Ce protocole décrit la production de lymphocytes T immunothérapeutiques rhésus qui expriment deux protéines : un récepteur antigène chimérique antiviral et un récepteur chimiokine CXCR5 qui ciblent les cellules vers les follicules lymphoïdes. Cette procédure relativement rapide de neuf jours produit des T-cells avec le phénotype central moins différencié de mémoire avec le potentiel pour la persistance à long terme après infusion dans les animaux. L’adaptation de cette méthode aux cellules humaines permettra la production de cellules T immunothérapeutiques ayant le potentiel d’induire une rémission durable au VIH sans administration de médicaments antirétroviraux.
Cette méthode peut être largement utilisée pour produire des cellules T rhésus exprimant d’autres protéines d’intérêt. Et avec des modifications mineures, il peut être utilisé pour générer des cellules T transduced chez d’autres espèces, y compris les humains. Le succès de la transduction dépend de PBMCs stimulés en bonne santé.
Il faut veiller à la collecte, au transport et à l’entreposage. Avant la transduction, il est important d’évaluer visuellement la stimulation des cellules. Commencez par décongeler les PBMCs rhésus primaires.
Incuber les cellules dans un bain d’eau de 37 degrés Celsius avec une agitation douce jusqu’à ce qu’il ne reste qu’une petite quantité de glace. Pipette doucement les cellules dans un tube conique. Rincez ensuite le flacon avec un millilitre de milieu de base et ajoutez-le lentement aux cellules.
Ajouter lentement neuf millilitres supplémentaires de milieu de base chaud aux cellules. Placez le tube dans la boîte résistante aux aérosols et centrifugeusez-le à 600 fois g pendant cinq minutes à 22 degrés Celsius. Aspirer le supernatant et résusquer la pastille dans une petite quantité de milieu de croissance.
Pour compter les cellules, ajouter 10 microlitres de cellules à 10 microlitres de bleu trypan. Chargez la glissière de chambre et insérez-la dans le comptoir. Appuyez sur le bouton de capture pour compter les cellules.
Calculer le nombre total de cellules en multipliant la concentration cellulaire par volume et les diluer à deux millions de cellules par millilitre dans le milieu de croissance. Ajouter anti-CD28 pour une concentration finale de cinq microgrammes par millilitre. Puis pipette trois à six millions de cellules par puits dans des plaques enduites anti-CD3.
Incuber les plaques pendant deux jours à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Réchauffez une centrifugeuse à 32 degrés Celsius en la faisant fonctionner à 2000 fois g pendant environ 30 minutes. Pendant ce temps, réchauffer à la fois sans sérum et les médias de croissance dans un bain d’eau de 37 degrés Celsius et décongeler le virus avec tourbillonnant doucement dans un bain d’eau de 37 degrés Celsius.
Ensuite, placez-le sur la glace. Diluer le virus à une multiplicité optimale prédéterminée de l’infection dans le milieu sans sérum. Ajouter deux millilitres du rétrovirus dilué à chaque puits de la plaque enduite de fibronectine en utilisant le seul média pour les cellules de contrôle négatives.
Placez les plaques dans la centrifugeuse préchauffée dans des porteurs de microplaques et centrifugez-les à 2000 fois g pendant deux heures. Si vous utilisez immédiatement, aspirer la préparation du virus à partir des puits et ajouter deux millilitres de milieu de croissance. Vérifiez les PBMCs stimulés au microscope inversé.
Les cellules doivent être rondes, lumineuses, et elles doivent réfracter la lumière. Ils devraient également avoir une apparence agglutinée indiquant la stimulation. Recueillir les cellules cibles et les transférer dans un tube conique de 50 millilitres.
Rincer chaque puits une fois avec un millilitre de milieu de croissance et ajouter cela au tube. Comptez ensuite les cellules comme démontré précédemment. Pelleter les cellules en les centrifugant à 600 fois g pendant cinq minutes à 32 degrés Celsius.
Aspirez le milieu de la pastille et résuspendez les cellules en milieu de croissance à une concentration de 1,5 million de cellules par millilitre. Ajouter un millilitre de suspension cellulaire à chaque puits recouvert de virus et ajouter des cellules transduces MAC aux puits recouverts de fibronectine qui n’ont pas reçu de virus. Centrifugez les plaques à 1000 fois g pendant 10 minutes à 32 degrés Celsius et incubez-les à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant 48 heures.
Le travail avec les cellules rhésus et les rétrovirus gamma nécessite l’utilisation d’équipements de protection individuelle tels que des blouses et des gants de laboratoire et des travaux doivent être effectués dans une armoire de biosécurité. Toutes les pipettes et solutions doivent être décontaminées. Pipette le contenu de chaque puits de haut en bas avec une pipette de cinq millilitres pour résuspendre les cellules et les transférer dans un tube conique de 50 millilitres.
Ajouter un millilitre de milieu de croissance à chaque puits et pipette de haut en bas pour enlever les cellules adhérentes. Comptez ensuite les cellules comme décrit précédemment. Centrifuger les cellules à 600 fois g pendant 10 minutes à 25 degrés Celsius.
Ensuite, aspirez le média et résuspendez les cellules dans les médias d’expansion à une concentration d’un million de cellules par millilitre. Ensemencer cinq millilitres de cellules dans chaque puits perméable au gaz d’une plaque de six puits et superposer soigneusement 25 millilitres supplémentaires de supports d’expansion par puits. Puis incuber les cellules intactes à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant quatre jours.
Pour recueillir les cellules des puits, retirez et jetez 20 millilitres des médias en prenant soin de ne pas déranger les cellules. Pipette le reste des médias de haut en bas pour déloger les cellules. Utilisez une pipette de transfert stérile pour rincer chaque puits avec trois millilitres de médias et recueillir les cellules résiduelles.
Ensuite, comptez-les pour vérifier le numéro de cellule et la viabilité. Ce protocole a été utilisé pour la transduction et l’expansion des cellules de six animaux différents. Des puits perméables au gaz ont été ensemencés à une densité de départ de cinq millions de cellules et après quatre jours de croissance, une densité médiane de 55,6 millions de cellules par puits a été atteinte.
La viabilité des cellules surveillées par exclusion bleue de trypan a été maintenue à 83 à 95% tout au long du protocole. La cytométrie de flux a été utilisée pour observer la co-expression des gènes transduced. Le cinquième jour, une médiane de 42,8% des cellules ont été transduites avec CD4-MBL CAR et CXCR5.
Tandis que le jour neuf, l’expression médiane était 47.6%avec une seule série de transduction. La cytométrie de flux a également été employée pour surveiller le phénotype de mémoire. Avant la transduction et l’expansion, des populations naïves de mémoire centrale et de mémoire effectrice ont été identifiées.
La population naïve a été perdue avec la culture et les cellules étaient principalement des cellules centrales de mémoire par jour cinq et jour neuf. Le succès de la transduction dépend de l’utilisation de reagents de haute qualité, de cellules hautement viables et de virus titrés, ainsi que d’un suivi constant du calendrier du protocole. Les cellules peuvent être utilisées pour des analyses fonctionnelles, y compris des analyses de migration et de suppression virale ainsi que pour l’infusion chez les animaux pour des études précliniques pour tester l’efficacité de l’immunothérapie.
Nous avons avancé avec le dépistage préclinique des cellules T CAR et CXCR5 chez les animaux et espérons tester prochainement cette immunothérapie chez les personnes infectées par le VIH.
