Bu protokol iki proteini ifade eden immünterapötik rhesus T-hücrelerinin üretimini özetler: bir antiviral simerik antijen reseptörü ve lenfoid foliküllere hücreleri hedefleyen bir kemokin reseptörü CXCR5. Bu nispeten hızlı dokuz günlük prosedür hayvanlara infüzyon sonra uzun vadeli kalıcı potansiyeli ile daha az farklılaştırılmış merkezi bellek fenotip ile T hücreleri üretir. Bu yöntemin insan hücrelerine uyarlanması antiretroviral ilaçların uygulanması olmadan HIV için dayanıklı bir remisyon neden potansiyeli ile immünterapötik T-hücrelerinin üretimine izin verecektir.
Bu yöntem, ilgi diğer proteinleri ifade rhesus T-hücreleri üretmek için geniş kullanılabilir. Ve küçük değişikliklerle, insanlar da dahil olmak üzere diğer türlerde transdükse T-hücreleri üretmek için kullanılabilir. Transdüksiyonun başarısı sağlıklı uyarılmış PBMC'lere bağlıdır.
Toplama, taşıma ve depolamaya özen verilmelidir. Transdüksiyondan önce, hücrelerin uyarılmasını görsel olarak değerlendirmek önemlidir. Birincil rhesus PBMC'leri eriterek başlayın.
Hücreleri 37 derecelik bir su banyosunda, sadece küçük bir miktar buz kalana kadar hafif bir ajitasyonla kuluçkaya yatırın. Hücreleri konik bir tüpe yavaşça pipetlendirin. Sonra temel orta bir mililitre ile şişe durulayın ve yavaş yavaş hücrelere ekleyin.
Yavaş yavaş hücrelere sıcak temel orta ek dokuz mililitre ekleyin. Tüpü aerosole dayanıklı teneke kutuya yerleştirin ve 22 santigrat derecede beş dakika boyunca 600 kez g'de santrifüj edin. Supernatant aspire ve büyüme orta küçük bir miktar pelet resuspend.
Hücreleri saymak için, trypan mavi10 mikrolitre hücreleri 10 mikrolitre ekleyin. Hazne slaydını yükleyin ve tezgaha takın. Hücreleri saymak için yakalama düğmesine basın.
Hücre konsantrasyonu hacmi ile çarparak hücre toplam sayısını hesaplamak ve büyüme orta mililitre başına iki milyon hücre seyreltmek. Mililitre başına beş mikrogram son konsantrasyon için anti-CD28 ekleyin. Sonra pipet anti-CD3 kaplı plakalar içine iyi başına üç ila altı milyon hücre.
Plakaları iki gün boyunca 37 santigrat derece ve %5 karbondioksitle kuluçkaya yatırın. Yaklaşık 30 dakika boyunca 2,000 kez g çalıştırarak 32 santigrat dereceye bir santrifüj ısıtın. Bu arada, 37 derece santigrat su banyosu nda hem serumsuz hem de büyüme ortamını ısıtın ve 37 derecelik santigrat su banyosunda hafif bir girdapla virüsü eritin.
O zaman buzun üzerine koy. Virüsü serumsuz ortamda önceden belirlenmiş optimal enfeksiyon çokluğuyla seyreltin. Negatif kontrol hücreleri için tek başına medya kullanarak fibronektin kaplı plaka her kuyuya seyreltilmiş retrovirüs iki mililitre ekleyin.
Plakaları önceden ısıtılmış santrifüje mikroplaka taşıyıcılarına yerleştirin ve 2,000 kez iki saat boyunca santrifüj edin. Hemen kullanıyorsanız, kuyulardan virüs hazırlık aspire ve büyüme orta iki mililitre ekleyin. Ters mikroskop altında uyarılmış PBMC'leri kontrol edin.
Hücreler yuvarlak, parlak olmalı ve ışığı kırmalıdırlar. Onlar da stimülasyon gösteren bir kümelenmiş bir görünüme sahip olmalıdır. Hedef hücreleri toplamak ve 50 mililitrekonik tüp aktarın.
Her iyi bir kez büyüme orta bir mililitre ile durulayın ve tüp ekleyebilirsiniz. Daha sonra hücreleri daha önce gösterildiği gibi sayın. 32 santigrat derecede 5 dakika boyunca 600 kez g santrifüj ederek hücreleri pelet.
Pişme den medya aspire ve mililitre başına 1,5 milyon hücre konsantrasyonu büyüme orta hücreleri resuspend. Her virüs kaplı iyi hücre süspansiyon bir mililitre ekleyin ve virüs almadım fibronektin kaplı kuyulara MAC transduce hücreleri ekleyin. Plakaları 1,000 kez g'de 32 santigrat derecede 10 dakika bekleyin ve 48 saat boyunca 37 santigrat derecede ve %5 karbondioksitle kuluçkaya yatırın.
Rhesus hücreleri ve gama retrovirüsleri ile çalışmak, laboratuvar önlükleri ve eldivenler gibi kişisel koruyucu ekipmanların kullanılmasını gerektirir ve çalışmalar bir biyogüvenlik kabininde yapılmalıdır. Tüm pipetler ve çözeltiler dekontamine edilmelidir. Pipet her kuyunun içeriğini beş mililitrelik pipet ile hücreleri yeniden askıya almak ve 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarmak için yukarı ve aşağı.
Yapışık hücreleri temizlemek için her kuyuya bir mililitre büyüme ortamı ve yukarı ve aşağı pipet ekleyin. Daha sonra hücreleri daha önce açıklandığı gibi sayın. Hücreleri 600 kez g'de 25 santigrat derecede 10 dakika santrifüj edin.
Daha sonra medyayı aspire edin ve genişleme medyasındaki hücreleri mililitre başına bir milyon hücre konsantrasyonuna yeniden askıya alın. Altı kuyulu bir plakanın her bir gaz geçirgen kuyusu içine beş mililitre hücre tohumlayın ve kuyu başına 25 mililitre daha genleşme ortamı nı dikkatlice katlayın. Sonra hücreleri bozulmadan 37 santigrat derecede ve %5 karbondioksitle dört gün boyunca kuluçkaya yatırın.
Kuyulardan hücreleri toplamak için, hücreleri rahatsız etmemeye dikkat eden 20 mililitre lik medyayı çıkarın ve atın. Pipet hücreleri yerinden etmek için yukarı ve aşağı kalan medya. Her kuyuyu üç mililitre medyayla durulamak ve artık hücreleri toplamak için steril bir transfer pipeti kullanın.
Sonra hücre numarası ve canlılık kontrol etmek için onları saymak. Bu protokol, altı farklı hayvandan gelen hücrelerin transdüksiyonu ve genişlemesi için kullanılmıştır. Gaz geçirilebilir kuyular beş milyon hücrenin başlangıç yoğunluğunda tohumlandı ve dört günlük büyümeden sonra, kuyu başına ortalama 55,6 milyon hücrelik bir ortanca yoğunluk elde edildi.
Trypan mavisi dışlama ile izlenen hücrelerin canlılığı protokol boyunca %83-95 oranında korunmuştür. Transekten genlerin birlikte ekspresyonunu gözlemlemek için akış sitometrisi kullanıldı. Beşinci gün, hücrelerin ortancası CD4-MBL CAR ve CXCR5 ile transeneden alındı.
Dokuzuncu günde ise, ortanca ifade tek bir transdüksiyon turu ile %47.6 idi. Akış sitometrisi de bellek fenotip izlemek için kullanılmıştır. Transdüksiyon ve genişlemeden önce naif merkezi bellek ve efektör bellek popülasyonları tanımlanmıştır.
Saf popülasyon kültür ile kayboldu ve hücreler öncelikle merkezi bellek hücreleri gün beş ve gün dokuz tarafından edildi. Transdüksiyondaki başarı, yüksek kaliteli reaktiflerin, yüksek canlı hücrelerin ve titre virüslerin kullanımına ve protokolün zamanlamasını sürekli olarak takip edene bağlıdır. Hücreler göç ve viral baskılama tahlilleri de dahil olmak üzere fonksiyonel tahliller için yanı sıra immünoterapi etkinliğini test etmek için preklinik çalışmalar için hayvanlara infüzyon için kullanılabilir.
Biz hayvanlarda CAR ve CXCR5 T-hücrelerinin preklinik test ile ileriye taşındı ve yakında HIV enfekte bireylerde bu immünoterapi test etmek için umut.
