Este trabalho foi apoiado pelo orçamento central do p53lab (BMSI, A*STAR) e da concessão VIP JCO (A*STAR).

A linha celular HEK293 foi utilizada para o protocolo e foi cultivada no Medium De Águia Modificada de Dulbecco, suplementada com soro bovino fetal de 10%, 2 mM L-glutamina e 100 penicilina/estreptomicina U/mL. As células foram cultivadas a 37 °C com 5% de CO2 em um ambiente umidificado.
1. Avaliação quantitativa da interrupção do complexo eIF4F via ensaio de complementação eIF4E:eIF4G604-646
<ol><li>Ensaio de complementação de cultura celular e transfecção transitória de eIF4E:eIF4G604-646 ensaio de complementação<ol>
<li>Use células recém-descongeladas com menos de 20 passagens para todos os experimentos. No primeiro dia, determine o número de célula usando um contador de células padrão e conte as células viáveis totais usando o método de exclusão azul Trypan13.</li>
		<li>Sementes 6-bem placas com 0.9 - 1.2 x 106 de células HEK 293 por poço em 2 mL de meio de crescimento padrão. NOTA: Para alcançar a melhor eficiência de transfecção dentro das linhas celulares indicadas acima, certifique-se de que as células banhadas estejam 70-90% confluentes no dia seguinte à semeadura.</li>
		<li>Na manhã do dia 2, células co-transfeito com SubA-eIF4E e eIF4G604-646-Plasmid SubB usando um reagente de transfecção à base de lipídio (ver Tabela de Materiais) conforme descrito abaixo.<ol>
<li>Diluir 9 μL de solução à base de lipossom em um tubo contendo 125 μL de meio soro reduzido sem vermelho fenol (ver Tabela de Materiais) para cada transfecção e incubar à temperatura ambiente por 5 minutos.</li>
			<li>Prepare a mistura mestre do DNA diluindo 3 μg de cada plasmídeo em 125 μL de meio sérico reduzido para cada tubo de transfecção.</li>
			<li>Adicione 12 μL de reagentes de melhorador ao tubo de mistura mestre de DNA, misture bem e adicione imediatamente o DNA: melhore a mistura mestre de um tubo de lipossomos diluídos em uma proporção 1:1. Incubar por 15 minutos em temperatura ambiente.</li>
			<li>Adicione o complexo DNA-lipídide a cada poço e incuba as células em uma incubadora de 37 °C com 5% de CO2 por 24 h.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Na manhã do dia 3, enxágue cada poço com 1 mL de PBS.</li>
		<li>Remova o PBS e incuba as células em cada poço com 0,3 mL de trippsina por 5 min a 37 °C.</li>
		<li>Neutralizar a trippsina adicionando 2 mL do meio de soro reduzido sem vermelho fenol contendo 0% de FCS em cada poço e transfira células transfeminadas em um tubo de 15 mL. NOTA: O vermelho fenol pode interferir na atividade da luciferase; portanto, as células devem ser manuseadas a partir desta etapa em meio sem vermelho fenol.</li>
		<li>Gire as células por 5 min a 290 x g e aspire o meio. Resuspend as células em 2 mL do meio sérico reduzido sem vermelho fenol contendo 0% de FCS. Conte como descrito na etapa 1.1.</li>
		<li>Sementes transfeinou células HEK 293 em 96 placas bem opacas a uma densidade de 30.000 células por poço em 90 μL de médio sem vermelho fenol contendo 0% de FCS. Para obter 3 réplicas técnicas dentro do mesmo experimento para 3 compostos diferentes, semente 60 poços das placas com células excluindo os poços nas bordas.</li>
		<li>Imediatamente após a semeadura das células transfeinadas, adicione 10 μL de solução composta DMSO de 10% (ver passo 1.2).</li>
	</ol></li>
	<li>Preparação composta<ol>
<li>Prepare soluções de estoque composto de 1 mM dissolvendo o composto de juros em DMSO 100% (v/v). Para ter 3 réplicas para cada titulação composta, use 8 μL da solução de estoque composto de 1 mM. NOTA: O volume do composto de estoque de 1 mM utilizado é mais do que o necessário. Isso é feito para levar em conta os erros de pipetação, se houver.</li>
		<li>Realize uma diluição serial de 2 vezes da solução composta de estoque com 4 μL do estoque de 1 mM em 4 μL de 100% DMSO para cada ponto de titulação. NOTA: Para uma titulação composta completa, realize 9 diluições seriais do estoque inicial em 100% DMSO. Se vários compostos precisarem ser testados, use uma placa de 96 poços e uma pipeta multicanal para facilitar esta etapa e diluições subsequentes.</li>
		<li>Adicione 36 μL de água estéril de grau HPLC para cada ponto da diluição serial de 2 vezes para preparar um 40 μL de soluções de trabalho de 10x em 10% DMSO (v/v) (ou seja. 100 μM a 0,39 μM série de ações DMSO 10% levará a uma solução final de 10 μM a 0,039 μM, em 1% DMSO quando adicionado às células). Quanto ao controle de tratamento, também prepare uma solução de estoque 10% DMSO somente em água estéril de grau HPLC.</li>
		<li>Adicione 10 μL de soluções de trabalho de 10x às células na placa 96 bem opaca, a fim de produzir a concentração final pretendida com uma concentração de DMSO residual de 1% (v/v) em um volume total de 100 μL e incubar por 3h a 37 °C com 5% v/v de CO atmosférico2.</li>
	</ol></li>
	<li>Ensaio de complementação e viabilidade da luciferase<ol>
<li>Após 3h de drogagem, comece a preparar o reagente do substrato de luciferase combinando 1 volume de substrato com 19 volumes do reagente de diluição (veja as instruções do fabricante). NOTA: O ensaio de luciferase é realizado utilizando um kit comercialmente disponível (ver Tabela de Materiais).</li>
		<li>Use uma pipeta multicanal para adicionar imediatamente 25 μL de reagente de substrato.</li>
		<li>Agite a placa a 350 rpm por 50 min em um agitador orbital à temperatura ambiente.</li>
		<li>Avalie a luminescência usando um leitor de placas. Para isso, coloque o leitor de espelhos em luminescência e o filtro de emissão em 455. Use uma altura de medição de 6,5 mm com um tempo de medição de 1 s.</li>
		<li>Para avaliar a viabilidade celular, adicione 33 μL de reagente de ensaio de viabilidade e, em seguida, remendo a luminescência novamente após 15 minutos à temperatura ambiente, usando o leitor de placas.</li>
		<li>Avalie a luminescência com o leitor de placas definindo o leitor de espelhos na Luminescência e o filtro de emissão em 600 nm. Use uma altura de medição de 6,5 mm com um tempo de medição de 1 s. NOTA: A viabilidade é avaliada medindo o nível intracelular de ATP sobre a lise celular de acordo com as instruções do fabricante. Multiplexing é possível neste caso, uma vez que o ensaio de viabilidade usa uma luciferase diferente com um comprimento de onda de emissão diferente.</li>
		<li>Use os dados para determinar os valores IC50 de cada composto por curva encaixando os dados em uma equação de curva de ajuste de 4 parâmetros: Y = ((A-D)/(1+((x/C)^B)) + D Os valores numéricos D e A devem ser restringidos no processo de montagem da curva: D = valor luminescente no eixo Y para assíntototo de curva mínima ou nível teórico mínimo de resposta esperado do ensaio de complementação eIF4E:4G. A = valor luminescente no eixo Y para assíntotototo de curva máxima ou resposta de nível teórico máximo esperada do ensaio de complementação eIF4E:4G. NOTA: O valor para a resposta mínima é derivado do tratamento de controle DMSO (v/v) de 1% e o valor para a resposta máxima é derivado da resposta máxima de um inibidor mTOR de alta afinidade que tem nivelado sem efeito sobre a viabilidade celular.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Correlacionando eIF4E:eIF4G604-646 ensaio inibição com interrupção complexa eIF4F em células
<ol><li>Para confirmar que o sinal que está sendo medido pelo ensaio corresponde à interrupção física da interação eIF4E-eIF4G pelo composto, células de sementes como descrito na etapa 1.1.</li>
	<li>No dia seguinte, substitua o meio por 1 mL de meio de soro reduzido não contendo fenol vermelho e incubar por 4h com o composto de juros. Assegurar concentração de DMSO residual de 1% (v/v) em um volume total de 1 mL. NOTA: Para permitir facilmente uma correlação com o resultado, utilize concentrações compostas no início, ponto médio e ponto final da curva de titulação do ensaio de complementação medido.</li>
	<li>As células lyse e realizaram m7GTP puxar para baixo para isolar os complexos eIF4F e eIF4E:4EBP1. Procedimentos detalhados sobre como realizar o experimento de retirada m7GTP podem ser encontrados em outros lugares14.</li>
	<li>Detecte os níveis de proteína eIF4G, eIF4E e 4EBP1 vinculados a m7GTP por análise de manchas ocidentais e, em seguida, correlacionar-se com a interrupção do complexo eIF4F com a inibição do sinal de ensaio de complementação.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Silvera, D., Formenti, S. C., Schneider, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+control+in+cancer.">Translational control in cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 10 (4), 254-266 (2010).</li><li>Gebauer, F., Hentze, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Mechanism+of+translational+control.">Molecular Mechanism of translational control.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 827-835 (2004).</li><li>Bhat, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+translation+machinery+in+cancer.">Targeting the translation machinery in cancer.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 14 (4), 261-278 (2015).</li><li>Pelletier, J., Graff, J., Ruggero, D., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+eIF4F+translation+initiation+complex:+a+critical+nexus+for+cancer+development.">Targeting the eIF4F translation initiation complex: a critical nexus for cancer development.</a> Cancer Research. 75 (2), 250-263 (2015).</li><li>Montanaro, L., Pandolfi, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation+of+mRNA+translation+in+oncogenesis:+the+role+of+eIF4E.">Initiation of mRNA translation in oncogenesis: the role of eIF4E.</a> Cell Cycle. 11, 1387-1389 (2004).</li><li>Merrick, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=eIF4E:+A+retrospective.">eIF4E: A retrospective.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (40), 24091-24099 (2015).</li><li>Marcotrigiano, J., Gingras, A. C., Sonenberg, N., Burley, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cap-dependent+translation+initiation+in+eukaryotes+is+regulated+by+a+molecular+mimic+of+eIF4G.">Cap-dependent translation initiation in eukaryotes is regulated by a molecular mimic of eIF4G.</a> Molecular Cell. 3 (6), 707-716 (1999).</li><li>Umenaga, Y., Paku, K. S., In, Y., Ishida, T., Tomoo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+function+of+the+second+eIF4E-binding+region+in+N-terminal+domain+of+eIF4G:+comparison+with+eIF4E-binding+protein.">Identification and function of the second eIF4E-binding region in N-terminal domain of eIF4G: comparison with eIF4E-binding protein.</a> Biochemical and Biophysical Research Communication. 414 (3), 462-467 (2011).</li><li>Gr&#252;ner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Structures+of+eIF4E-eIF4G+Complexes+Reveal+an+Extended+Interface+to+Regulate+Translation+Initiation.">The Structures of eIF4E-eIF4G Complexes Reveal an Extended Interface to Regulate Translation Initiation.</a> Molecular Cell. 64 (3), 467-479 (2016).</li><li>Gingras, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hierarchical+phosphorylation+of+the+translation+inhibitor+4E-BP1.">Hierarchical phosphorylation of the translation inhibitor 4E-BP1.</a> Genes and Development. 15 (21), 2852-2864 (2001).</li><li>Dixon, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoLuc+Complementation+Reporter+Optimized+for+Accurate+Measurement+of+Protein+Interactions+in+Cells.">NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells.</a> ACS Chemical Biology. 11 (2), 400-408 (2016).</li><li>Sun, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTOR+kinase+inhibitors+as+potential+cancer+therapeutic+drugs.">mTOR kinase inhibitors as potential cancer therapeutic drugs.</a> Cancer Letters. 340 (1), 1-8 (2013).</li><li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability.">Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Current Protocols in Immunology. , (2001).</li><li>Sekiyama, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanism+of+the+dual+activity+of+4EGI-1:+Dissociating+eIF4G+from+eIF4E+but+stabilizing+the+binding+of+unphosphorylated+4E-BP1.">Molecular mechanism of the dual activity of 4EGI-1: Dissociating eIF4G from eIF4E but stabilizing the binding of unphosphorylated 4E-BP1.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 112 (30), e4036-e4045 (2015).</li><li>Muller, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4E-BP+restrains+eIF4E+phosphorylation.">4E-BP restrains eIF4E phosphorylation.</a> Translation. 1 (2), e25819 (2013).</li><li>Frosi, Y., Usher, R., Lian, D. T. G., Lane, D. P., Brown, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+flux+in+signalling+pathways+through+measurements+of+4EBP1-mediated+eIF4F+complex+assembly.">Monitoring flux in signalling pathways through measurements of 4EBP1-mediated eIF4F complex assembly.</a> BMC Biology. (1), 40 (2019).</li><li>Ran, X., Gestwicki, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+protein-protein+interactions+(PPIs):+An+analysis+of+scaffold+choices+and+buried+surface+area.">Inhibitors of protein-protein interactions (PPIs): An analysis of scaffold choices and buried surface area.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 44, 75-86 (2018).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

O método descrito neste artigo utiliza um ensaio de complementação baseado em luciferase para monitorar quantitativamente o conjunto complexo eIF4F através da medição direta da interação eIF4G-eIF4E em células vivas. Fornecemos detalhes para o uso do sistema de complementação eIF4E-eIF4G e também mostramos que o sistema é extremamente preciso na medição da dissociação mediada por medicamentos 4EBP1 da interação eIF4E-eIF4G16. Para facilitar o throughput deste ensaio, a configuração experimental descrita neste artigo foi projetada para um uso de formato de microplacão de 96 poços.
Para obter resultados ideais, duas etapas críticas devem ser consideradas ao realizar o ensaio. Em primeiro lugar, a eficiência de transfecção entre os experimentos deve permanecer semelhante. Isso pode ser assegurado através do uso de células de baixo número de passagem, e contando rigorosamente as células no dia da semeadura. A confluência celular também deve ser avaliada antes da transfecção do DNA ser realizada, pois não é recomendado transfetar células com reagente de transfecção à base de lipídio se a confluência celular for inferior a 70-90%. Em segundo lugar, é importante multiplex o ensaio de complementação com um ensaio de viabilidade celular. Alguns compostos podem impactar o sinal de luciferase principalmente diminuindo o número de células viáveis através de efeitos deletérios. É, portanto, importante medir a viabilidade da célula imediatamente após o ensaio de complementação eIF4E:eIF4G604-646 para abordar efeitos fora do alvo e não específicos.
As interfaces proteína-proteína, tais como as entre eIF4E e eIF4G, que são desprovidas de fissuras hidrofóbicas e relativamente grandes e planares, são geralmente consideradas "não-drogadas" pelas terapêuticas convencionais de pequenas moléculas (<500 MW)17. Assim, há um crescente interesse no desenvolvimento de novas modalidades que interagem eficientemente com esse tipo de superfície (por exemplo, compostos macrocíclicos e peptidomióticos). No entanto, muitas dessas novas modalidades não são inatamente capazes de atravessar a membrana celular e engajar seu alvo. Para contornar essas questões, muitos grupos de pesquisa estão realizando pesquisas sobre novas estratégias de otimização química e entrega celular. Imaginamos que o ensaio PPI de células vivas eIF4E:eIF4G604-646 e outros ensaios derivados do PPI semelhantes desempenharão um papel fundamental na promoção dessas estratégias e validá-las.

O controle da expressão genética desempenha um papel fundamental na correta execução de programas celulares, como a proliferação do crescimento e a diferenciação. Um mecanismo de controle regulatório pode ser exercido tanto no nível da transcrição genética quanto no nível da tradução mRNA. Na última década, tornou-se cada vez mais evidente que o controle translacional pela modulação do processo de iniciação em vez das etapas posteriores de alongamento e término pode regular finamente a síntese de subconjuntos específicos de proteínas que desempenham uma ampla gama de funções biológicas.
O aumento da tradução das mRNAs envolvidas na sobrevivência, respostas anti-autofágicas e anti-apoptóticas foram implicadas em vários cânceres e também foram causadores mente ligadas à ativação aberrante ou à expressão dos fatores de iniciação da tradução1.
O complexo eIF4F é um regulador mestre da iniciação da tradução. Ao vincular a estrutura da tampa no final de 5' dos mRNAs, o eIF4F está impulsionando o recrutamento inicial mRNA-ribossomo e, por sua vez, aumentando a eficiência de tradução mRNA de mRNAs eucarióticas mal traduzidas2. A tradução mediada eIF4F de mRNAs relacionadas ao câncer tem sido relatada para muitos modelos de câncer que abrigam ativação aberrante de vias RAS/MAPK ou AKT/TOR, sugerindo que as células cancerígenas reregulam o eIF4F para impulsionar sua própria atividade pró-neoplásica. A interrupção deste loop de avanço alimentar inibindo a formação complexa eIF4F é, portanto, uma estratégia terapêutica muito promissora3,4.
O complexo eIF4F consiste em (i) eIF4E, a subunidade de ligação de tampa do eIF4F que interage com a estrutura da tampa encontrada no UTR de 5' de mRNA, (ii) eIF4A, o RNA helicase e (iii) eIF4G, a proteína do andaime que interage com o eIF4A e o eIF4E e que eventualmente recruta a subunidade ribossômica 40S5. a associação eIF4G com o eIF4E é o passo limitante de taxas para a montagem de complexos funcionais eIF4F e é regulada negativamente pelas proteínas de ligação eIF4E (4EBPs, membros 1, 2 e 3))6. Competindo com a vinculação eIF4G ao eIF4E através de uma interface que consiste em sequências de ligação eIF4E canônicas e canônicas7,8,9 (região que abrange aa 604-646 em eIF4E humano), o 4EBP reduz o pool de eIF4E ativamente envolvido na tradução e prevenção da formação do complexo eIF4F. A interação entre proteínas e proteínas é regulada principalmente pelo alvo mamífero da fosforilação mediada pela rapamicina (mTOR) de 4EBP. Após estímulos mitogênicos, o mTOR fosforila diretamente os membros da família de proteínas 4E-BP, diminuindo sua associação com o eIF4E e, assim, promovendo a interação eIF4E-eIF4G e a formação de complexos funcionais eIF4F10.
Apesar do grande esforço no desenvolvimento de compostos voltados para a integridade complexa eIF4F, a falta de ensaios que medem a interrupção direta da interação eIF4E-eIF4G em células vivas limitou a busca por compostos ativos celulares. Aplicamos um ensaio de luciferase baseado em um analógico coelenterazina (por exemplo, ensaio de complementação baseado em nanoluc) para monitorar em tempo real o status da integridade eIF4F através da interação eIF4E-eIF4G. O sistema de proteína de complementação da luciferase consiste em um fragmento de proteína de 18 kDa (SubA) e 11 fragmentos de peptídeos de aminoácidos (SubB) otimizados para auto-associação mínima e estabilidade11. Uma vez expressos como um produto de fusão com o eIF4E de comprimento total humano e o domínio de interação eIF4E do eiF4G1 humano (aa 604-646), as duas proteínas interativas trarão o fragmento SubA e SubB para uma proximidade entre si e induzirão a formação da luciferase ativa que, na presença de um substrato permeável celular, eventualmente gerará um sinal luminoso brilhante (Figura 1). Reportamos em outros lugares a construção e validação do sistema de complementação eIF4E:eIF4G604-646 16.
Aqui, descrevemos como o sistema de complementação eIF4E:eIF4G604-646 (disponível mediante solicitação) pode ser aplicado para medir com precisão a interrupção eIF4E-eIF4G mediada em células vivas. Além disso, demonstramos sua utilidade medindo os efeitos de vários inibidores de mTOR que estão atualmente sob testes clínicos como potenciais medicamentos terapêuticos de câncer12. Como os efeitos fora do alvo muitas vezes mascaram atividade específica de drogas, também descrevemos como a versatilidade da medição do sistema eIF4E:eIF4G604-646 pode ser estendida com medições ortogonais de viabilidade celular para levar isso em conta.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>293FT cells</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R70007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture microplate 96 well, F-Bottom</td>
			<td>greiner bio-one</td>
			<td>655083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell titer Glo 2.0</td>
			<td>PROMEGA</td>
			<td>G9241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Envision Multilabel Reader</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>not applcable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Finnpipette F2 Multichannel Pipettes 12-channels 30-300 ml</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4662070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Finnpipette F2 Multichannel Pipettes 12-channels 5-50 ml</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4662050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FUGENE6</td>
			<td>PROMEGA</td>
			<td>E2692</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td><a href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/L3000015" target="_blank">L3000015</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoBiT PPI Starter Systems</td>
			<td>PROMEGA</td>
			<td>N2014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimem I Reduced Serum Mediun, no phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11058021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>not appicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#947;-Aminophenyl-m7GTP (C10-spacer)-Agarose</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td>AC-155S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring eif4f assembly by measuring eif4e-eif4g interaction in live cells

A formação do complexo eIF4F tem se mostrado o nó fundamental a jusante para a convergência de vias de sinalização que muitas vezes sofrem ativação oncogênica em humanos. O eIF4F é um complexo de vinculação de tampas envolvido na fase de recrutamento mRNA-ribossomo de iniciação de tradução. Em muitos modelos celulares e pré-clínicos de cânceres, a desregulamentação do eIF4F leva ao aumento da tradução de subconjuntos específicos de mRNA que estão envolvidos na proliferação e sobrevivência do câncer. eIF4F é um complexo hetero-trimérico construído a partir da subunidade de ligação de tampa eIF4E, do eIF4A helicase e da subunidade de andaimes eIF4G. Fundamental para a montagem de complexos eIF4F ativos é a interação proteína-proteína entre proteínas eIF4E e eIF4G. Neste artigo, descrevemos um protocolo para medir o conjunto eIF4F que monitora o status da interação eIF4E-eIF4G em células vivas. O ensaio de interação proteína-proteína baseado em células eIF4e:4G também permite que as alterações induzidas por medicamentos na integridade complexa eIF4F sejam avaliadas com precisão e confiabilidade. Prevemos que este método possa ser aplicado para verificar a atividade de compostos disponíveis comercialmente ou para uma triagem adicional de novos compostos ou modalidades que interrompam eficientemente a formação do complexo eIF4F.

Para validar a sensibilidade do sistema de complementação eIF4E:eIF4G604-646, a inibição mediada de 4EBP1 do conjunto complexo eIF4F foi avaliada por meio de inibidores mTOR. Ao inibir a fosforilação dependente mTORC1 quinase da família de proteínas 4EBP, a inibição do mTOR aumenta a associação 4EBP1 para eIF4E e, portanto, a desmontagem eIF4F15. Duas classes de inibidores mecanicamente diferentes de quinases mTOR foram testadas: rapalogs (por exemplo, Rapamicina) que são inibidores aostêmicos de mTORC1, mas não inibidores de base competitiva de MTORC2 e ATP (por exemplo, PP242) que são projetados para inibir especificamente tanto a atividade catraca mTORC1 quanto a atividade catáltica mTORC2.
As células HEK293 foram transfeinadas com o sistema de complementação eIF4E:eIF4G604-646, conforme descrito na etapa 1. Após 24h de transfecção, as células foram re-semeadas e tratadas com os inibidores mTOR PP242 e rapamicina (conforme descrito na etapa 1.2). Quatro horas após o tratamento, a luminescência foi avaliada, como descrito anteriormente, seguida pela viabilidade celular. Como mostrado na Figura 2, PP242 produz uma inibição dependente de dose do sinal com IC50 calculado de 0,72 ± 0,04 μM, enquanto um IC50 de 6,88 ± 0,88 μM é derivado para rapamicina (Figura 2A). As placas foram então multiplexadas para o ensaio de viabilidade celular(Figura 2D). Esta análise mostra que nem o PP242 nem a rapamicina produzem uma diminuição significativa da viabilidade celular, provando que a diminuição da luminescência no sistema de complementação eIF4E:eIF4G604-646 não se deve à morte celular inespecífica, mas sim à interrupção da interação eIF4E:4G.
Um experimento m7GTP puxado para baixo realizado incubando células não transtravadas com concentrações compostas que correspondem ao início, pontos médios e finais da curva de titulação medida na Figura 2A mostram que a interrupção mediada por 4EBP1 da interação endógena eIF4E-eIF4G correlaciona-se com o sinal de ensaio medido eIF4E:eIF4G604-646 (Figura 2B, 2C). Consistente com esses resultados, Pp242 é mostrado como um inibidor mais potente de fosforilação total de 4EBP1 do que a rapamicina sob as condições experimentais testadas em células HEK 293(Figura 3A),enquanto ambos os inibidores mostraram impacto na sinalização mTOR normalmente, com a rapamicina sendo mais ativa contra substratos mTORC1 e PP242 visando mTORC1 e mTORC2 (Figura 3B).
Juntos, esses resultados mostraram que o PP242 é mais eficaz na interrupção da formação complexa eIF4F do que a rapamicina nas células HEK293 e demonstram ainda que o sistema eIF4E:eIF4G604-646 pode medir com precisão a montagem complexa eIF4F em células vivas.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60850/60850fig1.jpg"> Figura 1: sistema de complementação eIF4E:eIF4G604-646. A representação esquemática mostrando como a interação entre proteína X (eIF4E) e proteína Y (eIF4G604-646) permite que as fusões SubA e SubB se aproximassem entre si e reconstituam a luciferase ativa. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/60850/60850fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60850/60850fig2.jpg"> Figura 2: Interrupção mediada por 4EBP1 do complexo eIF4F. (A) PP242 e rapamycina eIF4E:eIF4G604-646 ensaio titulação modelando a interação entre eIF4E e eIF4G em células HEK 293 transfectadas. (B,C) Análise de manchas ocidentais mostrando nível endógeno de eIF4E, eIF4G e 4EBP1 em extratos hek 293 e em m7GTP puxar para baixo após a incubação de células cultivadas com diferente concentração de PP242 ou Rapamicina, respectivamente. (D) Células tratadas em A onde multiplexado para viabilidade celular e luminescência avaliadas. Todos os valores representam ± média SD (n=3). Este número foi modificado a partir de16. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/60850/60850fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60850/60850fig3.jpg"> Figura 3: Efeito diferencial da inibição do mTOR na foshorilação 4EBP1. (A) Análise de manchas ocidentais do estado de fosforilação de 4EBP1 em células HEK293 não transfeinadas tratadas com concentração indicada de PP242 e rapamicina. (B) Análise de manchas ocidentais do estado de fosforilação AKT e S6 em células HEK293 não transfiliram tratadas com os inibidores duplos do local ativo MTORC1/2 PP242, ou o inibidor a allotérico da Rapamicina mTORC1. Beta actin foi visualizado para controle de carregamento, bem como total 4EBP1, AKT e S6. Este número foi modificado a partir de16. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/60850/60850fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring eIF4F Assembly by Measuring eIF4E-eIF4G Interaction in Live Cells at JoVE.com

Monitoring eIF4F Assembly by Measuring eIF4E-eIF4G Interaction in Live Cells

Aqui, apresentamos um protocolo para medir a interação eIF4E-eIF4G em células vivas que permitiria ao usuário avaliar a perturbação induzida por drogas da dinâmica complexa eIF4F em formatos de triagem.

Monitorando o conjunto eIF4F medindo a interação eIF4E-eIF4G em células vivas

Formation of the eIF4F complex has been shown to be the key downstream node for the convergence of signalling pathways that often undergo&#160;oncogenic ...

monitoring-eif4f-assembly-measuring-eif4e-eif4g-interaction-live

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Cancer Research

3.0K visualizações.  A*STAR (Agency for Science, Technology and Research). Aqui, apresentamos um protocolo para medir a interação eIF4E-eIF4G em células vivas que permitiria ao usuário avaliar a perturbação induzida por drogas da dinâmica complexa eIF4F em formatos de triagem.

Vídeo: Monitoring eIF4F Assembly by Measuring eIF4E-eIF4G Interaction in Live Cells

Live Imaging to Study Microtubule Dynamic Instability in Taxane-resistant Breast Cancers

Taxanes such as docetaxel belong to a group of microtubule-targeting agents (MTAs) that are commonly relied upon to treat cancer. However, taxane resistance in cancerous cells drastically reduces the effectiveness of the drugs' long-term usage. Accumulated evidence suggests that the mechanisms underlying taxane resistance include both general mechanisms, such as the development of multidrug resistance due to the overexpression of drug-efflux proteins, and taxane-specific mechanisms, such as those that involve microtubule dynamics. 
Because taxanes target cell microtubules, measuring microtubule dynamic instability is an important step in determining the mechanisms of taxane resistance and provides insight into how to overcome this resistance. In the experiment, an in vivo method was used to measure microtubule dynamic instability. GFP-tagged &#945;-tubulin was expressed and incorporated into microtubules in MCF-7 cells, allowing for the recording of the microtubule dynamics by time lapse using a sensitive camera. The results showed that, as opposed to the non-resistant parental MCF-7CC cells, the microtubule dynamics of docetaxel-resistant MCF-7TXT cells are insensitive to docetaxel treatment, which causes the resistance to docetaxel-induced mitotic arrest and apoptosis. This paper will outline this in vivo method of measuring microtubule dynamic instability.

In this paper, we report a protocol describing an in vivo method to measure microtubule dynamic instability in docetaxel-resistant breast cancer cells (MCF-7TXT). In this method, a deconvolution microscopy imaging system is used to detect the expression of GFP-tubulin in target cells.

Imageamento ao vivo para estudar a instabilidade dinâmica dos microtúbulos em cânceres de mama resistentes a taxanos

Taxanes such as docetaxel belong to a group of microtubule-targeting agents (MTAs) that are commonly relied upon to treat cancer. However, taxane ...

Pesquisa do câncer

A Spheroid Killing Assay by CAR T Cells

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric antigen receptor (CAR) redirected T cells obtained the most spectacular results, in particular with pediatric B-acute lymphoblastic leukemia (B-ALL). Classical validation methods of CAR T cells rely on the use of specificity and functionality assays of the CAR T cells against target cells in suspension and in xenograft models. Unfortunately, observations made in vitro are often decoupled from results obtained in vivo and a lot of effort and animals could be spared by adding another step: the use of 3D culture. The production of spheroids out of potential target cells that mimic the 3D structure of the tumor cells when they are engrafted into the animal model represents an ideal alternative. Here, we report an affordable, reliable and easy method to produce spheroids from a transduced colorectal cell line as a validation tool for adoptive cell therapy (exemplified here by CD19 CAR T cells). This method is coupled with an advanced live imaging system that can follow spheroid growth, effector cells cytotoxicity and tumor cell apoptosis.

This protocol is designed to assess immunotherapeutic redirected T-cell (CAR T-cell) cytotoxicity against 3D structured cancerous cells (spheroids) in real time.

Um ensaio de matança Spheroid por pilhas de T do carro

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric ...

Detection and Monitoring of Tumor Associated Circulating DNA in Patient Biofluids

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular sub-classification and temporal monitoring of tumor response to therapy. Here, we describe our dPCR-based method for the detection of tumor somatic mutations in cell free DNA (cfDNA), readily available in&#160;patient biofluids. Although limited in the number of mutations that can be tested for in each assay, this method provides a high level of sensitivity and specificity. Monitoring of mutation abundance, as calculated by MAF, allows for the evaluation of tumor response to therapy, thereby providing a much-needed supplement to radiographic imaging.

Here, we present a protocol to detect tumor somatic mutations in circulating DNA present in patient biological fluids (biofluids). Our droplet digital polymerase chain reaction (dPCR)-based method enables quantification of the tumor mutation allelic frequency (MAF), facilitating a minimally invasive complement to diagnosis and temporal monitoring of tumor response.

Deteção e monitoração do ADN de circulação associado do tumor em Biofluids pacientes

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular ...

Semi-automatic PD-L1 Characterization and Enumeration of Circulating Tumor Cells from Non-small Cell Lung Cancer Patients by Immunofluorescence

Circulating tumor cells (CTCs) derived from the primary tumor are shed into the bloodstream or lymphatic system. These rare cells (1&#8722;10 cells per mL of blood) warrant a poor prognosis and are correlated with shorter overall survival in several cancers (e.g., breast, prostate and colorectal). Currently, the anti-EpCAM-coated magnetic bead-based CTC capturing system is the gold standard test approved by the U.S. Food and Drug Administration (FDA) for enumerating CTCs in the bloodstream. This test is based on the use of magnetic beads coated with anti-EpCAM markers, which specifically target epithelial cancer cells. Many studies have illustrated that EpCAM is not the optimal marker for CTC detection. Indeed, CTCs are a heterogeneous subpopulation of cancer cells and are able to undergo an epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) associated with metastatic proliferation and invasion. These CTCs are able to reduce the expression of cell surface epithelial marker EpCAM, while increasing mesenchymal markers such as vimentin. To address this technical hurdle, other isolation methods based on physical properties of CTCs have been developed. Microfluidic technologies enable a label-free approach to CTC enrichment from whole blood samples. The spiral microfluidic technology uses the inertial and Dean drag forces with continuous flow in curved channels generated within a spiral microfluidic chip. The cells are separated based on the differences in size and plasticity between normal blood cells and tumoral cells. This protocol details the different steps to characterize the programmed death-ligand 1 (PD-L1) expression of CTCs, combining a spiral microfluidic device with customizable immunofluorescence (IF) marker set.

The characterization of circulating tumor cells (CTCs) is a popular topic in translational research. This protocol describes a semi-automatic immunofluorescence (IF) assay for PD-L1 characterization and enumeration of CTCs in non-small cell lung cancer (NSCLC) patient samples.

Caracterização e enumeração semiautomáticas de PD-L1 de células tumorais circulantes de pacientes com câncer de pulmão de células não pequenas por imunofluorescência

Circulating tumor cells (CTCs) derived from the primary tumor are shed into the bloodstream or lymphatic system. These rare cells (1&#8722;10 cells per mL ...

In Vitro Assay to Study Tumor-macrophage Interaction

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a malignant brain tumor with no cure, has up to a half the tumor mass TAMs. TAMs can be pro-tumoral or anti-tumoral, depending on the activation of specific genes in the cells. Genetic mutations in the tumors, through regulating cytokine expression, can affect recruitment of TAMs to the tumor microenvironment. Here, we describe a quantitative cell-based assay to assess macrophage recruitment by the conditioned medium from the tumor cells. This assay uses the human macrophage cell line MV-4-11 to study macrophage attraction by the conditioned medium from glioblastoma, allowing for high reproducibility and low variability. Data generated with this assay can contribute to a better understanding of the interaction between the tumor and the tumor microenvironment. Similar assay can be used to assess interaction between the tumor cells and other immune cells, including T cells and natural killer (NK) cells.

This article represents a useful in vitro assay to evaluate the capability of conditioned medium from tumor cells to attract macrophages.

Ensaio in vitro para estudo do tumor-interação macrófago

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a ...

Monitoring Cancer Cell Invasion and T-Cell Cytotoxicity in 3D Culture

Significant progress has been made in treating cancer with immunotherapy, although a large number of cancers remain resistant to treatment. A limited number of assays allow for direct monitoring and mechanistic insights into the interactions between tumor and immune cells, amongst which, T-cells play a significant role in executing the cytotoxic response of the adaptive immune system to cancer cells. Most assays are based on two-dimensional (2D) co-culture of cells due to the relative ease of use but with limited representation of the invasive growth phenotype, one of the hallmarks of cancer cells. Current three-dimensional (3D) co-culture systems either require special equipment or separate monitoring for invasion of co-cultured cancer cells and interacting T-cells.
Here we describe an approach to simultaneously monitor the invasive behavior in 3D of cancer cell spheroids and T-cell cytotoxicity in co-culture. Spheroid formation is driven by enhanced cell-cell interactions in scaffold-free agarose microwell casts with U-shaped bottoms. Both T-cell co-culture and cancer cell invasion into type I collagen matrix are performed within the microwells of the agarose casts without the need to transfer the cells, thus maintaining an intact 3D co-culture system throughout the assay. The collagen matrix can be separated from the agarose cast, allowing for immunofluorescence (IF) staining and for confocal imaging of cells. Also, cells can be isolated for further growth or subjected to analyses such as for gene expression or fluorescence activated cell sorting (FACS). Finally, the 3D co-culture can be analyzed by immunohistochemistry (IHC) after embedding and sectioning. Possible modifications of the assay include altered compositions of the extracellular matrix (ECM) as well as the inclusion of different stromal or immune cells with the cancer cells.

The presented approach simultaneously evaluates cancer cell invasion in 3D spheroid assays and T-cell cytotoxicity. Spheroids are generated in a scaffold-free agarose multi-microwell cast. Co-culture and embedding in type I collagen matrix are performed within the same device which allows to monitor cancer cell invasion and T-cell mediated cytotoxicity.

Monitoramento da invasão celular cancerígena e citotoxicidade de células T na cultura 3D

Significant progress has been made in treating cancer with immunotherapy, although a large number of cancers remain resistant to treatment. A limited ...

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile conditions. Different tests seek to identify and quantify these hallmarks of cancerous cells; however, they often focus on a single aspect of cellular transformation and, in fact, multiple tests are required for their proper characterization. The purpose of this work is to provide researchers with a set of tools to assess cellular transformation in vitro from a broad perspective, thereby making it possible to draw sound conclusions.
A sustained proliferative signaling activation is the major feature of tumoral tissues and can be easily monitored under in vitro conditions by calculating the number of population doublings achieved over time. Besides, the growth of cells in 3D cultures allows their interaction with surrounding cells, resembling what occurs in vivo. This enables the evaluation of cellular aggregation and, together with immunofluorescent labeling of distinctive cellular markers, to obtain information on another relevant feature of tumoral transformation: the loss of proper organization. Another remarkable characteristic of transformed cells is their capacity to grow without attachment to other cells and to the extracellular matrix, which can be evaluated with the anchorage assay.
Detailed experimental procedures to evaluate cell growth rate, to perform immunofluorescent labeling of cell lineage markers in 3D cultures, and to test anchorage-independent cell growth in soft agar are provided. These methodologies are optimized for Breast Primary Epithelial Cells (BPEC) due to its relevance in breast cancer; however, procedures can be applied to other cell types after some adjustments.

This protocol provides experimental in vitro tools to evaluate the transformation of human mammary cells. Detailed steps to follow-up cell proliferation rate, anchorage-independent growth capacity, and distribution of cell lineages in 3D cultures with basement membrane matrix are described.

Avaliação In Vitro da Transformação Oncogênica em Células Epiteliais Mamárias Humanas

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile ...

A Three-Dimensional Spheroid Model to Investigate the Tumor-Stromal Interaction in Hepatocellular Carcinoma

The aggressiveness and lack of well-tolerated and widely effective treatments for advanced hepatocellular carcinoma (HCC), the predominant form of liver cancer, rationalize its rank as the second most common cause of cancer-related death. Preclinical models need to be adapted to recapitulate the human conditions to select the best therapeutic candidates for clinical development and aid the delivery of personalized medicine. Three-dimensional (3D) cellular spheroid models show promise as an emerging in vitro alternative to two-dimensional (2D) monolayer cultures. Here, we describe a 3D tumor spheroid&#160;model which exploits the ability of individual cells to aggregate when maintained in hanging droplets, and is more representative of an in vivo environment than standard monolayers. Furthermore, 3D spheroids can be produced by combining homotypic or heterotypic cells, more reflective of the cellular heterogeneity in vivo, potentially enabling the study of environmental interactions that can influence progression and treatment responses. The current research optimized the cell density to form 3D homotypic and heterotypic tumor spheroids by immobilizing cell suspensions on the lids of standard 10 cm3 Petri dishes. Longitudinal analysis was performed to generate growth curves for homotypic versus heterotypic tumor/fibroblasts spheroids. Finally, the proliferative impact of fibroblasts (COS7 cells) and liver myofibroblasts (LX2) on homotypic tumor (Hep3B) spheroids was investigated. A seeding density of 3,000 cells (in 20 &#181;L media) successfully yielded Huh7/COS7 heterotypic spheroids, which displayed a steady increase in size up to culture day 8, followed by growth retardation. This finding was corroborated using Hep3B homotypic spheroids cultured in LX2 (human hepatic stellate cell line) conditioned medium (CM). LX2 CM triggered the proliferation of Hep3B spheroids compared to control tumor spheroids. In conclusion, this protocol has shown that 3D tumor spheroids can be used as a simple, economical, and prescreen in vitro tool to study tumor-stromal interactions more comprehensively.

Comprehensive in vitro models that faithfully recapitulate the relevant human disease are lacking. The current study presents three-dimensional (3D) tumor spheroid creation and culture, a reliable in vitro tool to study the tumor-stromal interaction in human hepatocellular carcinoma.

Um modelo esferoide tridimensional para investigar a interação tumoral-estroma em carcinoma hepatocelular

The aggressiveness and lack of well-tolerated and widely effective treatments for advanced hepatocellular carcinoma (HCC), the predominant form of liver ...

Modeling Brain Metastasis by Internal Carotid Artery Injection of Cancer Cells

Brain metastasis is a cause of severe morbidity and mortality in cancer patients. Critical aspects of metastatic diseases, such as the complex neural microenvironment and stromal cell interaction, cannot be entirely replicated with in vitro assays; thus, animal models are critical for investigating and understanding the effects of therapeutic intervention. However, most brain tumor xenografting methods do not produce brain metastases consistently in terms of the time frame and tumor burden. Brain metastasis models generated by intracardiac injection of cancer cells can result in unintended extracranial tumor burden and lead to non-brain metastatic morbidity and mortality. Although intracranial injection of cancer cells can limit extracranial tumor formation, it has several caveats, such as the injected cells frequently form a singular tumor mass at the injection site, high leptomeningeal involvement, and damage to brain vasculature during needle penetration. This protocol describes a mouse model of brain metastasis generated by internal carotid artery injection. This method produces intracranial tumors consistently without the involvement of other organs, enabling the evaluation of therapeutic agents for brain metastasis.

Brain metastasis is a cause of severe morbidity and mortality in cancer patients. Most brain metastasis mouse models are complicated by systemic metastases confounding analysis of mortality and therapeutic intervention outcomes. Presented here is a protocol for internal carotid injection of cancer cells that produces consistent intracranial tumors with minimal systemic tumors.

Modelagem de Metástases Cerebrais por Injeção de Células Cancerígenas na Artéria Carótida Interna

Brain metastasis is a cause of severe morbidity and mortality in cancer patients. Critical aspects of metastatic diseases, such as the complex neural ...

Multiparametric Tumor Organoid Drug Screening Using Widefield Live-Cell Imaging for Bulk and Single-Organoid Analysis

Patient-derived tumor organoids (PDTOs) hold great promise for preclinical and translational research and predicting the patient therapy response from ex vivo drug screenings. However, current adenosine triphosphate (ATP)-based drug screening assays do not capture the complexity of a drug response (cytostatic or cytotoxic) and intratumor heterogeneity that has been shown to be retained in PDTOs due to a bulk readout. Live-cell imaging is a powerful tool to overcome this issue and visualize drug responses more in-depth. However, image analysis software is often not adapted to the three-dimensionality of PDTOs, requires fluorescent viability dyes, or is not compatible with a 384-well microplate format. This paper describes a semi-automated methodology to seed, treat, and image PDTOs in a high-throughput, 384-well format using conventional, widefield, live-cell imaging systems. In addition, we developed viability marker-free image analysis software to quantify growth rate-based drug response metrics that improve reproducibility and correct growth rate variations between different PDTO lines. Using the normalized drug response metric, which scores drug response based on the growth rate normalized to a positive and negative control condition, and a fluorescent cell death dye, cytotoxic and cytostatic drug responses can be easily distinguished, profoundly improving the classification of responders and non-responders. In addition, drug-response heterogeneity can by quantified from single-organoid drug response analysis to identify potential, resistant clones. Ultimately, this method aims to improve the prediction of clinical therapy response by capturing a multiparametric drug response signature, which includes kinetic growth arrest and cell death quantification.

This protocol describes a semi-automated method for medium- to high-throughput organoid drug screenings and microscope-agnostic, automated image analysis software to quantify and visualize multiparametric, single-organoid drug responses to capture intratumor heterogeneity.

Triagem de Drogas Organoides Tumorais Multiparamétricas Usando Imagem de Células Vivas de Campo Amplo para Análise a Granel e Organoide Único

Patient-derived tumor organoids (PDTOs) hold great promise for preclinical and translational research and predicting the patient therapy response from ex ...