Diese Arbeit wurde durch das Kernbudget des p53lab (BMSI, A*STAR) und des JCO VIP Grants (A*STAR) unterstützt.

HEK293 Zelllinie wurde für das Protokoll verwendet und wurde in Dulbecco modifizierte Adler Medium ergänzt mit 10% Fetal Bovine Serum, 2 mM L-Glutamin, und 100 U/mL Penicillin/Streptomycin kultiviert. Die Zellen wurden bei 37 °C mit 5%CO2 in einer befeuchteten Umgebung kultiviert.
1. Quantitative Bewertung der komplexen Störung des eIF4F über eIF4E:eIF4G604-646 Complementation Assay
<ol><li>Zellkultur und transiente Transfektion von eIF4E:eIF4G604-646 Komplementierungstest<ol>
<li>Verwenden Sie frisch aufgetaute Zellen mit weniger als 20 Passagen für alle Experimente. Bestimmen Sie am ersten Tag die Zellennummer mithilfe eines Standardzellenzählers, und zählen Sie die gesamten lebensfähigen Zellen mit der Trypan Blue Exclusion Methode13.</li>
		<li>Samen 6-Well-Platten mit 0,9 - 1,2 x 106 HEK 293 Zellen pro Brunnen in 2 ml Standardwachstumsmedium. HINWEIS: Um die beste Transfektionseffizienz innerhalb der oben angegebenen Zelllinien zu erreichen, stellen Sie sicher, dass die vergoldeten Zellen am Tag nach der Aussaat 70-90% konfluent sind.</li>
		<li>Am Morgen des 2. Tages werden Zellen mit SubA-eIF4E und eIF4G604-646-SubB-Plasmid mit einem lipidbasierten Transfektionsreagenz (siehe Materialtabelle) wie unten beschrieben, mittransfekt.<ol>
<li>Verdünnen Sie 9 l Liposomenlösung in einem Rohr, das 125 l reduziertes Serummedium ohne Phenolrot enthält (siehe Materialtabelle)für jede Transfektion und inkubieren Bei Raumtemperatur für 5 min.</li>
			<li>Bereiten Sie den Master-Mix der DNA vor, indem Sie für jedes Transfektionsrohr 3 g jedes Plasmids in 125 l reduziertem Serummedium verdünnen.</li>
			<li>Fügen Sie dem DNA-Master-Mix-Rohr 12 l Enhancer-Reagenzien hinzu, mischen Sie sie gut und fügen Sie sofort die DNA hinzu: Enhancer Master-Mix zu jeder Tube verdünnter Liposomen im Verhältnis 1:1. 15 min bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
			<li>Fügen Sie den DNA-Lipid-Komplex zu jedem Brunnen hinzu und inkubieren Sie die Zellen in einem 37 °C-Inkubator mit 5%CO2 für 24 h.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Am Morgen des 3. Tages, spülen Sie jeden Brunnen mit 1 ml PBS.</li>
		<li>Entfernen Sie die PBS und inkubieren Zellen in jedem Brunnen mit 0,3 ml Trypsin für 5 min bei 37 °C.</li>
		<li>Neutralisieren Sie Trypsin, indem Sie 2 ml des reduzierten Serummediums ohne Phenolrot, das 0% FCS in jedem Brunnen enthält, hinzufügen und transfizierte Zellen in ein 15 ml-Rohr übertragen. HINWEIS: Phenolrot kann die Luziferase-Aktivität stören; Daher müssen die Zellen von diesem Schritt an in Medium ohne Phenolrot behandelt werden.</li>
		<li>Zellen für 5 min bei 290 x g abdrehen und das Medium ansaugen. Setzen Sie die Zellen in 2 ml des reduzierten Serummediums ohne Phenolrot mit 0% FCS aus. Zählen Sie wie in Schritt 1.1 beschrieben.</li>
		<li>Samen transfizierte HEK 293 Zellen in 96 gut undurchsichtigen Platten mit einer Dichte von 30.000 Zellen pro Bohrkörper in 90 l Medium ohne Phenolrot, das 0% FCS enthält. Um 3 technische Replikationen innerhalb des gleichen Experiments für 3 verschiedene Verbindungen zu erhalten, säen 60 Brunnen der Platten mit Zellen, die die Brunnen an den Rändern ausschließen.</li>
		<li>Unmittelbar nach dem Aussaat der transfizierten Zellen 10 L mit 10 % DMSO-Verbindungslösung hinzufügen (siehe Schritt 1.2).</li>
	</ol></li>
	<li>Compound-Vorbereitung<ol>
<li>Bereiten Sie 1 mM Compound-Aktienlösungen vor, indem Sie die Zinsverbindung in 100% DMSO (v/v) auflösen. Um 3 Replikationen für jede zusammengesetzte Titration zu erhalten, verwenden Sie 8 l der 1 mM Compound-Stammlösung. HINWEIS: Das Volumen von 1 mM Stammmasse verwendet wird, ist mehr als das, was es benötigt wird. Dies geschieht, um Pipettierfehler zu berücksichtigen, falls vorhanden.</li>
		<li>Führen Sie eine 2-fache serielle Verdünnung der Stammverbindungslösung mit 4 l des 1 mM-Bestands in 4 l von 100 % DMSO für jeden Titrationspunkt durch. HINWEIS: Für eine vollständige zusammengesetzte Titration führen Sie 9 serielle Verdünnungen aus dem Ausgangsbestand in 100% DMSO durch. Wenn mehrere Verbindungen getestet werden müssen, verwenden Sie eine 96-Well-Platte und eine Mehrkanalpipette, um diesen Schritt und nachfolgende Verdünnungen zu erleichtern.</li>
		<li>Fügen Sie für jeden Punkt der 2-fachen seriellen Verdünnung 36 l Sterilwasser der HPLC-Klasse hinzu, um eine 40-L-L-10-fache Arbeitslösung in 10 % DMSO (v/v) zu erstellen (d. h. 100 bis 0,39 M 10 % DMSO-Stammserie, die zu einer von 10 bis 0,039 M,in 1 % DMSO führt, wenn zellenzugesetzt wird). Wie für die Behandlungskontrolle, bereiten Sie auch eine 10% DMSO nur Lagerlösung in HPLC-Grade sterilen Wasser.</li>
		<li>Fügen Sie den Zellen in der 96 gut opaken Platte 10 l 10 l 10 l 10 l 10-L-Arbeitslösungen hinzu, um die beabsichtigte Endkonzentration mit einer Rest-DMSO-Konzentration von 1% (v/v) bei einem Gesamtvolumen von 100 l zu erzielen und 3 h bei 37 °C mit 5% v/v atmosphärischem CO2zu brüten.</li>
	</ol></li>
	<li>Luziferase-Komplementierung und Lebensfähigkeitstest<ol>
<li>Nach 3 h Arzneimittel herstellung das Luziferase-Substratreagenz durch Kombination von 1 Volumen Substrat mit 19 Volumen des Verdünnungsreagenzes (siehe Herstelleranleitung). HINWEIS: Der Luziferase-Test wird mit einem handelsüblichen Kit durchgeführt (siehe Tabelle der Materialien).</li>
		<li>Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um sofort 25 L Substratreagenz hinzuzufügen.</li>
		<li>Schütteln Sie die Platte bei 350 Umdrehungen von Euro/ Mittel 50 min auf einem Orbital-Shaker bei Raumtemperatur.</li>
		<li>Bewerten Sie die Lumineszenz mit einem Plattenleser. Stellen Sie dazu den Spiegelleser auf Lumineszenz und den Emissionsfilter auf 455. Verwenden Sie eine Messhöhe von 6,5 mm mit einer Messzeit von 1 s.</li>
		<li>Um die Zelllebensfähigkeit zu beschwichtigen, fügen Sie 33 L des Lebensfähigkeits-Assay-Reagenz hinzu und messen Sie dann die Lumineszenz nach 15 min bei Raumtemperatur mit dem Plattenleser erneut.</li>
		<li>Bewerten Sie die Lumineszenz mit dem Plattenleser, indem Sie den Spiegelleser auf Lumineszenz und den Emissionsfilter auf 600 nm einstellen. Verwenden Sie eine Messhöhe von 6,5 mm mit einer Messzeit von 1 s. HINWEIS: Die Lebensfähigkeit wird durch Messung des intrazellulären ATP-Spiegels bei der Zelllyse gemäß den Anweisungen des Herstellers beurteilt. Multiplexing ist in diesem Fall möglich, da der Lebensfähigkeitstest eine andere Luziferase mit einer anderen Emissionswellenlänge verwendet.</li>
		<li>Verwenden Sie die Daten, um die IC50-Werte jeder Verbindung durch Kurve zu bestimmen, die die Daten an eine 4-Parameter-Anpassungskurvengleichung anpasst: Y = ((A-D)/(1+((x/C)))) + D Die numerischen Werte D und A müssen im Kurvenanpassungsprozess eingeschränkt werden: D = Leuchtwert auf der Y-Achse für minimale Kurvenasymptote oder minimale theoretische Reaktionsstufe, die vom eIF4E:4G-Komplementierungstest erwartet wird. A = Lumineszenzwert auf der Y-Achse für maximale Kurvenasymptote oder maximale theoretische Antwortvariablen, die vom eIF4E:4G-Komplementierungstest erwartet werden. ANMERKUNG: Der Wert für die minimale Reaktion wird aus der 1% DMSO (v/v) Kontrollbehandlung abgeleitet, und der Wert für die maximale Reaktion wird von der maximalen Reaktion eines mTOR-Inhibitors mit hoher Affinität abgeleitet, der ohne Auswirkungen auf die Zelllebensfähigkeit plateaued hat.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Korrelierende eIF4E:eIF4G604-646 Assay-Hemmung mit eIF4F-komplexer Störung in Zellen
<ol><li>Um zu bestätigen, dass das vom Test gemessene Signal der physikalischen Störung der eIF4E-eIF4G-Wechselwirkung durch die Verbindung, Samenzellen, wie in Schritt 1.1 beschrieben, entspricht.</li>
	<li>Ersetzen Sie am Tag danach das Medium durch 1 ml reduziertes Serummedium, das kein Phenolrot enthält, und brüten sie 4 h durch die Verbindung von Interesse. Stellen Sie eine Rest-DMSO-Konzentration von 1% (v/v) bei einem Gesamtvolumen von 1 ml sicher. ANMERKUNG: Um eine Korrelation mit dem Ergebnis zu ermöglichen, verwenden Sie zusammengesetzte Konzentrationen am Anfang, Mittelpunkt und Endpunkt der gemessenen Komplementierungs-Assay-Titrationskurve.</li>
	<li>Lyse-Zellen und durchgeführt m7GTP ziehen nach unten, um eIF4F und eIF4E:4EBP1 Komplexe zu isolieren. Detaillierte Verfahren zur Durchführung des m7GTP Pull-Down-Experiments finden Sie an anderer Stelle14.</li>
	<li>Detektieren Sie m7GTP-gebundene eIF4G-, eIF4E- und 4EBP1-Proteinspiegel durch Western-Blot-Analyse und korrelieren Sie dann mit eIF4F-komplexer Störung mit Komplement-Assay-Signalhemmung.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Silvera, D., Formenti, S. C., Schneider, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+control+in+cancer.">Translational control in cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 10 (4), 254-266 (2010).</li><li>Gebauer, F., Hentze, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Mechanism+of+translational+control.">Molecular Mechanism of translational control.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 827-835 (2004).</li><li>Bhat, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+translation+machinery+in+cancer.">Targeting the translation machinery in cancer.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 14 (4), 261-278 (2015).</li><li>Pelletier, J., Graff, J., Ruggero, D., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+eIF4F+translation+initiation+complex:+a+critical+nexus+for+cancer+development.">Targeting the eIF4F translation initiation complex: a critical nexus for cancer development.</a> Cancer Research. 75 (2), 250-263 (2015).</li><li>Montanaro, L., Pandolfi, P. 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E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+protein-protein+interactions+(PPIs):+An+analysis+of+scaffold+choices+and+buried+surface+area.">Inhibitors of protein-protein interactions (PPIs): An analysis of scaffold choices and buried surface area.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 44, 75-86 (2018).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Die in diesem Artikel beschriebene Methode nutzt einen luziferase-basierten Komplementierungstest zur quantitativen Überwachung der komplexen EIF4F-Montage durch direkte Messung der eIF4G-eIF4E-Interaktion in lebenden Zellen. Wir haben Einzelheiten für die Verwendung des eIF4E-eIF4G-Komplementierungssystems zur Verfügung gestellt und auch gezeigt, dass das System bei der Messung der medikamentös induzierten 4EBP1-vermittelten Dissoziation der eIF4E-eIF4G-Interaktion16extrem genau ist. Um den Durchsatz dieses Assays zu erleichtern, wurde das in diesem Artikel beschriebene Versuchsaufbau für eine 96-Well-Mikroplattenformat-Nutzung entwickelt.
Für optimale Ergebnisse sollten bei der Durchführung des Assays zwei kritische Schritte berücksichtigt werden. Erstens sollte die Transfektionseffizienz zwischen den Experimenten ähnlich bleiben. Dies kann durch die Verwendung von Zellen mit geringer Durchgangszahl und durch rigoroses Zählen von Zellen am Tag der Aussaat sichergestellt werden. Die Zellkonfluenkantinz sollte auch vor der DNA-Transfektion beurteilt werden, da es nicht empfohlen wird, Zellen mit lipidbasiertem Transfektionsreagenz zu transfekieren, wenn die Zellkonfluenz weniger als 70-90% beträgt. Zweitens ist es wichtig, den Komplementierungstest mit einem Zelllebensfähigkeitstest zu multiplexen. Einige Verbindungen können das Luziferase-Signal in erster Linie durch die Verringerung der Anzahl der lebensfähigen Zellen durch schädliche Effekte beeinflussen. Daher ist es wichtig, die Lebensfähigkeit der Zelle unmittelbar nach dem EIF4E:eIF4G604-646 Komplementierungstest zu messen, um außerhalb des Ziels und unspezifische Auswirkungen anzugehen.
Protein-Protein-Schnittstellen, wie die zwischen eIF4E und eIF4G, die frei von hydrophoben Spalten sind und relativ groß und planar sind, werden im Allgemeinen von herkömmlichen kleinen Molekültherapeutika (<500 MW)17als "nicht medikamentös" angesehen. So wächst das Interesse an der Entwicklung neuartiger Modalitäten, die effizient mit diesen Oberflächen (z. B. makrozyklische und peptidomimetische Verbindungen) interagieren. Viele dieser neuartigen Modalitäten sind jedoch nicht von Natur aus in der Lage, die Zellmembran zu überqueren und ihr Ziel zu erreichen. Um diese Probleme zu umgehen, forschen viele Forschungsgruppen an neuen Strategien zur chemischen Optimierung und Zellabgabe. Wir stellen uns vor, dass der eIF4E:eIF4G604-646 Live-Zell-PPI-Assay und andere ähnliche PPI-abgeleitete Assays eine zentrale Rolle bei der Förderung dieser Strategien und deren Validierung spielen werden.

Die Kontrolle der Genexpression spielt eine zentrale Rolle bei der korrekten Ausführung zellulärer Programme wie Wachstumsproliferation und Differenzierung. Ein regulatorischer Kontrollmechanismus kann entweder auf der Ebene der Gentranskription oder auf der Ebene der mRNA-Translation ausgeübt werden. In den letzten zehn Jahren ist es immer offensichtlicher geworden, dass die translationale Kontrolle durch Modulation des Initiationsprozesses und nicht durch die späteren Schritte der Dehnung und Beendigung die Synthese bestimmter Teilmengen von Proteinen, die eine breite Palette biologischer Funktionen spielen, fein regulieren kann.
Erhöhte Übersetzung von mRNAs, die am Überleben beteiligt sind, antiautophagische und anti-apoptotische Reaktionen wurden in mehrere Krebsarten verwickelt und wurden auch ursächlich mit der abnormen Aktivierung oder dem Ausdruck von Translationsinitiationsfaktoren in Verbindung gebracht1.
Der eIF4F-Komplex ist ein Master-Regulator der Übersetzungsinitiierung. Durch die Bindung der Cap-Struktur am 5' Ende von mRNAs treibt eIF4F die anfängliche mRNA-ribossome Rekrutierung voran und erhöht damit die mRNA-Translationseffizienz von schwach übersetzten eukaryotischen mRNAs2. EIF4F vermittelte Übersetzung von krebsbedingten mRNAs wurde für viele Krebsmodelle berichtet, die eine abnorme Aktivierung von RAS/MAPK- oder AKT/TOR-Signalwegen beherbergen, was darauf hindeutet, dass Krebszellen eIF4F hochregulieren, um ihre eigene proneoplastische Aktivität zu steigern. Die Störung dieser Einspeiseschleife durch Hemmung der eIF4F-Komplexbildung ist damit eine sehr vielversprechende therapeutische Strategie3,4.
Der eIF4F-Komplex besteht aus (i) eIF4E, der kappenbindenden Untereinheit von eIF4F, die mit der Cap-Struktur der 5' UTR von mRNA interagiert, (ii) eIF4A, dem RNA-Helicase und (iii) eIF4G, dem Gerüstprotein, das sowohl mit eIF4A als auch mit eIF4E interagiert und schließlich die 40S-Riboso-Subunit5rekrutiert. EIF4G-Assoziation mit eIF4E ist der preisbegrenzende Schritt für die Montage funktioneller eIF4F-Komplexe und wird durch die eIF4E-bindenden Proteine (4EBPs, Mitglieder 1, 2 und 3)negativ reguliert. Durch den Wettbewerb mit eIF4G-Bindung an eIF4E über eine Schnittstelle, die aus kanonischen und nicht-kanonischen eIF4E-Bindungssequenzen7,8,9 (Region aa 604-646 auf Human eIF4E) besteht, reduziert 4EBP den Pool von eIF4E, der aktiv an der Übersetzung und Der Verhinderung von eIF4F-Komplexbildung beteiligt ist. Das Zusammenspiel dieser Protein-Protein-Wechselwirkungen wird hauptsächlich durch das Säugetierziel der rapamycin (mTOR)-vermittelten Phosphorylierung von 4EBP reguliert. Bei mitogenen Reizen phosphorisiert mTOR die Mitglieder der 4E-BP-Proteinfamilie direkt, verringert ihre Verbindung mit eIF4E und fördert damit die EIF4E-eIF4G-Interaktion und die Bildung funktioneller eIF4F-Komplexe10.
Trotz der großen Anstrengungen bei der Entwicklung von Verbindungen, die auf die komplexe Integrität von eIF4F abzielen, hat das Fehlen von Assays zur Messung der direkten Störung der eIF4E-eIF4G-Interaktion in lebenden Zellen die Suche nach zellulären aktiven Schlagverbindungen eingeschränkt. Wir haben einen Luziferase-Assay auf Basis eines Coelenterazin-Analogas (z. B. Nanoluc-basierter Komplementierungs-Assay) angewendet, um den Status der eIF4F-Integrität durch die eIF4E-eIF4G-Interaktion in Echtzeit zu überwachen. Das Luziferase-Komplementierungsproteinsystem besteht aus einem 18 kDa-Proteinfragment (SubA) und 11 Aminosäure-Peptidfragment (SubB), das für minimale Selbstassoziation und Stabilität optimiert ist11. Einmal als Fusionsprodukt mit dem menschlichen EIF4E und der eIF4E-Interaktionsdomäne aus dem menschlichen eiF4G1 (aa 604-646) ausgedrückt, werden die beiden interagierenden Proteine das SubA- und SubB-Fragment in die Nähe voneinander bringen und die Bildung der aktiven Luziferase induzieren, die in Gegenwart eines zelldurchlässigen Substrats schließlich ein helles Leuchtsignal erzeugen wird (Abbildung 1). Wir haben an anderer Stelle über den Bau und die Validierung des EIF4E:eIF4G604-646 Ergänzungssystems16berichtet.
Hier beschreiben wir, wie das komplementäre System eIF4E:eIF4G604-646 (auf Anfrage erhältlich) angewendet werden kann, um 4EBP1-vermittelte eIF4E-eIF4G-Störungen in lebenden Zellen genau zu messen. Darüber hinaus zeigen wir seinen Nutzen, indem wir die Wirkung mehrerer mTOR-Inhibitoren messen, die sich derzeit in klinischen Studien als potenzielle Krebstherapeutika befinden12. Da Off-Target-Effekte oft die medikamentöse Aktivität verschleiern, beschreiben wir auch, wie die Vielseitigkeit der EIF4E:eIF4G604-646 Systemmessung mit orthogonalen Messungen der zellulären Lebensfähigkeit erweitert werden kann, um diese zu berücksichtigen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>293FT cells</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R70007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture microplate 96 well, F-Bottom</td>
			<td>greiner bio-one</td>
			<td>655083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell titer Glo 2.0</td>
			<td>PROMEGA</td>
			<td>G9241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Envision Multilabel Reader</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>not applcable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Finnpipette F2 Multichannel Pipettes 12-channels 30-300 ml</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4662070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Finnpipette F2 Multichannel Pipettes 12-channels 5-50 ml</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4662050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FUGENE6</td>
			<td>PROMEGA</td>
			<td>E2692</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td><a href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/L3000015" target="_blank">L3000015</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoBiT PPI Starter Systems</td>
			<td>PROMEGA</td>
			<td>N2014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimem I Reduced Serum Mediun, no phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11058021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>not appicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#947;-Aminophenyl-m7GTP (C10-spacer)-Agarose</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td>AC-155S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring eif4f assembly by measuring eif4e-eif4g interaction in live cells

Die Bildung des eIF4F-Komplexes hat sich als der wichtigste nachgeschaltete Knoten für die Konvergenz von Signalsignalen erwiesen, die häufig beim Menschen onkoogene Aktivierung erfahren. eIF4F ist ein Cap-Bindungskomplex, der an der mRNA-ribossomeRekrutierungsphase der TranslationInitiation beteiligt ist. In vielen zellulären und präklinischen Krebsarten führt die Deregulierung von eIF4F zu einer verstärkten Übersetzung spezifischer mRNA-Teilmengen, die an der Proliferation und dem Überleben von Krebs beteiligt sind. eIF4F ist ein heterotrimerkomplex, der aus der Kappenbindungs-Untereinheit eIF4E, dem Helicase eIF4A und der Gerüstuntereinheit eIF4G gebaut wurde. Entscheidend für die Montage aktiver eIF4F-Komplexe ist die Protein-Protein-Wechselwirkung zwischen eIF4E- und eIF4G-Proteinen. In diesem Artikel beschreiben wir ein Protokoll zur Messung der eIF4F-Assembly, das den Status der eIF4E-eIF4G-Interaktion in lebenden Zellen überwacht. Der eIF4e:4G zellbasierte Protein-Protein-Interaktionstest ermöglicht auch eine genaue und zuverlässige Bewertung medikamentös induzierter Veränderungen in der komplexen Integrität von eIF4F. Wir stellen uns vor, dass diese Methode zur Überprüfung der Aktivität kommerziell erhältlicher Verbindungen oder zum weiteren Screening neuartiger Verbindungen oder Modalitäten angewendet werden kann, die die Bildung des eIF4F-Komplexes effizient stören.

Um die Empfindlichkeit des Komplementierungssystems eIF4E:eIF4G604-646 zu validieren, wurde die 4EBP1-vermittelte Hemmung der eIF4F-Komplexbaugruppe mit mTOR-Inhibitoren bewertet. Durch hemmende mTORC1-Kinase-abhängige Phosphorylierung der 4EBP-Proteinfamilie verbessert die mTOR-Hemmung die 4EBP1-Assoziation mit eIF4E und damit eIF4F-Demontage15. Es wurden zwei Klassen mechanistisch unterschiedlicher MTOR-Kinasen getestet: Rapalogs (z.B. Rapamycin), die allosterische Inhibitoren von mTORC1 sind, aber keine mTORC2- und ATP-Wettbewerbshemmer (z. B. PP242), die sowohl mTORC1 als auch mTORC2 kinase-katalytische Aktivität gezielt hemmen.
HEK293-Zellen wurden mit dem komplementationssystem eIF4E:eIF4G604-646, wie in Schritt 1 beschrieben, transfiziert. Nach 24 h Transfektion wurden die Zellen wieder gesät und mit den mTOR-Inhibitoren PP242 und Rapamycin (wie in Schritt 1.2 beschrieben) behandelt. Vier Stunden nach der Behandlung wurde die Lumineszenz, wie zuvor beschrieben, bewertet, gefolgt von der Zelllebensfähigkeit. Wie in Abbildung 2dargestellt, erzeugt PP242 eine dosisabhängige Hemmung des Signals mit einem berechneten IC50 von 0,72 ± 0,04 m, während ein IC50 von 6,88 ± 0,88 m für Ramamycin abgeleitet wird ( Abbildung2A). Die Platten wurden dann für den Zelllebensfähigkeitstest multiplexiert (Abbildung 2D). Diese Analyse zeigt, dass weder PP242 noch Rapamycin eine signifikante Abnahme der Zelllebensfähigkeit bewirken, was beweist, dass die Abnahme der Lumineszenz im Komplementierungssystem eIF4E:eIF4G604-646 nicht auf den unspezifischen Zelltod, sondern auf eine Störung der EIF4E:4G-Wechselwirkung zurückzuführen ist.
Ein m7GTP-Pulldown-Experiment, das durch Inkubation untransfizierter Zellen mit zusammengesetzten Konzentrationen durchgeführt wurde, die den Anfangs-, Mittel- und Endpunkten der gemessenen Titrationskurve in Abbildung 2A entsprechen, zeigt, dass 4EBP1-vermittelte Störungen der endogenen eIF4E-eIF4G-Wechselwirkung mit dem gemessenen EIF4E:eIF4G604-646 Assaysignal korrelieren (Abbildung 2B, 2C). In Übereinstimmung mit diesen Ergebnissen zeigt sich PP242 als ein stärkerer Inhibitor der gesamten 4EBP1-Phosphorylierung als Rapamycin unter den experimentellen Bedingungen, die in HEK 293-Zellen getestet wurden (Abbildung 3A), während beide Inhibitoren einen Einfluss auf die mTOR-Signalisierung zeigten, wobei Ramamycin gegen mTORC1-Substrate und PP242, die sowohl auf mTORC1 als auch für mTORC2 abzielten, aktiver war (Abbildung 3B).
Zusammengenommen zeigten diese Ergebnisse, dass PP242 die komplexe Bildung von eIF4F effektiver stört als Rapamycin in HEK293-Zellen und zeigen ferner, dass das EIF4E:eIF4G604-646-System die komplexe EIF4F-Komplexzusammensetzung in lebenden Zellen genau messen kann.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60850/60850fig1.jpg"> Abbildung 1: eIF4E:eIF4G604-646 Komplementierungssystem. Schematische Darstellung zeigt, wie die Wechselwirkung von Protein X (eIF4E) und Protein Y (eIF4G604-646) subA- und SubB-Fusionen in die Nähe zueinander kommen und die aktive Luziferase rekonstituieren kann. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/60850/60850fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60850/60850fig2.jpg"> Abbildung 2: 4EBP1-vermittelte Störung des eIF4F-Komplexes. (A) PP242 und Rapamycin eIF4E:eIF4G604-646 Assay Titration modellierung der Wechselwirkung zwischen eIF4E und eIF4G in transfizierten HEK 293 Zellen. (B,C) Western Blot-Analyse, die den endogene Gehalt an eIF4E, eIF4G und 4EBP1 in HEK 293-Extrakten und in m7GTP zeigt, ziehen nach inkubierender Zellen mit unterschiedlicher Konzentration von PP242 bzw. Rapamycin nach unten. (D) Behandelte Zellen in A, bei denen Multiplexe für Zelllebensfähigkeit und Lumineszenz bewertet wurden. Alle Werte stehen für mittelwert ± SD (n=3). Diese Zahl wurde von16geändert. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/60850/60850fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60850/60850fig3.jpg"> Abbildung 3: Differentialwirkung der mTOR-Hemmung auf 4EBP1-Phoshorylierung. (A) Western Blot Analyse des Phosphorylierungsstatus von 4EBP1 in nicht transfizierten HEK293-Zellen, die mit einer angegebenen Konzentration von PP242 und Rapamycin behandelt wurden. (B) Western Blot Analyse des AKT- und S6-Phosphorylierungsstatus in nicht transfizierten HEK293-Zellen, die entweder mit den dualen MTORC1/2-Aktiv-Standortinhibitoren PP242 oder dem allosterischen Inhibitor von mTORC1 Rapamycin behandelt wurden. Beta-Actin wurde für die Ladekontrolle sowie insgesamt 4EBP1, AKT und S6 visualisiert. Diese Zahl wurde von16geändert. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/60850/60850fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

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Monitoring eIF4F Assembly by Measuring eIF4E-eIF4G Interaction in Live Cells

Hier stellen wir ein Protokoll zur Messung der eIF4E-eIF4G-Interaktion in lebenden Zellen vor, das es dem Anwender ermöglichen würde, die medikamentöse Störung der komplexen EIF4F-Dynamik in Screening-Formaten zu bewerten.

Überwachung der eIF4F-Montage durch Messung der eIF4E-eIF4G-Interaktion in lebenden Zellen

Formation of the eIF4F complex has been shown to be the key downstream node for the convergence of signalling pathways that often undergo&#160;oncogenic ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Cancer Research

3.0K Aufrufe.  A*STAR (Agency for Science, Technology and Research). Hier stellen wir ein Protokoll zur Messung der eIF4E-eIF4G-Interaktion in lebenden Zellen vor, das es dem Anwender ermöglichen würde, die medikamentöse Störung der komplexen EIF4F-Dynamik in Screening-Formaten zu bewerten.

Serie: Monitoring eIF4F Assembly by Measuring eIF4E-eIF4G Interaction in Live Cells

Live Imaging to Study Microtubule Dynamic Instability in Taxane-resistant Breast Cancers

Taxanes such as docetaxel belong to a group of microtubule-targeting agents (MTAs) that are commonly relied upon to treat cancer. However, taxane resistance in cancerous cells drastically reduces the effectiveness of the drugs' long-term usage. Accumulated evidence suggests that the mechanisms underlying taxane resistance include both general mechanisms, such as the development of multidrug resistance due to the overexpression of drug-efflux proteins, and taxane-specific mechanisms, such as those that involve microtubule dynamics. 
Because taxanes target cell microtubules, measuring microtubule dynamic instability is an important step in determining the mechanisms of taxane resistance and provides insight into how to overcome this resistance. In the experiment, an in vivo method was used to measure microtubule dynamic instability. GFP-tagged &#945;-tubulin was expressed and incorporated into microtubules in MCF-7 cells, allowing for the recording of the microtubule dynamics by time lapse using a sensitive camera. The results showed that, as opposed to the non-resistant parental MCF-7CC cells, the microtubule dynamics of docetaxel-resistant MCF-7TXT cells are insensitive to docetaxel treatment, which causes the resistance to docetaxel-induced mitotic arrest and apoptosis. This paper will outline this in vivo method of measuring microtubule dynamic instability.

In this paper, we report a protocol describing an in vivo method to measure microtubule dynamic instability in docetaxel-resistant breast cancer cells (MCF-7TXT). In this method, a deconvolution microscopy imaging system is used to detect the expression of GFP-tubulin in target cells.

Live-Imaging zur Untersuchung Mikrotubuli dynamische Instabilität in Taxan-resistenten Mammakarzinome

Taxanes such as docetaxel belong to a group of microtubule-targeting agents (MTAs) that are commonly relied upon to treat cancer. However, taxane ...

Forschung

Krebsforschung

A Spheroid Killing Assay by CAR T Cells

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric antigen receptor (CAR) redirected T cells obtained the most spectacular results, in particular with pediatric B-acute lymphoblastic leukemia (B-ALL). Classical validation methods of CAR T cells rely on the use of specificity and functionality assays of the CAR T cells against target cells in suspension and in xenograft models. Unfortunately, observations made in vitro are often decoupled from results obtained in vivo and a lot of effort and animals could be spared by adding another step: the use of 3D culture. The production of spheroids out of potential target cells that mimic the 3D structure of the tumor cells when they are engrafted into the animal model represents an ideal alternative. Here, we report an affordable, reliable and easy method to produce spheroids from a transduced colorectal cell line as a validation tool for adoptive cell therapy (exemplified here by CD19 CAR T cells). This method is coupled with an advanced live imaging system that can follow spheroid growth, effector cells cytotoxicity and tumor cell apoptosis.

This protocol is designed to assess immunotherapeutic redirected T-cell (CAR T-cell) cytotoxicity against 3D structured cancerous cells (spheroids) in real time.

Ein Sphäroid Tötung Assay von Auto-T-Zellen

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric ...

Detection and Monitoring of Tumor Associated Circulating DNA in Patient Biofluids

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular sub-classification and temporal monitoring of tumor response to therapy. Here, we describe our dPCR-based method for the detection of tumor somatic mutations in cell free DNA (cfDNA), readily available in&#160;patient biofluids. Although limited in the number of mutations that can be tested for in each assay, this method provides a high level of sensitivity and specificity. Monitoring of mutation abundance, as calculated by MAF, allows for the evaluation of tumor response to therapy, thereby providing a much-needed supplement to radiographic imaging.

Here, we present a protocol to detect tumor somatic mutations in circulating DNA present in patient biological fluids (biofluids). Our droplet digital polymerase chain reaction (dPCR)-based method enables quantification of the tumor mutation allelic frequency (MAF), facilitating a minimally invasive complement to diagnosis and temporal monitoring of tumor response.

Nachweis und Überwachung von tumorassoziierter zirkulierender DNA in Biofluiden von Patienten

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular ...

Semi-automatic PD-L1 Characterization and Enumeration of Circulating Tumor Cells from Non-small Cell Lung Cancer Patients by Immunofluorescence

Circulating tumor cells (CTCs) derived from the primary tumor are shed into the bloodstream or lymphatic system. These rare cells (1&#8722;10 cells per mL of blood) warrant a poor prognosis and are correlated with shorter overall survival in several cancers (e.g., breast, prostate and colorectal). Currently, the anti-EpCAM-coated magnetic bead-based CTC capturing system is the gold standard test approved by the U.S. Food and Drug Administration (FDA) for enumerating CTCs in the bloodstream. This test is based on the use of magnetic beads coated with anti-EpCAM markers, which specifically target epithelial cancer cells. Many studies have illustrated that EpCAM is not the optimal marker for CTC detection. Indeed, CTCs are a heterogeneous subpopulation of cancer cells and are able to undergo an epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) associated with metastatic proliferation and invasion. These CTCs are able to reduce the expression of cell surface epithelial marker EpCAM, while increasing mesenchymal markers such as vimentin. To address this technical hurdle, other isolation methods based on physical properties of CTCs have been developed. Microfluidic technologies enable a label-free approach to CTC enrichment from whole blood samples. The spiral microfluidic technology uses the inertial and Dean drag forces with continuous flow in curved channels generated within a spiral microfluidic chip. The cells are separated based on the differences in size and plasticity between normal blood cells and tumoral cells. This protocol details the different steps to characterize the programmed death-ligand 1 (PD-L1) expression of CTCs, combining a spiral microfluidic device with customizable immunofluorescence (IF) marker set.

The characterization of circulating tumor cells (CTCs) is a popular topic in translational research. This protocol describes a semi-automatic immunofluorescence (IF) assay for PD-L1 characterization and enumeration of CTCs in non-small cell lung cancer (NSCLC) patient samples.

Halbautomatische PD-L1-Charakterisierung und Aufzählung zirkulierender Tumorzellen von nicht-kleinen Lungenkrebspatienten durch Immunfluoreszenz

Circulating tumor cells (CTCs) derived from the primary tumor are shed into the bloodstream or lymphatic system. These rare cells (1&#8722;10 cells per mL ...

In Vitro Assay to Study Tumor-macrophage Interaction

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a malignant brain tumor with no cure, has up to a half the tumor mass TAMs. TAMs can be pro-tumoral or anti-tumoral, depending on the activation of specific genes in the cells. Genetic mutations in the tumors, through regulating cytokine expression, can affect recruitment of TAMs to the tumor microenvironment. Here, we describe a quantitative cell-based assay to assess macrophage recruitment by the conditioned medium from the tumor cells. This assay uses the human macrophage cell line MV-4-11 to study macrophage attraction by the conditioned medium from glioblastoma, allowing for high reproducibility and low variability. Data generated with this assay can contribute to a better understanding of the interaction between the tumor and the tumor microenvironment. Similar assay can be used to assess interaction between the tumor cells and other immune cells, including T cells and natural killer (NK) cells.

This article represents a useful in vitro assay to evaluate the capability of conditioned medium from tumor cells to attract macrophages.

In Vitro-Assay zur Untersuchung der Tumor-Makrophage-Interaktion

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a ...

Monitoring Cancer Cell Invasion and T-Cell Cytotoxicity in 3D Culture

Significant progress has been made in treating cancer with immunotherapy, although a large number of cancers remain resistant to treatment. A limited number of assays allow for direct monitoring and mechanistic insights into the interactions between tumor and immune cells, amongst which, T-cells play a significant role in executing the cytotoxic response of the adaptive immune system to cancer cells. Most assays are based on two-dimensional (2D) co-culture of cells due to the relative ease of use but with limited representation of the invasive growth phenotype, one of the hallmarks of cancer cells. Current three-dimensional (3D) co-culture systems either require special equipment or separate monitoring for invasion of co-cultured cancer cells and interacting T-cells.
Here we describe an approach to simultaneously monitor the invasive behavior in 3D of cancer cell spheroids and T-cell cytotoxicity in co-culture. Spheroid formation is driven by enhanced cell-cell interactions in scaffold-free agarose microwell casts with U-shaped bottoms. Both T-cell co-culture and cancer cell invasion into type I collagen matrix are performed within the microwells of the agarose casts without the need to transfer the cells, thus maintaining an intact 3D co-culture system throughout the assay. The collagen matrix can be separated from the agarose cast, allowing for immunofluorescence (IF) staining and for confocal imaging of cells. Also, cells can be isolated for further growth or subjected to analyses such as for gene expression or fluorescence activated cell sorting (FACS). Finally, the 3D co-culture can be analyzed by immunohistochemistry (IHC) after embedding and sectioning. Possible modifications of the assay include altered compositions of the extracellular matrix (ECM) as well as the inclusion of different stromal or immune cells with the cancer cells.

The presented approach simultaneously evaluates cancer cell invasion in 3D spheroid assays and T-cell cytotoxicity. Spheroids are generated in a scaffold-free agarose multi-microwell cast. Co-culture and embedding in type I collagen matrix are performed within the same device which allows to monitor cancer cell invasion and T-cell mediated cytotoxicity.

Überwachung der Krebszellinvasion und T-Zell-Zytotoxizität in der 3D-Kultur

Significant progress has been made in treating cancer with immunotherapy, although a large number of cancers remain resistant to treatment. A limited ...

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile conditions. Different tests seek to identify and quantify these hallmarks of cancerous cells; however, they often focus on a single aspect of cellular transformation and, in fact, multiple tests are required for their proper characterization. The purpose of this work is to provide researchers with a set of tools to assess cellular transformation in vitro from a broad perspective, thereby making it possible to draw sound conclusions.
A sustained proliferative signaling activation is the major feature of tumoral tissues and can be easily monitored under in vitro conditions by calculating the number of population doublings achieved over time. Besides, the growth of cells in 3D cultures allows their interaction with surrounding cells, resembling what occurs in vivo. This enables the evaluation of cellular aggregation and, together with immunofluorescent labeling of distinctive cellular markers, to obtain information on another relevant feature of tumoral transformation: the loss of proper organization. Another remarkable characteristic of transformed cells is their capacity to grow without attachment to other cells and to the extracellular matrix, which can be evaluated with the anchorage assay.
Detailed experimental procedures to evaluate cell growth rate, to perform immunofluorescent labeling of cell lineage markers in 3D cultures, and to test anchorage-independent cell growth in soft agar are provided. These methodologies are optimized for Breast Primary Epithelial Cells (BPEC) due to its relevance in breast cancer; however, procedures can be applied to other cell types after some adjustments.

This protocol provides experimental in vitro tools to evaluate the transformation of human mammary cells. Detailed steps to follow-up cell proliferation rate, anchorage-independent growth capacity, and distribution of cell lineages in 3D cultures with basement membrane matrix are described.

In Vitro-Bewertung der onkogenen Transformation in menschlichen Mammaepithelzellen

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile ...

A Three-Dimensional Spheroid Model to Investigate the Tumor-Stromal Interaction in Hepatocellular Carcinoma

The aggressiveness and lack of well-tolerated and widely effective treatments for advanced hepatocellular carcinoma (HCC), the predominant form of liver cancer, rationalize its rank as the second most common cause of cancer-related death. Preclinical models need to be adapted to recapitulate the human conditions to select the best therapeutic candidates for clinical development and aid the delivery of personalized medicine. Three-dimensional (3D) cellular spheroid models show promise as an emerging in vitro alternative to two-dimensional (2D) monolayer cultures. Here, we describe a 3D tumor spheroid&#160;model which exploits the ability of individual cells to aggregate when maintained in hanging droplets, and is more representative of an in vivo environment than standard monolayers. Furthermore, 3D spheroids can be produced by combining homotypic or heterotypic cells, more reflective of the cellular heterogeneity in vivo, potentially enabling the study of environmental interactions that can influence progression and treatment responses. The current research optimized the cell density to form 3D homotypic and heterotypic tumor spheroids by immobilizing cell suspensions on the lids of standard 10 cm3 Petri dishes. Longitudinal analysis was performed to generate growth curves for homotypic versus heterotypic tumor/fibroblasts spheroids. Finally, the proliferative impact of fibroblasts (COS7 cells) and liver myofibroblasts (LX2) on homotypic tumor (Hep3B) spheroids was investigated. A seeding density of 3,000 cells (in 20 &#181;L media) successfully yielded Huh7/COS7 heterotypic spheroids, which displayed a steady increase in size up to culture day 8, followed by growth retardation. This finding was corroborated using Hep3B homotypic spheroids cultured in LX2 (human hepatic stellate cell line) conditioned medium (CM). LX2 CM triggered the proliferation of Hep3B spheroids compared to control tumor spheroids. In conclusion, this protocol has shown that 3D tumor spheroids can be used as a simple, economical, and prescreen in vitro tool to study tumor-stromal interactions more comprehensively.

Comprehensive in vitro models that faithfully recapitulate the relevant human disease are lacking. The current study presents three-dimensional (3D) tumor spheroid creation and culture, a reliable in vitro tool to study the tumor-stromal interaction in human hepatocellular carcinoma.

Ein dreidimensionales Sphäroidmodell zur Untersuchung der Tumor-Stroma-Wechselwirkung bei hepatozellulären Karzinomen

The aggressiveness and lack of well-tolerated and widely effective treatments for advanced hepatocellular carcinoma (HCC), the predominant form of liver ...

Modeling Brain Metastasis by Internal Carotid Artery Injection of Cancer Cells

Brain metastasis is a cause of severe morbidity and mortality in cancer patients. Critical aspects of metastatic diseases, such as the complex neural microenvironment and stromal cell interaction, cannot be entirely replicated with in vitro assays; thus, animal models are critical for investigating and understanding the effects of therapeutic intervention. However, most brain tumor xenografting methods do not produce brain metastases consistently in terms of the time frame and tumor burden. Brain metastasis models generated by intracardiac injection of cancer cells can result in unintended extracranial tumor burden and lead to non-brain metastatic morbidity and mortality. Although intracranial injection of cancer cells can limit extracranial tumor formation, it has several caveats, such as the injected cells frequently form a singular tumor mass at the injection site, high leptomeningeal involvement, and damage to brain vasculature during needle penetration. This protocol describes a mouse model of brain metastasis generated by internal carotid artery injection. This method produces intracranial tumors consistently without the involvement of other organs, enabling the evaluation of therapeutic agents for brain metastasis.

Brain metastasis is a cause of severe morbidity and mortality in cancer patients. Most brain metastasis mouse models are complicated by systemic metastases confounding analysis of mortality and therapeutic intervention outcomes. Presented here is a protocol for internal carotid injection of cancer cells that produces consistent intracranial tumors with minimal systemic tumors.

Modellierung der Hirnmetastasierung durch Injektion von Krebszellen in die innere Halsschlagader

Brain metastasis is a cause of severe morbidity and mortality in cancer patients. Critical aspects of metastatic diseases, such as the complex neural ...

Multiparametric Tumor Organoid Drug Screening Using Widefield Live-Cell Imaging for Bulk and Single-Organoid Analysis

Patient-derived tumor organoids (PDTOs) hold great promise for preclinical and translational research and predicting the patient therapy response from ex vivo drug screenings. However, current adenosine triphosphate (ATP)-based drug screening assays do not capture the complexity of a drug response (cytostatic or cytotoxic) and intratumor heterogeneity that has been shown to be retained in PDTOs due to a bulk readout. Live-cell imaging is a powerful tool to overcome this issue and visualize drug responses more in-depth. However, image analysis software is often not adapted to the three-dimensionality of PDTOs, requires fluorescent viability dyes, or is not compatible with a 384-well microplate format. This paper describes a semi-automated methodology to seed, treat, and image PDTOs in a high-throughput, 384-well format using conventional, widefield, live-cell imaging systems. In addition, we developed viability marker-free image analysis software to quantify growth rate-based drug response metrics that improve reproducibility and correct growth rate variations between different PDTO lines. Using the normalized drug response metric, which scores drug response based on the growth rate normalized to a positive and negative control condition, and a fluorescent cell death dye, cytotoxic and cytostatic drug responses can be easily distinguished, profoundly improving the classification of responders and non-responders. In addition, drug-response heterogeneity can by quantified from single-organoid drug response analysis to identify potential, resistant clones. Ultimately, this method aims to improve the prediction of clinical therapy response by capturing a multiparametric drug response signature, which includes kinetic growth arrest and cell death quantification.

This protocol describes a semi-automated method for medium- to high-throughput organoid drug screenings and microscope-agnostic, automated image analysis software to quantify and visualize multiparametric, single-organoid drug responses to capture intratumor heterogeneity.

Multiparametrisches Tumor-Organoid-Wirkstoff-Screening mit Weitfeld-Live-Cell-Imaging für die Bulk- und Einzelorganoid-Analyse

Patient-derived tumor organoids (PDTOs) hold great promise for preclinical and translational research and predicting the patient therapy response from ex ...