ele almak için eIF4E:eIF4G604-646 tamamlayıcı testten hemen sonra hücrenin canlılığını ölçmek önemlidir.
EIF4E ve eIF4G arasındaki gibi, hidrofobik yarıklardan yoksun, nispeten büyük ve düzlemci olan protein-protein arayüzleri, genellikle geleneksel küçük molekül terapötikleri (<500 MW)17tarafından "ilaçlanamaz" olarak kabul edilir. Bu nedenle, bu tür yüzeylerle (örneğin makrosiklik ve peptidomimetik bileşikler) verimli bir şekilde etkileşime giren yeni modalitelerin gelişimine artan bir ilgi vardır. Bununla birlikte, bu yeni modalitelerin çoğu doğuştan hücre zarını geçemez ve hedeflerine saldıramaz. Bu sorunları atlatmak için, birçok araştırma grubu yeni kimyasal optimizasyon ve hücresel teslimat stratejileri üzerine araştırmalar yürütmektedir. eIF4E:eIF4G604-646 canlı hücre PPI tahlili ve diğer benzer ÜFE türevli tahlillerin bu stratejilerin geliştirilmesinde ve doğrulandırılmasında önemli bir rol oynayacağını öngörüyoruz.

Gen ekspresyonunun kontrolü, büyüme çoğalması ve farklılaşma gibi hücresel programların doğru yürütülmesinde önemli bir rol oynar. Gen transkripsiyonu düzeyinde veya mRNA çevirisi düzeyinde bir düzenleyici kontrol mekanizması uygulanabilir. Son on yılda, daha sonraki uzama ve sonlandırma adımları yerine başlatma sürecinin modülasyonu ile çeviri kontrolünün, çok çeşitli biyolojik işlevleri oynayan belirli protein alt kümelerinin sentezini ince bir şekilde düzenleyebileceği giderek daha belirgin hale gelmiştir.
Sağkalım, anti-otofajik ve anti-apoptotik yanıtlarda yer alan mRNA'ların artan çevirisi birkaç kansere karışmıştır ve ayrıca sapkın aktivasyon veya çeviri başlatma faktörlerinin aşırı ekspresyonu ile nedensel olarak bağlantılıdır1.
eIF4F kompleksi, çeviri başlatmanın ana düzenleyicisidir. mRNA'ların 5' ucundaki kapak yapısını bağlayarak, eIF4F ilk mRNA-ribozom alımını yönlendiriyor ve buna karşılık zayıf çevrilmiş ökaryotikmRNA'larınmRNA çeviri verimliliğini artırıyor 2 . Kansere bağlı mRNA'ların eIF4F aracılı çevirisi, RAS / MAPK veya AKT / TOR yollarının anormal aktivasyonunu barındıran birçok kanser modeli için bildirilmiştir, bu da kanser hücrelerinin kendi neoplastik aktivitelerini artırmak için eIF4F'yi yükselttiğini göstermektedir. EIF4F karmaşık oluşumunu engelleyerek bu ilerleme döngüsünün bozulması, böylece çok umut verici bir terapötik stratejidir3,4.
eIF4F kompleksi (i) eIF4E, mRNA, (ii) eIF4A, RNA helicase ve (iii) eIF4G'nin 5' UTR'sinde bulunan kapak yapısıyla etkileşime giren eIF4F'nin kapak bağlama alt birliği, hem eIF4A hem de eIF4E ile etkileşime giren ve sonunda 40S ribozomal alt birliği5'iişe alan iskele proteini. eIF4E ile eIF4G ilişkisi fonksiyonel eIF4F komplekslerinin montajı için hız sınırlayıcı adımdır ve eIF4E bağlayıcı proteinler (4EBP'ler, üyeler 1, 2 ve 3)) tarafından olumsuz düzenlenir6. 4EBP, kurallı ve kurallı olmayan eIF4E bağlama dizileri7, 8,9'dan (insan eIF4E'de aa 604-646'yı kapsayan bölge) oluşan bir arayüz aracılığıyla eIF4E'ye eIF4G bağlama ile rekabet ederek, çeviride aktif olarak yer alan eIF4E havuzunu azaltır ve eIF4F karmaşık oluşumunu önler. Bu protein-protein etkileşimlerinin etkileşimi esas olarak 4EBP'nin rapamycin (mTOR) aracılı fosforilasyonunun memeli hedefi tarafından düzenlenir. Mitojenik uyaranlar üzerine, mTOR doğrudan 4E-BP protein ailesinin üyelerini fosforilize eder, eIF4E ile ilişkilerini azaltır ve böylece eIF4E-eIF4G etkileşimini ve fonksiyonel eIF4F komplekslerinin oluşumunu teşvikeder 10.
EIF4F karmaşık bütünlüğünü hedefleyen bileşikler geliştirmedeki büyük çabaya rağmen, canlı hücrelerde eIF4E-eIF4G etkileşiminin doğrudan bozulmasını ölçen tahlillerin olmaması hücresel aktif isabet bileşiklerinin aranmasını sınırlamıştır. EIF4E-eIF4G etkileşimi yoluyla eIF4F bütünlüğünün durumunu gerçek zamanlı olarak izlemek için bir koelenterazin analoga (örneğin, Nanolüc tabanlı kompleasyon tahlili) dayanan bir luciferaz tahlil uyguladık. Luciferaz kompleasyon protein sistemi, minimum kendi kendine ilişki ve stabilite için optimize edilmiş 18 kDa protein parçası (SubA) ve 11 amino asit peptit parçasından (SubB) oluşur11. Bir kez insan tam uzunlukta eIF4E ve insan eiF4G1 (aa 604-646) eIF4E etkileşim etki alanı ile bir füzyon ürünü olarak ifade edildikten sonra, iki etkileşim proteini SubA ve SubB parçasını birbirlerinin yakınına getirecek ve aktif luciferaz oluşumunu teşvik edecektir, bir hücre geçirgen substratı varlığında, sonunda parlak bir parlaklık sinyali üretecektir (Şekil 1). EIF4E:eIF4G604-646 kompleasyon sisteminin16.
Burada, canlı hücrelerde 4EBP1 aracılı eIF4E-eIF4G bozulmasını doğru bir şekilde ölçmek için eIF4E:eIF4G604-646 tamamlayıcı sisteminin (istek üzerine kullanılabilir) nasıl uygulanabileceğini açıklıyoruz. Ek olarak, şu anda klinik çalışmalar altında olan birkaç mTOR inhibitörünün etkilerini potansiyel kanser terapötik ilaçlar olarak ölçerek faydasını gösteriyoruz12. Hedef dışı etkiler genellikle ilaca özgü aktiviteyi maskelediğinden, eIF4E:eIF4G604-646 sistem ölçümünün çok yönlülüğünün, bunları dikkate almak için hücresel canlılığın ortogonal ölçümleriyle nasıl genişletilebileceğini de açıklıyoruz.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>293FT cells</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R70007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture microplate 96 well, F-Bottom</td>
			<td>greiner bio-one</td>
			<td>655083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell titer Glo 2.0</td>
			<td>PROMEGA</td>
			<td>G9241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Envision Multilabel Reader</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>not applcable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Finnpipette F2 Multichannel Pipettes 12-channels 30-300 ml</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4662070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Finnpipette F2 Multichannel Pipettes 12-channels 5-50 ml</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4662050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FUGENE6</td>
			<td>PROMEGA</td>
			<td>E2692</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td><a href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/L3000015" target="_blank">L3000015</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoBiT PPI Starter Systems</td>
			<td>PROMEGA</td>
			<td>N2014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimem I Reduced Serum Mediun, no phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11058021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>not appicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#947;-Aminophenyl-m7GTP (C10-spacer)-Agarose</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td>AC-155S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring eif4f assembly by measuring eif4e-eif4g interaction in live cells

eIF4F kompleksinin oluşumu, insanlarda sıklıkla onkojenik aktivasyona uğrayan sinyal yollarının yakınsaması için anahtar aşağı akış düğümü olarak gösterilmiştir. eIF4F, çeviri başlatmanın mRNA-ribozom işe alım aşamasında yer alan bir kapak bağlama kompleksidir. Birçok hücresel ve klinik öncesi kanser modelinde, eIF4F'nin deregülasyonu, kanserin çoğalması ve sağkalımında rol oynayan spesifik mRNA alt kümelerinin çevirisinin artmasına yol açar. eIF4F, kapak bağlama alt birliği eIF4E, helicase eIF4A ve iskele alt birliği eIF4G'den inşa edilmiş hetero-trimerik bir komplekstir. Aktif eIF4F komplekslerinin montajı için kritik olan eIF4E ve eIF4G proteinleri arasındaki protein-protein etkileşimidir. Bu makalede, canlı hücrelerde eIF4E-eIF4G etkileşiminin durumunu izleyen eIF4F derlemesini ölçmek için bir protokol açıklıyoruz. eIF4e:4G hücre bazlı protein-protein etkileşimi tahlili, eIF4F karmaşık bütünlüğündeki ilaç kaynaklı değişikliklerin doğru ve güvenilir bir şekilde değerlendirilmesini de sağlar. Bu yöntemin ticari olarak mevcut bileşiklerin aktivitesini doğrulamak veya eIF4F kompleksinin oluşumunu verimli bir şekilde bozan yeni bileşiklerin veya modalitelerin daha fazla taranması için uygulanabileceğini öngörüyoruz.

eIF4E:eIF4G604-646 kompleasyon sisteminin hassasiyetini doğrulamak için mTOR inhibitörleri kullanılarak eIF4F kompleks montajının 4EBP1 aracılı inhibisyonu değerlendirildi. 4EBP protein ailesinin mTORC1 kinaz bağımlı fosforilasyonunu inhibe ederek, mTOR inhibisyonu eIF4E'ye 4EBP1 ilişkisini geliştirir ve bu nedenle eIF4F sökme15. MTOR kinazlarının mekanistik olarak farklı inhibitörünün iki sınıfı test edilmiştir: mTORC1'in allosterik inhibitörleri olan ancak mTORC2 ve ATP rekabetçi tabanlı inhibitörler (örneğin, PP242) hem mTORC1 hem de mTORC2 kinaz katalitik aktivitesini inhibe etmek için tasarlanmış rapaloglar (örneğin, Rapamycin).
HEK293 hücreleri, adım 1'de açıklandığı gibi eIF4E:eIF4G604-646 kompleasyon sistemi ile transkred edildi. 24 saatlik transfeksiyondan sonra hücreler mTOR inhibitörleri PP242 ve rapamycin ile yeniden tohumlandı ve tedavi edildi (adım 1.2'de açıklandığı gibi). Tedaviden dört saat sonra, daha önce açıklandığı gibi lüminesans değerlendirildi ve ardından hücre canlılığı yapıldı. Şekil 2'degösterildiği gibi, PP242, 0,72 ± 0,04 μM'lik hesaplanmış bir IC50 ile sinyalin doza bağımlı bir inhibisyonunu üretirken, rapamycin için 6,88 ± 0,88 μM'lik bir IC50 türetilir (Şekil 2A). Plakalar daha sonra hücresel canlılık tahlilleri için çoklanmıştır(Şekil 2D). Bu analiz, ne PP242'nin ne de rapamycin'in hücre canlılığında önemli bir azalma yaratmadığını ve eIF4E:eIF4G604-646 kompleasyon sistemindeki lüminesanstaki azalmanın spesifik olmayan hücre ölümünden değil, eIF4E:4G etkileşiminin bozulmasından kaynaklandığını göstermektedir.
Bir m7GTP çekme deneyi, ilkeye karşılık gelen bileşik konsantrasyonlarla enfekte olmayan hücreleri inkübe ederek gerçekleştirilir, Şekil2'de ölçülen titrasyon eğrisinin orta ve uç noktaları,endojen eIF4E-eIF4G etkileşiminin 4EBP1 aracılı bozulmasının ölçülen eIF4E:eIF4G604-646 tahlil sinyaliyle ilişkili olduğunu göstermektedir (Şekil 2B, 2C). Bu sonuçlarla tutarlı olarak, PP242'nin HEK 293 hücrelerinde test edilen deneysel koşullar altında toplam 4EBP1 fosforilasyonun rapamycin'den daha güçlü bir inhibitörü olduğu gösterilmiştir (Şekil 3A), her iki inhibitör de mTOR sinyaline normal etki gösterirken, rapamycin mTORC1 substratlarına ve PP242'ye karşı daha aktif olmasıyla hem mTORC1 hem de mTORC2'yi hedef alan ( Şekil3B).
Birlikte ele alındığında, bu sonuçlar PP242'nin HEK293 hücrelerindeki rapamycin'den daha fazla eIF4F karmaşık oluşumunu bozmada daha etkili olduğunu ve eIF4E:eIF4G604-646 sisteminin canlı hücrelerde eIF4F karmaşık montajını doğru bir şekilde ölçebileceğini göstermiştir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60850/60850fig1.jpg"> Şekil 1: eIF4E:eIF4G604-646 kompleasyon sistemi. X (eIF4E) ve protein Y (eIF4G604-646)etkileşiminin SubA ve SubB füzyonlarının birbirleriyle yakınlaşmasını ve aktif luciferazı yeniden oluşturmasını nasıl sağladığını gösteren şematik gösterim. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/60850/60850fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60850/60850fig2.jpg"> Şekil 2: eIF4F kompleksinin 4EBP1 aracılı bozulması. (A) PP242 ve rapamycin eIF4E:eIF4G604-646 tahlil titrasyonu transfected HEK 293 hücrelerinde eIF4E ve eIF4G arasındaki etkileşimi modeller. (B,C) HEK 293 ekstraktlarında ve m7GTP'de sırasıyla pp242 veya Rapamycin konsantrasyonu farklı olan kültürlü hücrelerin inkübasyonundan sonra aşağı çekmekte olan endojen eIF4E, eIF4G ve 4EBP1 seviyesini gösteren Batı blot analizi. (D) Hücre canlılığı ve lüminesans için çoklanmış hücrelerin değerlendirildiği A'da tedavi edildi. Tüm değerler ortalama ± SD'± temsil eder (n=3). Bu rakam16'dan değiştirilmiştir. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/60850/60850fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60850/60850fig3.jpg"> Şekil 3: mTOR inhibisyonunun 4EBP1 fosforilasyon üzerindeki diferansiyel etkisi. (A) PP242 ve rapamycin konsantrasyonu ile tedavi edilen trans enfekte olmayan HEK293 hücrelerinde 4EBP1 fosforilasyon durumunun Batı blot analizi. (B) Çift MTORC1/2 aktif saha inhibitörü PP242 veya mTORC1 Rapamycin allosterik inhibitörü ile tedavi edilen transktasyonsuz HEK293 hücrelerinde AKT ve S6 fosforilasyon durumunun Batı blot analizi. Beta actin, toplam 4EBP1, AKT ve S6'nın yanı sıra yükleme kontrolü için görselleştirildi. Bu rakam16'dan değiştirilmiştir. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/60850/60850fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring eIF4F Assembly by Measuring eIF4E-eIF4G Interaction in Live Cells at JoVE.com

Monitoring eIF4F Assembly by Measuring eIF4E-eIF4G Interaction in Live Cells

Burada, kullanıcının eIF4F karmaşık dinamiklerinin ilaç kaynaklı pertürbasyonunu tarama formatlarında değerlendirmesini sağlayacak canlı hücrelerde eIF4E-eIF4G etkileşimini ölçmek için bir protokol sunuyoruz.

Canlı Hücrelerde eIF4E-eIF4G Etkileşimi Ölçülerek eIF4F Montajlarını İzleme

Formation of the eIF4F complex has been shown to be the key downstream node for the convergence of signalling pathways that often undergo&#160;oncogenic ...

monitoring-eif4f-assembly-measuring-eif4e-eif4g-interaction-live

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Cancer Research

3.0K Görüntüleme.  A*STAR (Agency for Science, Technology and Research). Burada, kullanıcının eIF4F karmaşık dinamiklerinin ilaç kaynaklı pertürbasyonunu tarama formatlarında değerlendirmesini sağlayacak canlı hücrelerde eIF4E-eIF4G etkileşimini ölçmek için bir protokol sunuyoruz.

Video: Monitoring eIF4F Assembly by Measuring eIF4E-eIF4G Interaction in Live Cells

Live Imaging to Study Microtubule Dynamic Instability in Taxane-resistant Breast Cancers

Taxanes such as docetaxel belong to a group of microtubule-targeting agents (MTAs) that are commonly relied upon to treat cancer. However, taxane resistance in cancerous cells drastically reduces the effectiveness of the drugs' long-term usage. Accumulated evidence suggests that the mechanisms underlying taxane resistance include both general mechanisms, such as the development of multidrug resistance due to the overexpression of drug-efflux proteins, and taxane-specific mechanisms, such as those that involve microtubule dynamics. 
Because taxanes target cell microtubules, measuring microtubule dynamic instability is an important step in determining the mechanisms of taxane resistance and provides insight into how to overcome this resistance. In the experiment, an in vivo method was used to measure microtubule dynamic instability. GFP-tagged &#945;-tubulin was expressed and incorporated into microtubules in MCF-7 cells, allowing for the recording of the microtubule dynamics by time lapse using a sensitive camera. The results showed that, as opposed to the non-resistant parental MCF-7CC cells, the microtubule dynamics of docetaxel-resistant MCF-7TXT cells are insensitive to docetaxel treatment, which causes the resistance to docetaxel-induced mitotic arrest and apoptosis. This paper will outline this in vivo method of measuring microtubule dynamic instability.

In this paper, we report a protocol describing an in vivo method to measure microtubule dynamic instability in docetaxel-resistant breast cancer cells (MCF-7TXT). In this method, a deconvolution microscopy imaging system is used to detect the expression of GFP-tubulin in target cells.

Canlı Görüntüleme taksan dirençli Meme Kanserlerinde Mikrotubul dinamik dengesizlik Eğitim için

Taxanes such as docetaxel belong to a group of microtubule-targeting agents (MTAs) that are commonly relied upon to treat cancer. However, taxane ...

Kanser Araştırmaları

A Spheroid Killing Assay by CAR T Cells

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric antigen receptor (CAR) redirected T cells obtained the most spectacular results, in particular with pediatric B-acute lymphoblastic leukemia (B-ALL). Classical validation methods of CAR T cells rely on the use of specificity and functionality assays of the CAR T cells against target cells in suspension and in xenograft models. Unfortunately, observations made in vitro are often decoupled from results obtained in vivo and a lot of effort and animals could be spared by adding another step: the use of 3D culture. The production of spheroids out of potential target cells that mimic the 3D structure of the tumor cells when they are engrafted into the animal model represents an ideal alternative. Here, we report an affordable, reliable and easy method to produce spheroids from a transduced colorectal cell line as a validation tool for adoptive cell therapy (exemplified here by CD19 CAR T cells). This method is coupled with an advanced live imaging system that can follow spheroid growth, effector cells cytotoxicity and tumor cell apoptosis.

This protocol is designed to assess immunotherapeutic redirected T-cell (CAR T-cell) cytotoxicity against 3D structured cancerous cells (spheroids) in real time.

Bir küresel öldürme tahlil araba T hücreleri tarafından

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric ...

Detection and Monitoring of Tumor Associated Circulating DNA in Patient Biofluids

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular sub-classification and temporal monitoring of tumor response to therapy. Here, we describe our dPCR-based method for the detection of tumor somatic mutations in cell free DNA (cfDNA), readily available in&#160;patient biofluids. Although limited in the number of mutations that can be tested for in each assay, this method provides a high level of sensitivity and specificity. Monitoring of mutation abundance, as calculated by MAF, allows for the evaluation of tumor response to therapy, thereby providing a much-needed supplement to radiographic imaging.

Here, we present a protocol to detect tumor somatic mutations in circulating DNA present in patient biological fluids (biofluids). Our droplet digital polymerase chain reaction (dPCR)-based method enables quantification of the tumor mutation allelic frequency (MAF), facilitating a minimally invasive complement to diagnosis and temporal monitoring of tumor response.

Hasta Biofluidinde tümör Ilişkili sirkülasyon DNA 'Sı tespiti ve Izlenmesi

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular ...

Semi-automatic PD-L1 Characterization and Enumeration of Circulating Tumor Cells from Non-small Cell Lung Cancer Patients by Immunofluorescence

Circulating tumor cells (CTCs) derived from the primary tumor are shed into the bloodstream or lymphatic system. These rare cells (1&#8722;10 cells per mL of blood) warrant a poor prognosis and are correlated with shorter overall survival in several cancers (e.g., breast, prostate and colorectal). Currently, the anti-EpCAM-coated magnetic bead-based CTC capturing system is the gold standard test approved by the U.S. Food and Drug Administration (FDA) for enumerating CTCs in the bloodstream. This test is based on the use of magnetic beads coated with anti-EpCAM markers, which specifically target epithelial cancer cells. Many studies have illustrated that EpCAM is not the optimal marker for CTC detection. Indeed, CTCs are a heterogeneous subpopulation of cancer cells and are able to undergo an epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) associated with metastatic proliferation and invasion. These CTCs are able to reduce the expression of cell surface epithelial marker EpCAM, while increasing mesenchymal markers such as vimentin. To address this technical hurdle, other isolation methods based on physical properties of CTCs have been developed. Microfluidic technologies enable a label-free approach to CTC enrichment from whole blood samples. The spiral microfluidic technology uses the inertial and Dean drag forces with continuous flow in curved channels generated within a spiral microfluidic chip. The cells are separated based on the differences in size and plasticity between normal blood cells and tumoral cells. This protocol details the different steps to characterize the programmed death-ligand 1 (PD-L1) expression of CTCs, combining a spiral microfluidic device with customizable immunofluorescence (IF) marker set.

The characterization of circulating tumor cells (CTCs) is a popular topic in translational research. This protocol describes a semi-automatic immunofluorescence (IF) assay for PD-L1 characterization and enumeration of CTCs in non-small cell lung cancer (NSCLC) patient samples.

İmmünfluoresans Ile Küçük Hücreli Olmayan Akciğer Kanseri Hastalarından Dolaşımdaki Tümör Hücrelerinin Yarı Otomatik PD-L1 Karakterizasyonu ve Numaralandırılması

Circulating tumor cells (CTCs) derived from the primary tumor are shed into the bloodstream or lymphatic system. These rare cells (1&#8722;10 cells per mL ...

In Vitro Assay to Study Tumor-macrophage Interaction

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a malignant brain tumor with no cure, has up to a half the tumor mass TAMs. TAMs can be pro-tumoral or anti-tumoral, depending on the activation of specific genes in the cells. Genetic mutations in the tumors, through regulating cytokine expression, can affect recruitment of TAMs to the tumor microenvironment. Here, we describe a quantitative cell-based assay to assess macrophage recruitment by the conditioned medium from the tumor cells. This assay uses the human macrophage cell line MV-4-11 to study macrophage attraction by the conditioned medium from glioblastoma, allowing for high reproducibility and low variability. Data generated with this assay can contribute to a better understanding of the interaction between the tumor and the tumor microenvironment. Similar assay can be used to assess interaction between the tumor cells and other immune cells, including T cells and natural killer (NK) cells.

This article represents a useful in vitro assay to evaluate the capability of conditioned medium from tumor cells to attract macrophages.

In vitro assay tümör çalışma-macrophage etkileşim

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a ...

Monitoring Cancer Cell Invasion and T-Cell Cytotoxicity in 3D Culture

Significant progress has been made in treating cancer with immunotherapy, although a large number of cancers remain resistant to treatment. A limited number of assays allow for direct monitoring and mechanistic insights into the interactions between tumor and immune cells, amongst which, T-cells play a significant role in executing the cytotoxic response of the adaptive immune system to cancer cells. Most assays are based on two-dimensional (2D) co-culture of cells due to the relative ease of use but with limited representation of the invasive growth phenotype, one of the hallmarks of cancer cells. Current three-dimensional (3D) co-culture systems either require special equipment or separate monitoring for invasion of co-cultured cancer cells and interacting T-cells.
Here we describe an approach to simultaneously monitor the invasive behavior in 3D of cancer cell spheroids and T-cell cytotoxicity in co-culture. Spheroid formation is driven by enhanced cell-cell interactions in scaffold-free agarose microwell casts with U-shaped bottoms. Both T-cell co-culture and cancer cell invasion into type I collagen matrix are performed within the microwells of the agarose casts without the need to transfer the cells, thus maintaining an intact 3D co-culture system throughout the assay. The collagen matrix can be separated from the agarose cast, allowing for immunofluorescence (IF) staining and for confocal imaging of cells. Also, cells can be isolated for further growth or subjected to analyses such as for gene expression or fluorescence activated cell sorting (FACS). Finally, the 3D co-culture can be analyzed by immunohistochemistry (IHC) after embedding and sectioning. Possible modifications of the assay include altered compositions of the extracellular matrix (ECM) as well as the inclusion of different stromal or immune cells with the cancer cells.

The presented approach simultaneously evaluates cancer cell invasion in 3D spheroid assays and T-cell cytotoxicity. Spheroids are generated in a scaffold-free agarose multi-microwell cast. Co-culture and embedding in type I collagen matrix are performed within the same device which allows to monitor cancer cell invasion and T-cell mediated cytotoxicity.

3D Kültürde Kanser Hücre İstilası ve T-Hücre Sitotoksisitesi İzleme

Significant progress has been made in treating cancer with immunotherapy, although a large number of cancers remain resistant to treatment. A limited ...

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile conditions. Different tests seek to identify and quantify these hallmarks of cancerous cells; however, they often focus on a single aspect of cellular transformation and, in fact, multiple tests are required for their proper characterization. The purpose of this work is to provide researchers with a set of tools to assess cellular transformation in vitro from a broad perspective, thereby making it possible to draw sound conclusions.
A sustained proliferative signaling activation is the major feature of tumoral tissues and can be easily monitored under in vitro conditions by calculating the number of population doublings achieved over time. Besides, the growth of cells in 3D cultures allows their interaction with surrounding cells, resembling what occurs in vivo. This enables the evaluation of cellular aggregation and, together with immunofluorescent labeling of distinctive cellular markers, to obtain information on another relevant feature of tumoral transformation: the loss of proper organization. Another remarkable characteristic of transformed cells is their capacity to grow without attachment to other cells and to the extracellular matrix, which can be evaluated with the anchorage assay.
Detailed experimental procedures to evaluate cell growth rate, to perform immunofluorescent labeling of cell lineage markers in 3D cultures, and to test anchorage-independent cell growth in soft agar are provided. These methodologies are optimized for Breast Primary Epithelial Cells (BPEC) due to its relevance in breast cancer; however, procedures can be applied to other cell types after some adjustments.

This protocol provides experimental in vitro tools to evaluate the transformation of human mammary cells. Detailed steps to follow-up cell proliferation rate, anchorage-independent growth capacity, and distribution of cell lineages in 3D cultures with basement membrane matrix are described.

İnsan Meme Epitel Hücrelerinde Onkojenik Dönüşümün İn Vitro Değerlendirilmesi

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile ...

A Three-Dimensional Spheroid Model to Investigate the Tumor-Stromal Interaction in Hepatocellular Carcinoma

The aggressiveness and lack of well-tolerated and widely effective treatments for advanced hepatocellular carcinoma (HCC), the predominant form of liver cancer, rationalize its rank as the second most common cause of cancer-related death. Preclinical models need to be adapted to recapitulate the human conditions to select the best therapeutic candidates for clinical development and aid the delivery of personalized medicine. Three-dimensional (3D) cellular spheroid models show promise as an emerging in vitro alternative to two-dimensional (2D) monolayer cultures. Here, we describe a 3D tumor spheroid&#160;model which exploits the ability of individual cells to aggregate when maintained in hanging droplets, and is more representative of an in vivo environment than standard monolayers. Furthermore, 3D spheroids can be produced by combining homotypic or heterotypic cells, more reflective of the cellular heterogeneity in vivo, potentially enabling the study of environmental interactions that can influence progression and treatment responses. The current research optimized the cell density to form 3D homotypic and heterotypic tumor spheroids by immobilizing cell suspensions on the lids of standard 10 cm3 Petri dishes. Longitudinal analysis was performed to generate growth curves for homotypic versus heterotypic tumor/fibroblasts spheroids. Finally, the proliferative impact of fibroblasts (COS7 cells) and liver myofibroblasts (LX2) on homotypic tumor (Hep3B) spheroids was investigated. A seeding density of 3,000 cells (in 20 &#181;L media) successfully yielded Huh7/COS7 heterotypic spheroids, which displayed a steady increase in size up to culture day 8, followed by growth retardation. This finding was corroborated using Hep3B homotypic spheroids cultured in LX2 (human hepatic stellate cell line) conditioned medium (CM). LX2 CM triggered the proliferation of Hep3B spheroids compared to control tumor spheroids. In conclusion, this protocol has shown that 3D tumor spheroids can be used as a simple, economical, and prescreen in vitro tool to study tumor-stromal interactions more comprehensively.

Comprehensive in vitro models that faithfully recapitulate the relevant human disease are lacking. The current study presents three-dimensional (3D) tumor spheroid creation and culture, a reliable in vitro tool to study the tumor-stromal interaction in human hepatocellular carcinoma.

Hepatosellüler Karsinomdaki Tümör-Stromal Etkileşimi Araştırmak İçin Üç Boyutlu Sferoid Modeli

The aggressiveness and lack of well-tolerated and widely effective treatments for advanced hepatocellular carcinoma (HCC), the predominant form of liver ...

Modeling Brain Metastasis by Internal Carotid Artery Injection of Cancer Cells

Brain metastasis is a cause of severe morbidity and mortality in cancer patients. Critical aspects of metastatic diseases, such as the complex neural microenvironment and stromal cell interaction, cannot be entirely replicated with in vitro assays; thus, animal models are critical for investigating and understanding the effects of therapeutic intervention. However, most brain tumor xenografting methods do not produce brain metastases consistently in terms of the time frame and tumor burden. Brain metastasis models generated by intracardiac injection of cancer cells can result in unintended extracranial tumor burden and lead to non-brain metastatic morbidity and mortality. Although intracranial injection of cancer cells can limit extracranial tumor formation, it has several caveats, such as the injected cells frequently form a singular tumor mass at the injection site, high leptomeningeal involvement, and damage to brain vasculature during needle penetration. This protocol describes a mouse model of brain metastasis generated by internal carotid artery injection. This method produces intracranial tumors consistently without the involvement of other organs, enabling the evaluation of therapeutic agents for brain metastasis.

Brain metastasis is a cause of severe morbidity and mortality in cancer patients. Most brain metastasis mouse models are complicated by systemic metastases confounding analysis of mortality and therapeutic intervention outcomes. Presented here is a protocol for internal carotid injection of cancer cells that produces consistent intracranial tumors with minimal systemic tumors.

Kanser Hücrelerinin İç Karotis Arter Enjeksiyonu ile Beyin Metastazının Modellenmesi

Brain metastasis is a cause of severe morbidity and mortality in cancer patients. Critical aspects of metastatic diseases, such as the complex neural ...

Multiparametric Tumor Organoid Drug Screening Using Widefield Live-Cell Imaging for Bulk and Single-Organoid Analysis

Patient-derived tumor organoids (PDTOs) hold great promise for preclinical and translational research and predicting the patient therapy response from ex vivo drug screenings. However, current adenosine triphosphate (ATP)-based drug screening assays do not capture the complexity of a drug response (cytostatic or cytotoxic) and intratumor heterogeneity that has been shown to be retained in PDTOs due to a bulk readout. Live-cell imaging is a powerful tool to overcome this issue and visualize drug responses more in-depth. However, image analysis software is often not adapted to the three-dimensionality of PDTOs, requires fluorescent viability dyes, or is not compatible with a 384-well microplate format. This paper describes a semi-automated methodology to seed, treat, and image PDTOs in a high-throughput, 384-well format using conventional, widefield, live-cell imaging systems. In addition, we developed viability marker-free image analysis software to quantify growth rate-based drug response metrics that improve reproducibility and correct growth rate variations between different PDTO lines. Using the normalized drug response metric, which scores drug response based on the growth rate normalized to a positive and negative control condition, and a fluorescent cell death dye, cytotoxic and cytostatic drug responses can be easily distinguished, profoundly improving the classification of responders and non-responders. In addition, drug-response heterogeneity can by quantified from single-organoid drug response analysis to identify potential, resistant clones. Ultimately, this method aims to improve the prediction of clinical therapy response by capturing a multiparametric drug response signature, which includes kinetic growth arrest and cell death quantification.

This protocol describes a semi-automated method for medium- to high-throughput organoid drug screenings and microscope-agnostic, automated image analysis software to quantify and visualize multiparametric, single-organoid drug responses to capture intratumor heterogeneity.

Toplu ve Tek-Organoid Analizi için Geniş Alan Canlı Hücre Görüntüleme Kullanılarak Multiparametrik Tümör Organoid İlaç Taraması

Patient-derived tumor organoids (PDTOs) hold great promise for preclinical and translational research and predicting the patient therapy response from ex ...