Yani mammosphere kültürleri çalışma ve kanser meme kök hücre davranışlarında normal önemli yönlerini incelemek için kolay erişilebilir bir motor sistem sağlar, kendi kendini yenilemek ve ayırt etmek için yetenekleri de dahil olmak üzere. Kantitatif yaklaşımımız, mamografi kültürlerinin büyüme hızının objektif bir şekilde değerlendirilmesi ve farklı hücre tipleri ve koşullarının doğrudan karşılaştırılmasını amaçlamaktadır. İlk deneme için, ben sindirim üzerinde önlemek ve her kaplama önce doğru bir hücre sayımı sağlamak için kuluçka süreleri üzerinde sıkı bir kontrol tutmak tavsiye ederiz.
Charolaise Bull'la prosedürü göstermek Errico D'Elia olacak, laboratuvarımdan bir teknisyen. 5 ila 30 dört karın ve alt torasik mammory bezleri hasat sonra, 8 ila 10 haftalık dişi fareler, DPBS en az hacimli 100 milimetre petri çanak başına 20 bezleri kadar yerleştirin. Küçük parçalar halinde dokuları kıyma ve parçalara sindirim ortamı 10 mililitre ekleyin.
Doku parçalarını 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarmak için 25 mililitrelik serolojik pipet kullanın ve tüpü parafin filmle kapatın. Daha sonra 0.03 X G'de bir rotator üzerindeki parçaları 37 derecede 2,5 saat ve nem oranı %5 karbondioksitle 2,03 X G'de kuluçkaya yatırın. Kuluçka sonunda, tüm parçalar P1000 pipet ucundan geçirilebiliyorsa, doku bulamacını santrifüj le tortulayabilir ve süpernatantı dikkatlice dekant.
PBS'nin 3 mililitrelik peletini yeniden askıya alın ve tüp içeriğini bir 100, 170, 140 mikrometrelik hücre süzgecinden yeni bir konik tüpe sırayla süzün ve her süzgeç her filtreden sonra 2 mililitre taze DPBS ile yıkın. Pelet santrifüj ile hücreleri ve supernatant kalan DPBS hücreleri askıya decant. Hücreleri eşit hacimde amonyum klorür potasyum lisis tamponu ile karıştırın ve kırmızı kan hücrelerini 5 dakikaya kadar buz üzerinde karıştırın.
Kuluçka sonunda, DPBS 10 mililitre ile lysis tutuklama ve santrifüj ile hücreleri toplamak. Beyaz bir pelet varlığını onaylayın ve geri sayım için mammosphere orta 1 ila 5 mililitre pelet askıya. Daha sonra hücreleri doku kültürü yle tedavi edilmeyen ultra düşük yapışma altı kuyu plakasına, 37 santigrat derecede 7 ila 10 günlük kuluçka için mililitre başına 5 ila 5 canlı hücreye yerleştirin.
7 ila 10 günlük kültürün sonunda, hücre kültürü plakaher kuyudan birincil mammospheres toplamak ve cetrifugation ile mammospheres tortu. Süpernatant'ı dekantettikten sonra, mammospheres'i yaklaşık 100 kez pipetlemek için filtreli uçlu bir P200 pipet kullanın. Tek hücreli hastaların üretimi, yeni lability için mammosphere hücrenin doğru nicelik için kritik öneme sahiptir.
Ayırmanın kapsamını görsel olarak inceleyin ve gerekirse hücre süzgecikullanın. Re sayma için taze mammosphere orta 1 ila 5 mililitre ile ilgisiz mammospheres askıya ve plaka 2 X 10 polihema kaplı ultra düşük yapışma altı iyi plakalar üzerinde mililitre başına dördüncü canlı hücrelere 5-7 günlük bir kültür için. Sonra, 5 ila 7 gün sonra, iyi başına küre sayısını saymak.
Her pasajın sonunda, küreleri görüntülemek için tüm kuyuların tüm yüzeyini tetmek için stereoskop üzerine monte edilmiş bir dijital kamera kullanın. Görüntüleri tif dosyaları olarak kaydettikten sonra, stereoskop görüntülerini görüntü dizisi olarak ImageJ'e aktarın ve ölçeği ve görüntü türünü 8 bit olarak ayarlayın. Görüntü yığınını çoğaltın ve İşlem sekmesinden Arka Planı Çıkar'ı seçin.
Işık arka planı ve Kayan paraboloid seçeneklerini kontrol edin ve yığının tüm görüntülerini işlemek için Tamam'ı tıklatın. Resim sekmesinden Ayarla ve Eşik'i seçin ve Uygula'yı tıklatın. Açılır pencere görüntülenir.
Yöntem olarak Varsayılan'ı ve Arka Plan olarak Işık'ı seçin. Her görüntü kutusu için Hesapla eşleğini işaretleyin ve Tamam'ı tıklatın. Yığındaki tüm görüntüleri işlemek için Havza'yı seçin ve Evet'i tıklatın. Aç'ı seçin ve Evet'i tıklatın ve Erode'u seçin ve Evet'i tıklatın.
Ardından, Analiz menüsünden Parçacıkları Analiz Et'i seçin ve minimum boyut eşiğini 10,000 mikrometre kare ve Daireselliği 0,50 ile 1,00 arasında ayarlayın. Açılan menüden Elips seçeneğini seçin ve Özetle, kenarlarda hariç tut ve yerinde Göster'i işaretleyin. Ardından yığının tüm görüntülerini işlemek için Tamam'ı tıklatın.
Her geçiş için kümülatif büyüme eğrisini hesaplamak için, kaplamalı hücre sayısını ve küreler halinde sayılan hücre sayısını kaydedin ve her pasajın sonundaki küre boyutunu hesaplayın. Bir önceki pasajın sonunda hesaplanan küre boyutuna her geçiş için kaplanmış hücre sayısını bölerek, kaplama kürelerin sayısını çıkar. Her bir kuyu nun başına düşen kümülatif hücre numarasını ve her bir kuyu için her bir kuyu için kümülatif küre numarasını hesaplayın ve veri noktalarını yarı logaritmik ölçekte çizin.
Sonra veri noktalarına bir üstel eğilim satırı ve uyum iyiliğini ölçmek için kararlılık katsayısını hesaplamak. Daha sonra kültürün büyüme hızını çıkarmak için doğal bir üstel fonksiyon olarak eğilim çizgisinin denklemini tasvir. Bu deneyde, üç bağımsız deney için ardışık beş pasajın küre ve hücre sayıları belirlendi.
Burada kümülatif hücre ve geçiş başına küre numaraları gösterilir. Myc aktivasyonu gözlendiği gibi, artan küre ve hücre büyüme oranları yol açar. Hücre farklılaşmasını, göçlerini ve invazyonunu değerlendirmek için hücre toplama veya gen ekspresyonu analizi veya diğer fonksiyonel varlıkları gerçekleştirmek için biyolojik ve ilgili zaman noktaları seçilebilir.
Bu, birden çok uygulama ile basit ve uygun maliyetli bir yaklaşımdır. Örneğin, kanser kök hücre çoğalması ve kendini yenileme üzerindeki etkilerini ölçmek için doğrudan keşif kullanılabilir.
