Tüm montaj, yerinde hibridizasyon, WISH, geleneksel yöntemlere göre yüksek çözünürlük ve düşük arka plan sonucu sağlar. Ayrıca, U-slayt plakaları fare embriyoları, Drosophila embriyolar ve diğer doku işlemek zor uygulanabilir daha az WISH kullanarak aynı odak uzaklığı odak geliştirmek. Tüp oluşumu tsay kök hücre farklılaştırılmış androjen hücrelerine uygulanabilir.
WISH mutasyon düzeltmesinin işlevsel anlamını anlamanızı kolaylaştırır. Prosedürü gösterecek kişi Yong Wang, laboratuvarımdan araştırma görevlisi. Mikroskop altında çalışarak, femtojet sistemini kullanarak tek hücreli embriyolara iki nanogram Morpholino ve 500 pikogram MRNA enjekte edin.
Morpholinos mikroenjeksiyonu başarıyla hücrelere enjekte ve yumurta bütünlüğünü korumak kadar birçok kez uygulama. Zigotları dechorionated kadar kuluçka ya da amaçlanan deneye karşılık gelen gelişme durumuna ulaşın. El yazmasının birinci tablosunda açıklandığı gibi.
Daha sonra, 1,5 mililitrelik bir tüp 20 ila 40 embriyo aktarmak için plastik bir pipet kullanın. Oda sıcaklığında bir mililitre taze hazırlanmış %4 PFA çözeltisi ekleyin. Embriyoları tamir ettikten, yıkadıktan ve susuz kattıktan sonra embriyoları alt kısmında naylon örgü bulunan bir elek yerleştirin.
Embriyoları sırayla %75 50 ve %25 metanol ile beşer dakika yıkayarak nemlendirin. Embriyoları PBST ile yıkadıktan sonra, embriyolarla birlikte tüpe 50 mikrolitre proteinaz K ekleyin. Sindirimden sonra, proteinaz K çıkarın ve beş dakika her zaman üç kez PBST ile embriyoları yıkayın.
Embriyolar ile her tüp içine karışık hedef probları 50 ila 100 mikrolitre ekleyin. Embriyoları bir gecede 40 derecede kuluçkaya yatırın. El yazmasında açıklandığı gibi embriyoları yıkadıktan sonra, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca embriyoları onarmak için %4 paraformaldehit kullanın.
Daha sonra embriyoları oda sıcaklığında her seferinde 15 dakika boyunca üç kez 2x SSCT çözeltisinde yıkayın. SSCT çözeltisini çıkarın ve 50 mikrolitre Amp 1 ile değiştirin. Sonra embriyoları 40 derecede kuluçkaya yatırın.
30 dakika sonra, 2x SSCT çözeltisi içinde her seferinde 15 dakika oda sıcaklığında embriyoları üç kez yıkayın. SSCT çözeltisini çıkarın ve 50 mikrolitre Amp 2 ekleyin. 15 dakika kuluçkave daha önce olduğu gibi embriyo yıkama sonra, Amp 3 50 mikrolitre ekleyin ve yavaşça tüp dokunun.
Embriyoları 40 derecede kuluçkaya yatırın. 30 dakika sonra daha önce açıklandığı gibi embriyoları yıkayın. Sonra Amp 4 dropwise 50 mikrolitre ekleyin ve dikkatle tüp dokunun.
Daha sonra embriyoları 40 derecede 15 dakika kuluçkaya yatırın ve SSCT ile üç kez yıkayın. Embriyoları el yazmasında açıklandığı gibi görüntüleme için hazırladıktan sonra, numuneyi lekelemek için bir DAB peroksidaz substrat kiti kullanın. Bir mililitre distile suya A, B ve C renk reaktiflerinin her birini 50 mikrolitre ekleyin.
Ve tam bir DAB çalışma sıvısı elde etmek için iyice karıştırın. Sıvıyı numuneye ekleyin ve 10 dakika boyunca kapatın. Numuneleri iyice yıkadıktan sonra, onları görüntülemek için optik mikroskop kullanın.
HHT iPSCs kültür ve kontrol başlamak için, kuyuların alt kapsayacak şekilde altı iyi hücre kültürü plakaları için bodrum membran matris ekleyin. Plakaları 37 derecede bir saat kuluçkaya yatırın. Daha sonra, kullanılan bodrum membran matris çözeltisini kuyulardan çıkarın ve her kuyuya iki mililitre mTeSR 1 orta ekleyin.
Daha sonra son geçitten alınan iPSC'leri yaklaşık 10'un katına, her kuyudaki altı hücreye kadar kesin. IPSC'leri yaklaşık dört gün boyunca biriktmeden sonra, hücre kültür ortamını tamamlayıcı BEL ortamıile değiştirin. Mezoderm hücreleri oluşturmak için üç gün boyunca hücreleri büyütün.
Vasküler endotel hücrelerini genişletmek için, dört gün boyunca takviye BEL orta ile orta değiştirin. Ve sonra aynı ortam ve kültür ile üç ila dört gün boyunca hücreleri tedavi. Kit talimatlarına göre CD31 Dynabeads kullanarak olgun vasküler endotel hücreleri arındırın.
Sonra elüsyon arabelleği tarafından CD31 pozitif hücreleri toplamak. VEGF165, bFGF ve FBS içeren EC-SFM ortamdasaflaştırılmış endotel hücrelerini koruyun ve genişletin. Endotel hücrelerini kaplamak için, anjiyogenez plakalarına her kuyuda 10 mikrolitre bazal membran matris ekleyerek başlayın.
Plakaları 37 derecede 30 dakika kuluçkaya yatırın. Endotel hücrelerini hasat edin ve tekrar tekrar borulandırarak endotel büyüme ortamı 2'de yeniden askıya alın. Her kuyudaki katılaşmış matrise bu hücre süspansiyonunun 50 mikrolitresini ekleyin ve sonra hücreleri 37 derecede kuluçkaya yatırın.
Kuluçka 3-5 saat sonra, endotel tüpü oluşumunu değerlendirmek için yüksek çözünürlüklü bir mikroskop kullanın. Her grup için en az on alanın görüntülerini yakalayın. Genel tüp uzunluğunu, tüp numarasını ve dal noktalarını inceleyin.
CISH ve WISH 24 saat post-fertilizasyon embriyolarında endolin ekspresyonunu belirlemek için yapıldı. Endojen susturmanın etkisini incelemek için hemojenik endotel belirteci ve endotel atası belirteci kullanıldı. Kırmızı oklar, bu belirteçlerin, aplnrna ve npr1a'nın ifadesinin önemli ölçüde azaldığı bölgeleri gösterir.
Endotel tüpü oluşum satomu endoglin mutant ve kontrol iPSC kaynaklı endotel hücrelerinde yapıldı. Tüp oluşumu değerlendirildi ve üç saat sonra fotoğraflandı. Tüp uzunluğu, tüp numarası ve dallanma ImageJ yazılımı kullanılarak ölçüldü.
Mutant endotel hücreleri kontrol endotel hücrelerinden daha az dal oluşturmuştur. Ve mutant endotel hücrelerinde dalları önemli ölçüde vasküler endotelyal büyüme faktörü ile stimülasyon sonra arttı. Bu yöntem aynı zamanda periferik kandan iPS üretimi için de kullanılabilir.
Ve yöntem le in vitro ve in vivo vasküler oluşumunda endokrin rolünü açıklar. Mutasyonun düzeltilmesinin anjiyogenezde bir fark yaratabileceğini bilerek, potansiyel kök hücre tedavisi için hücreleri hastalara geri nakletmek mümkündür.
