따라서 유방 구체 배양은 암 유방암 줄기 세포 행동에서 정상의 중요한 측면을 연구하고 해부하기 쉬운 접근 하기 쉬운 운동 시스템을 제공하며, 이는 자가 갱신및 분화 능력을 포함합니다. 우리의 정량적 접근법은 다른 세포 유형과 조건을 직접 비교할 수 있도록 객관적인 방식으로 매머스피어 배양의 증가 속도의 평가를 목표로 합니다. 첫 번째 예심을 위해, 나는 소화를 피하고 각 도금 전에 정확한 세포 수를 보장하기 위하여 잠복기 시간을 엄격하게 통제하는 것을 조언할 것입니다.
샤롤라이스 불과 함께 절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 기술자인 에리코 델리아(Errico D'Elia)가 될 것입니다. 5에서 30, 8 에서 10 주 된 암컷 마우스의 4 개의 복부 및 하부 흉막 유방 땀샘을 수확 한 후, DPBS의 최소 부피로 100 밀리미터 페트리 접시 당 최대 20 땀샘을 배치합니다. 조직을 작은 조각으로 다진 다음 10 밀리리터의 소화 매체를 조각에 추가합니다.
25 밀리리터 세로지컬 파이펫을 사용하여 조직 조각을 50 밀리리터 원내 튜브로 옮기고 파라핀 필름으로 튜브를 밀봉하십시오. 그런 다음 회전기의 조각을 0.03 X G에서 37도에서 2 1/2 시간 동안 배양하고 습도가있는 이산화탄소5 %를 배양합니다. 인큐베이션의 끝에서, 모든 파편이 P1000 파이펫 팁을 통과 할 수 있다면, 원심 분리에 의해 조직 슬러리를 퇴적시키고 신중하게 상체를 디포산한다.
PBS의 3 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단하고 100, 170, 140 마이크로미터 셀 스트레이너를 통해 튜브 내용을 순차적으로 새로운 원뿔 튜브로 필터링하고 각 필터 후 2 밀리리터의 신선한 DPBS로 각 여과기를 세척합니다. 펠릿은 원심분리에 의해 세포를 환원하고 나머지 DPBS에서 세포를 중단하는 상피 재를 데칭한다. 세포를 동일한 양의 염화 칼륨 분해 버퍼와 혼합하고 얼음에 적혈구를 최대 5 분 동안 리세우하십시오.
인큐베이션의 끝에서, DPBS의 10 밀리리터로 용액을 체포하고 원심분리에 의해 세포를 수집합니다. 흰색 펠릿의 존재를 확인하고 계산을위한 매머 스피어 배지의 1 ~ 5 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단합니다. 그런 다음 세포를 비조직 배양처리초저접착 6개 웰 플레이트에 2 x 10의 매머스피어 배지 농도당 5번째 생존 세포에 37°C에서 7~10일 배양하고 이산화탄소 5%로 플레이트한다.
7 일에서 10 일 문화의 끝에서, 세포 배양 판의 각 우물에서 1 차 적인 매머스피어를 수집하고 퇴적하여 cetrifugation에 의해 매머스피어를 수집합니다. 상체를 탈포한 후, 여과된 팁이 있는 P200 파이펫을 사용하여 매머스피어를 약 100번 피펫합니다. 단일 세포 환자의 생성은 새로운 lability를 위한 유방 구체 세포의 정확한 정량화를 위해 중요합니다.
분리 의 정도를 육안으로 검사하고 필요한 경우 셀 스트레이너를 사용합니다. 다시 5~7일 배양에 대해 매우 낮은 접착 6개 웰 플레이트를 코팅한 폴리헤마에 밀리리터당 4번째 생존 셀에 2 X 10을 계산하고 플레이트 2 X 10에 신선한 매머스피어 배지의 1~5밀리리터로 분리된 유방스피어를 다시 중단한다. 그런 다음 5~7일 후에는 잘 구체 수를 계산합니다.
각 통로의 끝에서, 스테레오스코프에 장착 된 디지털 카메라를 사용하여 구체를 이미지하기 위해 모든 우물의 전체 표면을 스캔합니다. 이미지를 tif 파일로 저장한 후 입체 이미지를 ImageJ로 가져오고 이미지의 배율과 이미지 유형을 8비트로 설정합니다. 이미지 스택을 복제하고 프로세스 탭에서 배경을 빼는 것을 선택합니다.
라이트 배경 및 슬라이딩 포물선 옵션을 확인하고 확인을 클릭하여 스택의 모든 이미지를 처리합니다. 이미지 탭에서 조정 및 임계값을 선택하고 적용을 클릭합니다. 팝업 창이 나타납니다.
기본값을 메서드 및 라이트로 선택합니다. 각 이미지 상자에 대한 계산 임계값을 확인하고 확인을 클릭합니다. 스택의 모든 이미지를 처리하려면 유역을 선택하고 예(예)를 클릭합니다. 열기를 선택하고 예(예)를 클릭하고 침식을 선택하고 예(예)를 클릭합니다.
다음으로 분석 메뉴에서 입자 분석을 선택하고 최소 크기 임계값을 10, 000 마이크로미터 제곱 및 0.50~1.00 사이의 원형으로 설정합니다. 드롭다운 메뉴 에서 옵션 타원을 선택하고 요약을 확인하고 가장자리에서 제외하고 내부 표시에서 확인합니다. 그런 다음 확인을 클릭하여 스택의 모든 이미지를 처리합니다.
각 통로에 대한 누적 성장 곡선을 계산하려면 도금된 셀의 수와 구체 수에 대해 잘 계산하고 각 통로의 끝에 구 크기를 계산한다. 도금구의 수를 추론하여, 이전 구절의 끝에 계산된 구 크기로 각 통로에 대해 도금된 세포의 수를 분할한다. 통로당 각 웰의 누적 셀 수와 통로당 각 웰의 누적 구 수를 계산하고 반 로고리셈치 척도로 데이터 점을 플롯합니다.
그런 다음 데이터 포인트에 대한 지수 추세선을 계산하고 적합성의 장점을 측정하기 위한 결정계수를 계산합니다. 그런 다음 배변의 성장률을 추론하는 자연스러운 지수 함수로 추세선의 방정식을 묘사한다. 본 실험에서, 5개의 연속된 구절의 구및 세포 수, 3개의 독립적인 실험을 위해 결정되었다.
여기서 는 통로당 누적 셀 및 구 번호가 표시됩니다. 관찰 된 Myc 활성화로, 증가 된 구체와 세포 성장 속도로 이어질. 생물학적 및 관련 시간점은 세포 수집을 위해 또는 세포 분화, 마이그레이션 및 침입을 평가하기 위해 유전자 발현 분석 또는 기타 기능적 자산을 수행하기 위해 선택될 수 있다.
이는 여러 응용 프로그램을 통해 간단하고 비용 효율적인 방법입니다. 예를 들어, 암 줄기 세포 증식 및 자기 재생에 미치는 영향을 측정하기 위해 직접 발견에 사용될 수 있다.
