Yazarlar bu teknikler geliştirmeye yardımcı laboratuarlarımızda geçmiş ve mevcut üyelerine teşekkür ederim. Kısmi finansman Rejeneratif Tıp / CIRM (RN1-00538) için California Institute hibe tarafından DE sağladı.

1.. Zebra balığı Yetiştiriciliği, Embriyo Üretimi ve Tedavisi <ol><li> Kurumsal bir hayvan bakımı ve kullanımı komitesi (IACUC) gözetiminde ve NIH veya diğer düzenleyici kurumlar / kurallar hayvan bakımı kurallar içinde aşağıdaki Zebra balığı protokolleri Davranış. </li><li> Belirli dokulara, hücrelere veya organlarda floresan proteinleri ifade Zebrafish suşları Zebrafish Uluslararası Resource Center (Zirc) den temin edilebilir. Örneğin, Tg (KDR: EGPF) Bu protokol gösterildiği gibi tam bir 3D vasküler yapılar üretmek için kullanılabilen vasküler endotel hücrelerinin 6, EGFP ifade s843. Transgenik zebrafish hatları Diğer Zirc mevcuttur. </li><li> PH, tuzluluk, sıcaklık, çözünmüş oksijen, ışık, ve diğer çevresel faktörler 7 izler uygun bir yetiştiricilik sisteminin Evi yetişkin zebrabalıkları. Burada gösterilen zebra balığı bir 14 saat lig ile 28.5 ° C&#39;de bir Aquaneering Inc sistemi (San Diego, CA) barındırılmıştırht/10 saat karanlık döngüsü. Yetişkin Zebra tuzlu su karidesi ve NRD 4/6 Balık yemek (Artemia Direct, Ogden, Utah) dengeli bir diyet besleyin. </li><li> Yetişkin erkek ve üreme çağındaki kadın zebra balığı çiftleşme başarılı artırmak için ayrı muhafaza edilmelidir. </li><li> Birlikte yumurta yoluyla düşmek için yeterince büyük delikli bir örgü dibi vardır bir çiftleşme kapta dişileri (2-4) ve erkek (4-6) koyarak yumurtalamasını ve gübreleme teşvik, ama çok küçük Zebrafish yetişkin geçmek için . Önce akşam çiftleşmesi kurmak; yumurta gündüz ışık döngüsü yavaş yavaş yoğunluğu (şafak) artar, genellikle ise, sabaha yakın koyulur. Çiftleşme kabın alt her 15-30 dakika da yumurta kontrol edin. </li><li> E3 tamponu (5 mM NaCI, 0.17 mM KCI, 0.33 mM CaCI2, 0.33 mM MgSO 4) ile bir kafes süzgeç kullanılarak ve temiz yumurta toplamak. Bir 28 ° C kuluçka makinesi içinde E3 tamponu ve mağaza ile doldurulmuş 100 mm kültür plakalarına yumurta aktarın. </li><li> Cer değiştiren kimyasallar çalışmaebrovascular arzu edilen kimyasal konsantrasyonlarda eklemek dallanma. Örneğin neovasular dallanma 24, başlangıç ​​γ-sekretaz inhibitörü 4 DMSO içinde çözülmüş (CBS IX/DAPT/N- [N-(3,5-Difluorophenacetyl-L-alanil)]-S-phenylglycinet-butil ester) ile indüklenebilir saat sonra döllenme (hpf). O zaman noktası embriyolar koryon içinde hala vardır ve birçok kimyasal bunun 8 geçebilir. Bir tedavi durum koryon ücretsiz kırmak için embriyoların yeteneğini bozabilir nöral veya motor etkileri varsa, o embriyolar Pronaz 2 ya forseps ile yapılabilir 24 ve 48 hpf arasında de-chorionated edilmelidir. Sağlanan görüntülerde gösterilen embriyolar yavaşça iki bilenmiş forseps ile koryon kapma ve açık şekilde yırtılarak dechorionated edildi. </li><li> Gerekirse / istenirse, pigment oluşumu 24 hpf E3 tampona% 0.003 N-feniltiyoüre (PTU) eklenmesi ile inhibe edilebilir. </li></ol> Serebrovasküler Struct 2.. Konfokal GörüntülemeSabit Zebra balığı Embriyolar ures <ol><li> 250 mg / L Tricaine metansülfonat embriyolar kurban, ve daha sonra 2 daldırılarak onları gidermek - 4 ° C&#39;de bir gece% 4 paraformaldehit Floresan embriyolar ile Konteynerler folyo sarılmış olmalıdır. Bir kez, sabit görüntülenmiş kadar, embriyolar, 4 ° C&#39;de PBS içinde saklanmalıdır - EGFP floresan yoğunluğu yaklaşık bir hafta sonra daha az çözülmüş hale gelir, ancak morfoloji (parlak alanda gösterildiği gibi) çok daha uzun süre korunur. </li><li> Önce bir bilenmiş tungsten iğne kullanılarak bir gözü kaldırarak embriyo monte hazırlayın. Göz bağlayan doku etrafında kesin ilk önce kas kesilir ve son olarak bir göz yerinden için optik sinir kesti. (Not: her iki tarafını görüntülenmesi isteniyorsa kaldırmak hem de gözleri.) </li><li> Göz kaldırıldıktan sonra,% 3 metilselüloz bir damla kullanarak coverglass embriyo monte. Kaldırılan gözle yan coverglass bakan ve mümkün olduğunca cam olarak yakın böylece embriyo yönlendirin. Mctil ile tüm embriyo Kapakgörüntüleme sırasında kuruma önlemek için lcellulose. </li><li> Resim hemen yüksek kaliteli bir 20x objektif Plan Apo (sayısal açıklık = 0.75 ya da daha iyi) ile donatılan bir ters konfokal mikroskop kullanılarak monte embriyo. Bu yapılandırma, iki cam düzlem arasındaki embriyo sandviç ve üst camın embriyo presleme gerektirecek olmayan bir ters mikroskop tercih edilir. </li><li> Orta veya büyük diyafram ayarını kullanarak 1 mikron aralıklarla optik dilimleri toplayın. 2.5 um&#39;lik Büyük adımları da kullanılabilir, ama daha küçük nesnelerin uzaysal sırasını belirlemek için daha zor olabilir. Küçük delikler keskin detay üretmek, ancak gerekli olan uzun tarar EGFP çamaşır suyu ve de elde edilebilir embriyonun içine görüntüleme derinliğini sınırlayabilir. Bir konfokal mikroskop bir embriyo üzerinden yarım yaklaşık görüntüleme için izin verir. </li><li> Tüm balık görüntüleme isteniyorsa, (adım 3.2 Not) başlangıçta iki gözü kaldırmak, hayal gerçekl sonra embriyo döndürmekKarşı taraf için 2.5 - g bir tarafı ve tekrar 2.3 adımları. </li></ol> Embriyonik Zebra balığı Cerebrovasculature 3. 3D İmar <ol><li> Ücretsiz, 3D görüntü için optimize ve PC, Mac ve Linux bilgisayarlar ile uyumlu olan açık kaynak ImageJ Fiji dağılımını 3 (http://fiji.sc) kullanın. </li><li> Eklentiler&gt; LOCI&gt; BioFormats İthalatçı 9, sonra Nikon yığınlarının (Şekil 2A) örneğin name.ids konfokal dosyayı seçmek için giderek Fiji İthalat konfokal yığınları. Bölünmüş kanalları kontrol, AutoScale kontrol gri tonlama: hyperstack, Renk modu gör yığını seçin. </li><li> Bu seçimler dört ayrı kanal panel açılacaktır; EGFP için tek, genellikle üçüncü bir aşağı gerekli olacaktır. C = 1 (Şekil 2A) ardından uzun bir adı olan 16-bit görüntü bırakarak, diğer üç panelleri (kırmızı, mavi ve alfa) kapatın. </li><li> Görüntü kaydırma ta kullanarak rağmen tarayarak ayarlayabilirsiniz.Özellikb ilgi bölgeyi ya da yapıya sahip bir dilim bulmak için alt kısımdaki, sonra (Şekil 2C)&gt; Eşik ayarlama&gt; Görüntü gidin. </li><li> Gelir panelinde, yapı arka plan üzerinde oldukça iyi görülebilir, böylece sol üst bar (siyah seviyesi) kaydırın ve (Şekil 2B) olduğu alt slayt (beyaz düzey) bırakın. B &amp; W tuşuna, Koyu arka plan seçin. Farklı ayarlamalar her dilim için, Siyah arka plan seçmek gerekli olmadıkça her resim için hesapla Eşik seçmeyin. Bu süreç, yeni bir 8-bit görüntü oluşturur. </li><li> UYARI: Eşik sökülme veya kaydedilmiş ImageJ, yani konfokal yığını bir değişiklik gerektiğinde, her zaman yeniden gerekecektir olamaz. Numaralarını yazmak ve istenen sonuç elde edilene kadar farklı ayarları deneyin. </li><li> Faktörü 1 (iyi) ya da 2 (iyi) örneklemek, Eklentiler&gt; 3D Görüntüleyici&gt; Eşik 0 yazan yeşil bir 3D çıkış yapmak için kırmızı ve mavi renk kutuları kaldırın - aksi takdirde will beyaz bir render üretmek - (Kendiliğinden) (Şekil 2E) Uygula&#39;yı seçin. </li><li> , Döndürmek spin ve fare ve klavye kontrolleri (Şekil 2F) kullanılarak 3D görüntü yakınlaştırma. </li><li> Menüsünden yakalama seçeneğini kullanarak herhangi bir noktada hareketsiz görüntüleri kaydetmek. Ekrandaki görüntü kutusunun boyutu üretilen görüntünün piksel boyutlarını belirler böylece yüksek çözünürlüklü bir görüntü makyaj sağ alt köşesini sürükleyerek kutu büyük isteniyorsa. </li><li> Görünüm&gt; Record 360 ° rotasyon (Şekil 2G) seçerek dönen bir 3D film oluşturun. Adım başı 2 derece dönme varsayılan, ama çok daha küçük dosya boyutları yaratacak örneğin 5 derece, değiştirilebilir, ancak animasyon silkeleme ekleyebilirsiniz. </li><li> Daha sonra, medya oynatıcılar ile inceleyen internete yükleyerek veya PowerPoint sunumları kullanmak için birkaç mevcut biçimlerden birinde dosyayı kaydedin. Açık kaynaklı medya oynatıcı VLC ( <a href="http://www.videolan.org/vlc/index.html">ht</a>) :/ / www.videolan.org / vlc / index.html tp, ücretsiz ve çok iyi bu videoları işler. </li></ol>

<ol>
	<li>Staudt, D., Stainier, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncovering+the+molecular+and+cellular+mechanisms+of+heart+development+using+the+zebrafish.">Uncovering the molecular and cellular mechanisms of heart development using the zebrafish.</a> Annu Rev Genet. 46, 397-418 (2012).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book. , (2007).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9, 676-682 (2012).</li><li>Cameron, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's-related+peptide+amyloid-&#946;+plays+a+conserved+role+in+angiogenesis.">Alzheimer's-related peptide amyloid-&#946; plays a conserved role in angiogenesis.</a> PLoS ONE. 7, (2012).</li><li>Cunvong, K., Huffmire, D., Ethell, D. W., Cameron, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid-&#946;+increases+capillary+bed+density+in+the+adult+zebrafish+retina.">Amyloid-&#946; increases capillary bed density in the adult zebrafish retina.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 54, 1516-1521 (2013).</li><li>Jin, S. W., Beis, D., Mitchell, T., Chen, J. N., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+analyses+of+vascular+tube+and+lumen+formation+in+zebrafish.">Cellular and molecular analyses of vascular tube and lumen formation in zebrafish.</a> Development. 132, 5199-5209 (2005).</li><li>Lawrence, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+husbandry+of+zebrafish+(Danio+rerio):+a+review.">The husbandry of zebrafish (Danio rerio): a review.</a> Aquaculture. 269, 1-20 (2007).</li><li>Hagedorn, M., Kleinhans, F. W., Artemov, D., Pilatus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+major+permeability+barrier+in+the+zebrafish+embryo.">Characterization of a major permeability barrier in the zebrafish embryo.</a> Biol Reprod. 59, 1240-1250 (1998).</li><li>Schmid, B., Schindelin, J., Cardona, A., Longair, M., Heisenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-level+3D+visualization+API+for+Java+and+ImageJ.">A high-level 3D visualization API for Java and ImageJ.</a> BMC Bioinformatics. 11, 274 (2010).</li><li>Opitz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+zebrafish+illuminate+the+dynamics+of+thyroid+morphogenesis+and+its+relationship+to+cardiovascular+development.">Transgenic zebrafish illuminate the dynamics of thyroid morphogenesis and its relationship to cardiovascular development.</a> Dev Biol. 372, 203-216 (2012).</li><li>Gleave, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroanatomical+phenotyping+of+the+mouse+brain+with+three-dimensional+autofluorescence+imaging.">Neuroanatomical phenotyping of the mouse brain with three-dimensional autofluorescence imaging.</a> Physiol Genomics. 44, 778-785 (2012).</li><li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems.">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497, 332-337 (2013).</li><li>Markaki, Y., Smeets, D., Cremer, M., Schermelleh, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+in+situ+hybridization+applications+for+super-resolution+3D+structured+illumination+microscopy.">Fluorescence in situ hybridization applications for super-resolution 3D structured illumination microscopy.</a> Methods Mol Biol. 950, 43-64 (2013).</li><li>Walter, T. J., Sparks, E. E., Huppert, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-dimensional+resin+casting+and+imaging+of+mouse+portal+vein+or+intrahepatic+bile+duct+system.">3-dimensional resin casting and imaging of mouse portal vein or intrahepatic bile duct system.</a> J Vis Exp. 68, e4272 (2012).</li></ol>

Ifşa hiçbir şey yok.

Burada açıklanan yöntemler zebrafish gelişmekte olan damar sistemi görsel çalışmalar için bir temel sağlar. Sabit örnekleri yüksek çözünürlüklü konfokal görüntüleme. Drosophila ve C için kullanılabilir ise canlı örnekleri, kalp hızı ve kalp vuruş hacmi olarak fizyolojik parametreleri değerlendirmek için kullanılabilir elegans tüm vücut görüntülemesi için izin verir, ama omurgalıların zebra balığı ve bir endotel hücre-kaplı damar sistemi de dahil olmak üzere omurgalı dokular için yararlı bir model sağlar. Bu çalışmalar Zebrafish araştırma eden önemli transgenik hatları ve genomik kaynaklar dahil edebilirsiniz. 3D rekonstrüksiyonu ve embriyonik zebrabalıkları ikinci eş odaklı görüntü oluşturma, burada açıklandığı gibi, damar dallanması ve bu sıçan ve fareler gibi daha büyük hayvan modelleri ile mümkün değildir damar yoğunluğu ile bir sistem biyoloji yaklaşımı için izin verir. Ayrıca, Zebra balığı değiştirilebilir bir ortamda (E3 tampon) geliştirmek amniotları gibi, nerede bir kolaylıkla c ekleyebilirsinizdamar gelişimini etkileyen belirli enzimleri veya diğer süreçlerini engelleyen hemicals. Kimyasal teslim konsantrasyonu ve zamanlaması araştırmacı ince ayar tedavi koşulları sağlayan, değiştirilebilir. 1.. Değişiklikler ve sorun giderme Bu sistem değişiklikler doku, organ veya bölgeye özel desenler 10 çeşitli EGFP ya da diğer floresan proteinleri ifade zebrabalıkları transjenik çizgileri dahil olabilir. Bundan başka, zebra balığı retinada neovasküler değişikliklerin analizi son 5 yayınlanmıştır. Büyük embriyolar ve yetişkin zebrabalıkları pigmentasyon problemleri ölçekli pigmentler veya retina pigment üretemez transgenik hatları ile geçerek telafi edilebilir. Azalmış floresan Sorunları genellikle uygunsuz tespit koşullarından kaynaklanabilir. 1 gün boyunca paraformaldehit (% 4) uygun olduğu, ancak bu glutaraldehit, ozmiyum tetroksit veya alkol gibi güçlü bir sabitleyici, mayEGFP floresan yok eder. Fiksasyon sonra, embriyolar 4 ° C&#39;de PBS tutulmalı ve her zaman doğrudan güneş ışığından korunmalıdır. Bu tekniğin 2. Sınırlamalar Bu protokol ile üretilen 3D görüntü kalitesi ve çözünürlüğü oluşturulan görüntülerin kalitesine bağlıdır. Bu embriyolar ile ışık penetrasyon standart bir konfokal mikroskop kullanılarak orta sajital düzlem ile sınırlıdır. Bu görüntüleme yönü büyük embriyolar ve yetişkinlerde görüntüleme derinliğini sınırlar, ancak daha gelişmiş çoklu foton mikroskopi sistemleri derinlikte görüntüleme için izin. Mevcut yöntemlere göre 3. Önemi Bu protokol, bütün bir hayvan dahil bir sistem bir düzeyde kan damarı ağları analizlerine bir yaklaşım sağlar. Bu verilerin daha önceki temsilleri sık sık birlikte ortaya koydu görüntülerin dizi dayanıyordu, ancak 3D render mekansal Yakınlarının daha iyi çözünürlük sağlariçeriyordu tin. 4. Gelecek uygulamalar Görüntüleme ve doku işleme yeni gelişmeler yaşlı embriyolar veya yetişkin şeffaf 11-14 yaparak içerebilir, bu yöntemler için yeni uygulamalar sağlayacaktır. Geliştirilmiş şeffaflık büyük ölçüde konfokal ve çoklu foton lazerler doku penetrasyonu artacak. Bundan başka, kamera ve foto çoklayıcı tüplerin hızı gibi yakında bir analiz 4. boyuta sağlayan, gerçek zamanlı olarak balık 3D kaplamalar üretmek mümkün olabilir artar. 5.. Kritik adımlar Bu protokol kritik bir adım, tam sabitlemeyi içeren görüntüleme için hazırlıktır. Görüntüleme mevcut en iyi sayısal deliklere sahip yüksek kalite hedefleri ile tespitin ardından en kısa sürede yapılmalıdır. Çözünürlük kullanılan görüntüleme sistemine bağlıdır, çok yüksek kalite sistemleri genellikle daha iyi. 3D render üreten, yoğun bellekbellek ve iyi bir grafik işlemciler büyük bir miktarı ile çok daha yeni, yüksek-uç bilgisayarlar için tavsiye edilir. Bu yöntemler, nöronlar, kas, bezler ya da herhangi bir sayıda popülasyonlarında, GFP ya da diğer floresan proteinleri ifade eden transgenik embriyo adapte edilebilir olsa da, burada açıklanan görsel biyoloji sistemi, vasküler endotelyal hücrelerde EGFP ifade eden transgenik zebrabalıkları için optimize edilmiştir Diğer hücreler. Bu sistemle birlikte çalışma konusunda büyük avantajı sabit ve / veya canlı hayvanlarda, bu gelişim sürecinde herhangi bir anda tüm embriyo neler olduğunu incelemek için yeteneğidir.

Zebra balığı gelişim biyolojisi okumak için güçlü bir sistem sağlamak ve onların embriyoların göreceli saydamlık görüntüleme bazlı çalışmalarda 1 elverişlidir. Zebrafish on yıllardır omurgalı gelişimi için bir model olarak kullanılmıştır. Zebra balığı dahil Teleost&#39;un, omurgasızlar hiçbir makul homoloğunu sahip basitleştirilmiş bir omurgalı damar sistemi var. Kan bu oksijenli solungaçları yoluyla iki bölmeli bir kalbin ön odasından pompalanır. Solungaçları Kan dorsal aorta yakınsarsa ve daha küçük ve daha küçük damarları içine şube arterler, organ dokularında sonunda ulaşan kılcal damarlar yoluyla geçer. Kılcal kısımlar, oksijen içinde serbest bırakılır ve karbon dioksit emilir. Kapiller venöz kan tarafında daha büyük ve büyük damarlar içine akar ve son olarak döngü tekrar kalp, posterior odacık içine çekilir. Bir yetişkin zebrabalıkları bir seferde 200 veya daha fazla yumurta, ve onc olabilire döllenmiş, hızla 2 gelişir. Bir gün içinde vücut ekseni de koryon zarı içinde etrafında embriyo hareket sözleşme ve kaslar da dahil olmak üzere, geliştirilmiştir. 2-7 günden sonrası fertilizasyon (DPF) çoğu vücut sistemleri gözleri ve gıda doğru veya uzakta parlak ışıktan yüzme koordine bir merkezi sinir sistemi de dahil olmak üzere, gelişir. Kadar 7 dpf&#39;e embriyolar mikroskobu ile görselleştirme için izin vermek için yeterince küçük. Floresan proteinleri sentezleyen transgenik hatları konfokal veya floresan mikroskobu ile görüntülü olabilir. Konfokal görüntüleme vasküler gelişimin bir sistem biyolojisi bakış açısı sağlamak Zebra balığı embriyolarının tam vasküler yapıların 3 boyutlu görüntü oluşturmak için açık kaynak yazılım 3 ile eşleştirilmiş olabilir. Bu damar ağlarının 4,5 bir sistem düzeyinde analiz için izin verir gibi vasküler ve serebrovasküler karmaşıklığı değişiklikleri ile ilgili çalışmalar, bu protokol yararlanacaktır. Yöntemleri ve kaynakların bir derleme sağlamak vardırembriyonik Zebrafish vasküler yapıların görüntülemesi gerektiren çalışmalar için kolay benimsenmesi ve bu tekniklerin izin d. Bir hayvan modeli olarak zebrabalıkları maliyet etkinliği, omurgalı gelişimi ve homeostazında moleküler yollarının anjiyojenik etkisini değerlendirmek için yeni platformlar sağlamak için ortaya çıkan görüntüleme teknolojileri ile bir araya getirmektedir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="889">
	<tbody>
		<tr>
			<td>N &#8211; Phenylthiourea&#160;</td>
			<td>Alfa Aesar, catalog #41972</td>
			<td></td>
			<td>0.2 M in E3 buffer, kept at 4oC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E3 buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td>5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>D-EclipseC1 on a Nikon TE-2000U</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dishes</td>
			<td>Mat-Tek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GSI IX/DAPT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>N-[N-(3,5-Difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycinet-butyl ester EMD Biosciences</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plates&#160;</td>
			<td>Becton-Dickinson, cat# 351147</td>
			<td></td>
			<td>BD Falcon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipettes&#160;</td>
			<td>VWR,&#160; cat #414004-001</td>
			<td></td>
			<td>VWR disposable transfer pipets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl-cellulose&#160;</td>
			<td>Alfa Aesar, cat#43146</td>
			<td></td>
			<td>3% in E3 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NRD 4/6 Fish food&#160;</td>
			<td>Brine Shrimp Direct</td>
			<td></td>
			<td>Dried</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brine shrimp</td>
			<td>Brine Shrimp Direct</td>
			<td></td>
			<td>Live</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tungsten wire&#160;</td>
			<td>Small Parts # TW-016-60</td>
			<td></td>
			<td>0.016&#8221; OD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine</td>
			<td>VWR # 101107-950</td>
			<td></td>
			<td>Tricaine methanesulfonate 250 mg/L in E3 buffer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging and 3d reconstruction of cerebrovascular structures in embryonic zebrafish

Zebra balığı, in vivo gelişimsel biyoloji ve patoloji incelemek için güçlü bir araçtır. Küçük boyutu ve zebra balığı embriyoların nispi şeffaflık gibi kalp ve damar gelişimi gibi süreçlerinin görsel inceleme için özellikle kullanışlı hale getirir. Birçok son çalışmalarda, vasküler endotelyal hücrelerde EGFP ifade eden transgenik zebra balığı görüntü için kullanıldı ve konfokal mikroskopi kullanılarak, beyinde ve retinada kompleks vasküler ağların analiz. Tanımlar, hazırlama ve tedavi resim gelişmiş yeşil floresan protein (EGFP) ifade zebra balığı embriyolar ve daha sonra serebrovasküler sistemin kapsamlı 3D kaplamalar oluşturmak için temin edilmiştir. Protokoller embriyoların tedavi, konfokal görüntüleme ve EGFP floresan korumak tespit protokolleri bulunmaktadır. Ayrıca, bu tür zararlı yakındaki sinir doku olmadan çıkarılması göz gibi serebrovasküler yapıların, yüksek kaliteli görüntüler elde etme hakkında yararlı ipuçları verilmektedir. Potansiyel tuzaklarkonfokal görüntüleme ile serbestçe kullanılabilir açık kaynak kodlu yazılım kullanarak konfokal görüntü yığınlarının 3D rekonstrüksiyon oluşturmak için gerekli adımları birlikte tartışılmıştır.

Vasküler yapıların 3 boyutlu rekonstrüksiyon Zebra balığı bir gelişme kapsamlı ve görsel olarak ilginç bir bakış açısı sağlar. Onlar genellikle yapıldığı gibi 1 ve 2 yöntemleri Rakamlar. Şekil 3. endotel hücreleri EGFP ifade Zebra balığı embriyo dpf&#39;e 6 vasküler yapıların çeşitli açılarını göstermektedir. Bir katı yeşil veya beyaz renk ile bu sinyal yoğunluğunu takdir etmek zor olabilir; pseudo-boyama bir look-up-tablodan görüntü yoğunluğunu sağlamak ve yapıları örtüştüğü zaman daha iyi bir derinlik algısı sağlar. In damar bir sözde renkli 3D görüntü bir örneği, bir 6 zebra balığı, Şekil 4&#39;te sağlanmıştır dpf. Canlı embriyo Floresan Görüntüleme göz ve vücut hareketi içerir fizyolojik özelliklerini incelemek için kullanılabilir ve kalp aktivitesi. 3 ve 4, Şekil transgenik Zebrafish satırını kullanarak, bu yöntemlerle elde edilen temsili sonuçlar göstermektedir<html> tarif. Görüntüleme çözünürlüklü mikroskop özelliklerine bağlıdır, ancak EGFP sinyalinin parlaklık en ticari sistemler ile iyi görüntü kalitesi için yeterlidir. 3D temsillerinin İmar ve render tutarlı ve bu açık kaynak yazılım içindeki seçenekleri sürekli iyi sonuçlar sağlar. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50417/50417fig1highres.jpg" width="600" /> Şekil 1. Göz giderme. A) bir tungsten ihtiyacı olan sabit bir 3 dpf embriyo göze yanına yerleştirilir. Doku) bu pozisyon. B göz çevresinde kesilir gözü düşer ve altta yatan oküler kaslar ve optik sinir kesilir. Boş göz soket kesik daire ile gösterilir. C) Aynı embriyo üzerinde döndü ve metil-selüloz ile monte edilir, yukarı bakacak sağlam gözle.<html> hres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız. <img alt="Şekil 2," fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50417/50417fig2highres.jpg" width="600" /> Şekil 2. Adım-adım bir konfokal görüntü yığını 3D rekonstrüksiyon. A) ilgi bölge ile bir dilim bulduktan sonra. B) seçmek için Eklentiler&gt; LOCI&gt; Bioformat kullanarak Fiji içinde yüklü dosyayı aç (4104.1.ids), eşik ayarı gösterilmiştir. C) olarak seçilen eşik üst kullanılarak 214 ayarlanır kaymak ve uygulamak seçilir. gösterildiği gibi D) 3D görüntüleyici denir. E) 3 boyutlu rekonstrüksiyon yönlendirme için sağlam göz ile bir zebrabalıkları. F) görüntü yakınlaştırılmış ve. G) A 360 derece dönüş filmi döndürülmüş gelmiştir gösterilir gösterildiği gibi yapılır.<html> res.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız. <img alt="Şekil 3," fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50417/50417fig3highres.jpg" width="600" /> Şekil 3.. 3D rekonstrüksiyon Perspektifler. A) 10x objektif ile görüntülü 6 dpf&#39;e embriyonun medial perspektif, ağız sağda, ağız içinde değil solungaçları. B aynı embriyo) Yanal, not fin ortada bir döngü. 20x objektif ile görüntülenmiş C) Aynı embriyo, 20x objektif görüntüleme medial perspektif, not solungaç çözünürlük. D) Yanal perspektif. Fin panelinin sağ kenarında. 20x objektif görüntüleme E) ön-medial görünümü, sağa bir 20x objektif, baş onunla görüntülü aynı embriyo ağız içinde not solungaçları. F) Karın. Sağ alt kısmında yumurta sarısının üzerine damarsal unutmayın.jove.com/files/ftp_upload/50417/50417fig3highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız. <img alt="Şekil 4," fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50417/50417fig4highres.jpg" width="600" /> Sinyal yoğunluğu için bir Pseudocolor look-up-tablosunu kullanarak 6 dpf yeniden 6 dpf&#39;e embriyo Şekil 4. Yoğunluk farklılıklar. Image. Ağız, beyin, solungaçları ve yolk kesesi yönelim etiketli. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50417/50417fig4highres.jpg" target="_blank">, bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50417/Zfish_still.jpg" width="500" /> 4 dpflik zebrabalıkları yeniden damar sisteminin Şekil 5. Movie. Balık 2,5 mikron ile görüntülendi. Görüntüler vardıEmbriyonun yarısını görüntüleme dan. Şekil 6&#39;da yer alan bir GSI ile muamele edilmiş zebrabalıkları yapılarla vasküler yapıları karşılaştır. Baş kan damarlarının daha düşük yoğunluklu ve daha büyük solungaçları not edin. (Yüklemeler altında &quot;Zfish_spin.avi&quot; ek dosyasına bakınız) <img alt="Şekil 6," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50417/Zfish_still1.jpg" width="500" /> Şekil 6. 4 dpf&#39;e bir GSI-tedavi edilen embriyo damar sistemi 3D Film. Balıklar orta hatta lateral boyunca 2.5 mikron ile görüntülendi. Şekil 5&#39;te gösterilen balık dpf&#39;e kontrolü 4 ile vasküler yapıları karşılaştırın. Kemerli sırt ve küçük boyutu bu kimyasal ile tedavi embriyoların tipiktir. (Yüklemeler altında &quot;GSI-treated_4dpf_fish.avi&quot; ek dosyasına bakınız)

Watch this Scientific Journal Video about Imaging and 3D Reconstruction of Cerebrovascular Structures in Embryonic Zebrafish at JoVE.com

Imaging and 3D Reconstruction of Cerebrovascular Structures in Embryonic Zebrafish

Larva Zebrafish serebrovasküler gelişme görüntüleme açıklanmıştır. 3D görüntüleme kolaylaştırmak ve kimyasal tedaviler kullanarak serebrovasküler gelişimini değiştirme teknikleri de verilmektedir.

Görüntüleme ve Embriyonik Zebra balığı Serebrovasküler Yapıların 3D İmar

Zebrafish are a powerful tool to study developmental biology and pathology in vivo.  The small size and relative transparency of zebrafish embryos make ...

imaging-3d-reconstruction-cerebrovascular-structures-embryonic

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

14.7K Görüntüleme.  Western University of Health Sciences.  Larva Zebrafish serebrovasküler gelişme görüntüleme açıklanmıştır. 3D görüntüleme kolaylaştırmak ve kimyasal tedaviler kullanarak serebrovasküler gelişimini değiştirme teknikleri de verilmektedir. 

Video: Imaging and 3D Reconstruction of Cerebrovascular Structures in Embryonic Zebrafish

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the developing zebrafish brain (Gutzman et al, 2008). Such analysis affords a new understanding of the underlying cell biology required for development of the 3D structure of the vertebrate brain, and significantly increases our ability to study neural tube morphogenesis. The embryonic zebrafish brain is shaped beginning at 18 hours post fertilization (hpf) as the ventricles within the neuroepithelium inflate. By 24 hpf, the initial steps of neural tube morphogenesis are complete. Using the method described here, embryos at the one cell stage are injected with mRNA encoding membrane-targeted green fluorescent protein (memGFP). After injection and incubation, the embryo, now between 18 and 24 hpf, is mounted, inverted, in agarose and imaged by confocal microscopy. Notably, the zebrafish embryo is transparent making it an ideal system for fluorescent imaging. While our analyses have focused on the midbrain-hindbrain boundary and the hindbrain, this method could be extended for analysis of any region in the zebrafish to a depth of 
80-100 &mu;m.

In this video, we demonstrate a method by which to analyze the developing vertebrate brain in live zebrafish embryos at single cell resolution by confocal microscopy. This includes the method by which we inject the single-cell zebrafish embryo and subsequently mount and image the developing brain.

Konfokal Mikroskop Zebra balığı Embriyonik Beyin Görüntüleme Canlı

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Biyoloji

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we present a protocol for the mounting of Drosophila melanogaster embryos and subsequent live imaging of fluorescently labeled hemocytes, the embryonic macrophages of this organism. Using the Gal4-uas system1 we drive the expression of a variety of genetically encoded, fluorescently tagged markers in hemocytes to follow their developmental dispersal throughout the embryo. Following collection of embryos at the desired stage of development, the outer chorion is removed and the embryos are then mounted in halocarbon oil between a hydrophobic, gas-permeable membrane and a glass coverslip for live imaging. In addition to gross migratory parameters such as speed and directionality, higher resolution imaging coupled with the use of fluorescent reporters of F-actin and microtubules can provide more detailed information concerning the dynamics of these cytoskeletal components.

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Drosophila hemocytes disperse over the entirety of the developing embryo. This protocol demonstrates how to mount and image these migrations using embryos with fluorescently labelled hemocytes.

Uygulamalarda Canlı Görüntüleme Drosophila melanogaster Embriyonik Hemocyte Göçler

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Microdissection of Zebrafish Embryonic Eye Tissues

Zebrafish is a popular animal model for research on eye development because of its rapid ex utero development and good fecundity. By 3 days post fertilization (dpf), the larvae will show the first visual response. Many genes have been identified to control a proper eye development, but we are far from a complete understanding of the underlying genetic architecture. Whole genome gene expression profiling is a useful tool to elucidate genetic regulatory network for eye development. However, the small size of the embryonic eye in zebrafish makes it challenging to obtain intact and pure eye tissues for expression analysis. For example, the anterior-posterior length of the eye between day 2 and 3 is only approximately 200-300 &mu;m, while the diameter of the lens is less 100 &mu;m. Also, the retinal pigment epithelium (RPE) underlying the retina is just a single-layer epithelium. While gene expression profiles can be obtained from the whole embryo, they do not accurately represent the expression of these tissues. Therefore pure tissue must be obtained for a successful gene expression profiling of eye development. To address this issue, we have developed an approach to microdissect intact retina and retina with RPE attached from 1-3 dpf, which cover major stages of eye morphogenesis. All procedures can be done with fine forceps and general laboratory supplies under standard stereomicroscopes. For retinal dissection, the single-layer RPE is removed and peeled off by brushing action and the preferential adherence of the RPE remnants to the surface of the culture plate for dissection. For RPE-attached retinal dissection, the adherence of RPE to the dissection plate is removed before the dissection so that the RPE can be completely preserved with the retina. A careful lifting action of this tissue can efficiently separate the presumptive choroid and sclera. The lens can be removed in both cases by a chemically etched tungsten needle. In short, our approach can obtain intact eye tissues and has been successfully utilized to study tissue-specific expression profiles of zebrafish retina1, 2 and retinal pigment epithelium3.

This article describes an approach to microdissect zebrafish retinas with and without retinal pigment epithelium attached, from one to three days postfertilization embryos.

Zebra balığı Embriyonik Göz Dokular, Mikrodisseksiyon

Zebrafish is a popular animal model for research on eye development because of its rapid ex utero development and good fecundity. By 3 days post ...

Immunostaining of Dissected Zebrafish Embryonic Heart

Zebrafish embryo becomes a popular in vivo vertebrate model for studying cardiac development and human heart diseases due to its advantageous embryology and genetics 1,2. About 100-200 embryos are readily available every week from a single pair of adult fish. The transparent embryos that develop ex utero make them ideal for assessing cardiac defects 3. The expression of any gene can be manipulated via morpholino technology or RNA injection 4. Moreover, forward genetic screens have already generated a list of mutants that affect different perspectives of cardiogenesis 5. 
Whole mount immunostaining is an important technique in this animal model to reveal the expression pattern of the targeted protein to a particular tissue 6. However, high resolution images that can reveal cellular or subcellular structures have been difficult, mainly due to the physical location of the heart and the poor penetration of the antibodies. 
 Here, we present a method to address these bottlenecks by dissecting heart first and then conducting the staining process on the surface of a microscope slide. To prevent the loss of small heart samples and to facilitate solution handling, we restricted the heart samples within a circle on the surface of the microscope slides drawn by an immEdge pen. After the staining, the fluorescence signals can be directly observed by a compound microscope. 
Our new method significantly improves the penetration for antibodies, since a heart from an embryonic fish only consists of few cell layers. High quality images from intact hearts can be obtained within a much reduced procession time for zebrafish embryos aged from day 2 to day 6. Our method can be potentially extended to stain other organs dissected from either zebrafish or other small animals.

A rapid way to conduct immunostaining of zebrafish embryonic heart is described. Compared to the whole mount immunostaining approach, this method dramatically increases the penetration of the antibodies, which allows obtaining high resolution images that reveal cellular/subcellular structures in the heart within a much reduced processing time.

Zebra balığı Embriyonik Kalp Dissected, immün

Zebrafish embryo becomes a popular in vivo vertebrate model for studying cardiac development and human heart diseases due to its advantageous embryology ...

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

The pancreas controls vital functions of our body, including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar levels1. Although in the past decade many studies have contributed to a solid foundation for understanding pancreatic organogenesis, important gaps persist in our knowledge of early pancreas formation2. A complete understanding of these early events will provide insight into the development of this organ, but also into incurable diseases that target the pancreas, such as diabetes or pancreatic cancer. Finally, this information will generate a blueprint for developing cell-replacement therapies in the context of diabetes.
 During embryogenesis, the pancreas originates from distinct embryonic outgrowths of the dorsal and ventral foregut endoderm at embryonic day (E) 9.5 in the mouse embryo3,4. Both outgrowths evaginate into the surrounding mesenchyme as solid epithelial buds, which undergo proliferation, branching and differentiation to generate a fully mature organ2,5,6. Recent evidences have suggested that growth and differentiation of pancreatic cell lineages, including the insulin-producing &beta;-cells, depends on proper tissue-architecture, epithelial remodeling and cell positioning within the branching pancreatic epithelium7,8. However, how branching morphogenesis occurs and is coordinated with proliferation and differentiation in the pancreas is largely unknown. This is in part due to the fact that current knowledge about these developmental processes has relied almost exclusively on analysis of fixed specimens, while morphogenetic events are highly dynamic.
 Here, we report a method for dissecting and culturing mouse embryonic pancreatic buds ex vivo on glass bottom dishes, which allow direct visualization of the developing pancreas (Figure 1). This culture system is ideally devised for confocal laser scanning microscopy and, in particular, live-cell imaging. Pancreatic explants can be prepared not only from wild-type mouse embryos, but also from genetically engineered mouse strains (e.g. transgenic or knockout), allowing real-time studies of mutant phenotypes. Moreover, this ex vivo culture system is valuable to study the effects of chemical compounds on pancreatic development, enabling to obtain quantitative data about proliferation and growth, elongation, branching, tubulogenesis and differentiation. In conclusion, the development of an ex vivo pancreatic explant culture method combined with high-resolution imaging provides a strong platform for observing morphogenetic and differentiation events as they occur within the developing mouse embryo.

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Here, we describe a method for isolation, culture and manipulation of mouse embryonic pancreas. This represents an excellent ex vivo system for studying various aspects of pancreatic development, including morphogenesis, differentiation and growth. Pancreatic bud explants can be cultured for several days and used in a range of different applications, including whole-mount immunofluorescence and live imaging.

Için bir sistem<em&gt; Ex vivo</emEmbriyonik Pankreas&gt; ekimi

The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...

Laser-inflicted Injury of Zebrafish Embryonic Skeletal Muscle

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections (bupivacaine, cardiotoxin or notexin), muscle transplantations (denervation-devascularization induced regeneration), intensive exercise, but also murine muscular dystrophy models such as the mdx mouse (for a review of these approaches see 1). In zebrafish, genetic approaches include mutants that exhibit muscular dystrophy phenotypes (such as runzel2 or sapje3) and antisense oligonucleotide morpholinos that block the expression of dystrophy-associated genes4. Besides, chemical approaches are also possible, e.g. with Galanthamine, a chemical compound inhibiting acetylcholinesterase, thereby resulting in hypercontraction, which eventually leads to muscular dystrophy5. However, genetic and pharmacological approaches generally affect all muscles within an individual, whereas the extent of physically inflicted injuries are more easily controlled spatially and temporally1. Localized physical injury allows the assessment of contralateral muscle as an internal control. Indeed, we recently used laser-mediated cell ablation to study skeletal muscle regeneration in the zebrafish embryo6, while another group recently reported the use of a two-photon laser (822 nm) to damage very locally the plasma membrane of individual embryonic zebrafish muscle cells7.
Here, we report a method for using the micropoint laser (Andor Technology) for skeletal muscle cell injury in the zebrafish embryo. The micropoint laser is a high energy laser which is suitable for targeted cell ablation at a wavelength of 435 nm. The laser is connected to a microscope (in our setup, an optical microscope from Zeiss) in such a way that the microscope can be used at the same time for focusing the laser light onto the sample and for visualizing the effects of the wounding (brightfield or fluorescence). The parameters for controlling laser pulses include wavelength, intensity, and number of pulses.
Due to its transparency and external embryonic development, the zebrafish embryo is highly amenable for both laser-induced injury and for studying the subsequent recovery. Between 1 and 2 days post-fertilization, somitic skeletal muscle cells progressively undergo maturation from anterior to posterior due to the progression of somitogenesis from the trunk to the tail8, 9. At these stages, embryos spontaneously twitch and initiate swimming. The zebrafish has recently been recognized as an important vertebrate model organism for the study of tissue regeneration, as many types of tissues (cardiac, neuronal, vascular etc.) can be regenerated after injury in the adult zebrafish10, 11.

The method presented here comprises the precise injury of live zebrafish embryos with high-energy laser pulses and the subsequent analysis of these injuries and their recovery with time. We also show how genetically labeled single or groups of skeletal muscle cells can be tracked during and after laser light induced damage.

Zebra balığı Embriyonik İskelet Kası Lazer-yaralama

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections ...

Analysis of Embryonic and Larval Zebrafish Skeletal Myofibers from Dissociated Preparations

The zebrafish has proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and for studying human muscle diseases. Despite the many advantages offered by in vivo analysis of skeletal muscle in the zebrafish, visualizing the complex and finely structured protein milieu responsible for muscle function, especially in whole embryos, can be problematic. This hindrance stems from the small size of zebrafish skeletal muscle (60 &mu;m) and the even smaller size of the sarcomere. Here we describe and demonstrate a simple and rapid method for isolating skeletal myofibers from zebrafish embryos and larvae. We also include protocols that illustrate post preparation techniques useful for analyzing muscle structure and function. Specifically, we detail the subsequent immunocytochemical localization of skeletal muscle proteins and the qualitative analysis of stimulated calcium release via live cell calcium imaging. Overall, this video article provides a straight-forward and efficient method for the isolation and characterization of zebrafish skeletal myofibers, a technique which provides a conduit for myriad subsequent studies of muscle structure and function.

Zebrafish are an emerging system for modeling human disorders of the skeletal muscle. We describe a fast and efficient method to isolate skeletal muscle myofibers from embryonic and larval zebrafish. This method yields a high-density myofiber preparation suitable for study of single skeletal muscle fiber morphology, protein subcellular localization, and muscle physiology.

Disosiye Müstahzarlar gelen Embriyonik ve larval Zebra balığı İskelet myofibers Analizi

The zebrafish has  proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and  for studying human muscle diseases. Despite  the many ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, we use the salivary glands of live mice since they provide several advantages. First, they can be easily exposed to enable access to the optics, and stabilized to facilitate the reduction of the motion artifacts due to heartbeat and respiration. This significantly facilitates imaging and tracking small subcellular structures. Second, most of the cell populations of the salivary glands are accessible from the surface of the organ. This permits the use of confocal microscopy that has a higher spatial resolution than other techniques that have been used for in vivo imaging, such as two-photon microscopy. Finally, salivary glands can be easily manipulated pharmacologically and genetically, thus providing a robust system to investigate biological processes at a molecular level.
In this study we focus on a protocol designed to follow the kinetics of the exocytosis of secretory granules in acinar cells and the dynamics of the apical plasma membrane where the secretory granules fuse upon stimulation of the beta-adrenergic receptors. Specifically, we used a transgenic mouse that co-expresses cytosolic GFP and a membrane-targeted peptide fused with the fluorescent protein tandem-Tomato. However, the procedures that we used to stabilize and image the salivary glands can be extended to other mouse models and coupled to other approaches to label in vivo cellular components, enabling the visualization of various subcellular structures, such as endosomes, lysosomes, mitochondria, and the actin cytoskeleton.

Intravital microscopy is a powerful tool that enables imaging various biological processes in live animals. In this article, we present a detailed method for imaging the dynamics of subcellular structures, such as the secretory granules, in the salivary glands of live mice.

Floresan Proteinler ifade Canlı Farelerde Görüntüleme hücrealtı Yapıların Intravital Mikroskopi

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Simultaneous Multicolor Imaging of Biological Structures with Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled single molecules within a sample with a spatial resolution of tens of nanometers. Using either photoactivatable (PAFP) or&#160;photoswitchable (PSFP) fluorescent proteins fused to proteins of interest, or organic dyes conjugated to antibodies or other molecules of interest, fluorescence photoactivation localization microscopy (FPALM) can simultaneously image multiple species of molecules within single cells. By using the following approach, populations of large numbers (thousands to hundreds of thousands) of individual molecules are imaged in single cells and localized with a precision of ~10-30 nm. Data obtained can be applied to understanding the nanoscale spatial distributions of multiple protein types within a cell. One primary advantage of this technique is the dramatic increase in spatial resolution: while diffraction limits resolution to ~200-250 nm in conventional light microscopy, FPALM can image length scales more than an order of magnitude smaller. As many biological hypotheses concern the spatial relationships among different biomolecules, the improved resolution of FPALM can provide insight into questions of cellular organization which have previously been inaccessible to conventional fluorescence microscopy. In addition to detailing the methods for sample preparation and data acquisition, we here describe the optical setup for FPALM. One additional consideration for researchers wishing to do super-resolution microscopy is cost: in-house setups are significantly cheaper than most commercially available imaging machines. Limitations of this technique include the need for optimizing the labeling of molecules of interest within cell samples, and the need for post-processing software to visualize results. We here describe the use of PAFP and PSFP expression to image two protein species in fixed cells. Extension of the technique to living cells is also described.

We demonstrate the use of fluorescence photo activation localization microscopy (FPALM) to simultaneously image multiple types of fluorescently labeled molecules&#160;within cells. The techniques described yield the localization of thousands to hundreds of thousands of individual fluorescent labeled proteins, with a precision of tens of nanometers&#160;within single cells.

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled ...

Live Cell Imaging and 3D Analysis of Angiotensin Receptor Type 1a Trafficking in Transfected Human Embryonic Kidney Cells Using Confocal Microscopy

Live-cell imaging is used to simultaneously capture time-lapse images of angiotensin type 1a receptors (AT1aR) and intracellular compartments in transfected human embryonic kidney-293 (HEK) cells following stimulation with angiotensin II (Ang II). HEK cells are transiently transfected with plasmid DNA containing AT1aR tagged with enhanced green fluorescent protein (EGFP). Lysosomes are identified with a red fluorescent dye. Live-cell images are captured on a laser scanning confocal microscope after Ang II stimulation and analyzed by software in three dimensions (3D, voxels) over time. Live-cell imaging enables investigations into receptor trafficking and avoids confounds associated with fixation, and in particular, the loss or artefactual displacement of EGFP-tagged membrane receptors. Thus, as individual cells are tracked through time, the subcellular localization of receptors can be imaged and measured. Images must be acquired sufficiently rapidly to capture rapid vesicle movement. Yet, at faster imaging speeds, the number of photons collected is reduced. Compromises must also be made in the selection of imaging parameters like voxel size in order to gain imaging speed. Significant applications of live-cell imaging are to study protein trafficking, migration, proliferation, cell cycle, apoptosis, autophagy and protein-protein interaction and dynamics, to name but a few.

Here we present a protocol to image cells expressing green fluorescent protein-tagged angiotensin type 1a receptors during endocytosis initiated by angiotensin II treatment. This technique includes labeling lysosomes with a second fluorescent marker, and then utilizing software to analyze the co-localization of receptor and lysosome in three dimensions over time.

Konfokal Mikroskobu kullanılarak Transfekte İnsan Embriyonik Böbrek Hücreleri Canlı Hücre Görüntüleme ve 3D Analiz Angiotensin Reseptör Tip 1a Ticareti