Culturable model organizmaların durumu çalışmanın birçok alanında ilerleme için temel olmuştur. Bu protokol, bildiğimiz kadarıyla, Doliolids'i kültüre almak için tek yaklaşımdır. Güvenilir Doliolid kültür teknolojisi, okyanusun en üretken bölgelerinden bazıları için önemli olan ve omurgalıların ilk evrimsel atalarını temsil eden organizmaları incelemek için benzersiz bir deneysel model sunar.
Bu teknik, alg gıda parçacıklarını ve organizmaları doğada deneyim olarak kabın duvarlarıyla temas etmeden su sütununda asılı tuttuğu için benzersizdir. Bu kültür yöntemi diğer küçük jelatinli ve kabuklu veya plankton türlerinin kültüre uygulanabilir. Doliolids karmaşık bir yaşam döngüsüne sahip olduğundan, anlayış ve her yaşam aşamasının ihtiyaçlarını tanıma önemlidir.
Yaşam döngüsünü öğrenmek ve onları nasıl tanıyıp idare edebilmek çok pratik gerektirir. Deneyimlerimize göre, bu kültür tekniğini öğrenmenin tek yolu onu görmek ve yapmaktır. Erin Arneson, Nicholas Castalaine, Natalia Lopez, Lauren Lamboye, Briana Pierce, Arya Rodriguez-Santiago ve Terrell Scarborough gibi birçok proje katılımcısı da bu videoda kısa bir süre yer aldı.
Laboratuvarda Doliolid kültürleri oluşturmadan ve yetiştirmeden önce, 1.9 ve 3.8 litrelik cam kültür kavanozlarını sodyum hidroksit potasyum permanganat çözeltisi içine batırarak temizleyip sterilize edin. Kavanozlar bir gecede Emmek için izin verin. Sonra sodyum bisülfit çözeltisi içine kavanoz aktarın.
Kavanozlar bir gecede Emmek için izin verin. Daha sonra kavanozları deiyonize suyla iyice durulayın. Kavanozların kurumasını bekleyin.
Stok kültürlerini korumak için, titiz axenic kültür teknikleri kullanın. Her iki haftada bir, steril 55 mililitrecam kültür tüplerinde 25 mililitre taze büyüme ortamına 0,5 mililitre eski yılsal kültür aktarımı. Doliolidlerin beslenmesi için daha büyük miktarlarda fitoplankton hazırlamak için, axenik stoklardan dört mililitre fitoplankton'u 200 mililitrelik büyüme ortamı içeren 500 mililitrelik plastik doku kültürü şişelerine aktarArak 1 ila 50 seyreltme de aşılamak için aktarın.
Bir çevre kuluçka veya walk-in çevre odasında 20 santigrat bir 12 ila 12 saat açık-koyu döngüsü ile serin beyaz ışık aydınlatma altında 65-85 microEinsteins metrekare başına kültür kuluçka. Aydınlatmayı en üst düzeye çıkarmak için düz kültür şişeleri lay. Kültürü her gün nazikçe döndürün.
Denize doğru yola çık. Kıta sahanlığı üzerinde Doliolids bulmak için, su sıcaklığı, tuzluluk ve klorofil A floresan profilleme tarafından Doliolids varlığına elverişli su koşulları belirlemek için oşinografik cihaz CTD dağıtmak. Özel plankton ağları ile keşif net tows yaparak su koşullarını onaylayın.
Alternatif olarak, Doliolids tespit etmek için bir in situ profilleme görüntüleme sistemi kullanın. Şimdi CTD almak için vinç çalıştırın. CTD rozetine monte edilen Niskin şişeleri, Doliolidlerin bulunduğu bölgeden ve klorofilin en yüksek tahminlerini içeren derinlikten deniz suyu toplanmıştır.
Deniz suyu ile üç 22 litrelik kova durulayın ve biraz daha fazla yarım dolu deniz suyu ile doldurun. Net morina ucunu deniz suyuyla tamamen doldurun ve morina ucunu ağa takın. Ağı dağıtın.
15 ila 25 derece lik eğik çekme açısını ve dakikada 15 metreden fazla olmayan dikey dağıtım ve alma hızını koruyarak, su sütunu üzerinden ağı düşürün ve yükseltin. Net gemiye hafifçe aktarın ve her siteden toplanan yüzey deniz suyu içeren plastik kovalar içine morina ucu içeriğini bölmek. Geniş delikli cam pipet kullanarak, dikey ve yatay hareketler kullanarak kabın içeriğini pipetle hafifçe karıştırın.
İşaret parmağını kullanarak, Doliolidleri yakalamak ve aktarmak için kılcal emme oluşturun. Doliolidleri kabın içinde karışık fitoplankton'dan yakalayın. Doliolids eklenmesinden sonra, mililitre başına dördüncü hücrelere yaklaşık beş kez 10 üçüncü 10 son konsantrasyona kavanoza Rhodomonas kültürünü ekleyin.
Doliolids sindirim sisteminin rengini kontrol edin. Kırmızı renk Doliolids aktif beslenen belirler. Doliolidlerin hava-su arabiriminde mahsur kalmalarını önlemek için, kafa boşluğundan kaçınmak için kavanozları filtrelenmemiş, parçacık açısından zengin deniz suyuyla doldurun.
Kavanozun üzerine bir parça plastik sargı yerleştirin. Aynı zamanda hayvanlara zarar verebilir hava kabarcıkları oluşturmaktan kaçının. Kapağı kavanoza dikkatlice vidalayın ve kabarcıkların mevcut olup olmadığını belirlemek için kavanozu hafifçe ters çevirin.
Kabarcıklar varsa, onları kaldırmak için daha fazla deniz suyu doldurun. Kavanozlar doldurulduktan sonra kapakla tekrar kapatın ve fazla suyu kavanozun dışından silin. Her kavanozu, kavanozu kauçuk borularla kaplı dikey metal çubuklara ve paslanmaz çelik hortum kelepçesinin arasına yerleştirerek plankton tekerleğine monte edin.
Kavanozun arka sının kauçuk boruya karşı yastıklı olduğundan emin olun. Kavanozun etrafındaki hortum kelepçesini sıkmak için vidayı ayarlayın. Doliolidleri süspansiyonda tutmak için kavanozların 0.3 rpm'de dönmesine izin verin.
Laboratuvar koşullarına üç gün uyum sonra kavanozdan bir örnek kabına kültür suyu 100 ila 150 mililitre aktarın ve bir Coulter sayacı kullanarak yosun konsantrasyonu ölçmek. Alg konsantrasyonu tahminine dayanarak, litre başına karbon 40 ila 95 mikrogram kültür kavanozundaki konsantrasyonu getirmek için yeterli yosun ekleyin. Doliolidler kültürlere ne sıklıkta ve ne kadar yosun eklemek için karar rehberlik etmek için beslenen sonra alg konsantrasyonları izlemek için parçacık sayacı kullanın.
Litre başına karbon 40 ila 95 mikrogram arasında kültür kavanozlarında fitoplankton konsantrasyonları koruyun. Doliolids Culturing onların karmaşık yaşam döngüsü boyunca onları desteklemeyi gerektirir. Larvalar, oozooidler ve erken hemşireler geliştiriyoruz.
Hemşirenin kataptosunda en az sekiz trophozooid görülebildiğinde en az dört hemşireyi yeni bir külleyici kavanoza aktarın. Phorozooidler üç milimetre boyutuna ulaştıktan sonra kavanozdaki hayvan sayısını azaltın. Phorozooidler beş milimetreden daha büyük hale geldiklerinde ve gonozooid kümeleri geliştirdiklerinde dört phorozooid hariç tüm phorozooidleri temizlerler.
Bu protokol, Dolioletta gegenbauri toplama ve yetiştirme yaklaşımına genel bir bakış sağlar. Algal temizleme oranları litre başına 20 ila 60 mikrogram karbon konsantrasyonlarında benzerdi ve gıda konsantrasyonları arttıkça azaldı. Temizleme oranları D.gegenbauri büyümesini destekleyen sıcaklık aralıkları üzerinde orantılı olarak artmıştır.
Sıcaklık ve gıda kullanılabilirliğinin bir fonksiyonu olarak günde 0,1 ile 0,7 milimetre arasında değişen büyüme oranları gözlendi. Doliolidlerin yetiştirilmesi okyanus koşullarının başarılı bir şekilde çoğaltılması ve karmaşık yaşam döngüleri boyunca hayvanların ihtiyaçlarının karşılanmasına bağlıdır. Sonuç olarak, hayvanların yakalanması, izole edilmesi ve yetiştiriciliği sırasında nazik çehreleri gereklidir.
Gıda konsantrasyonları sık sık izlenmeli ve ayarlanmalıdır. Bu özellikle gelişmekte olan larvalar ve oozooid yaşam evreleri sırasında doğrudur. Bu yöntem özellikle deniz gıda ağın tabanında küçük zooplankton türlerinin yetiştirilmesi için tasarlanmıştır.
Bu yöntem örneğin iklim değişikliğine zooplankton tepkilerini araştırmak için değerli olacaktır. Bu teknik, geliştirilmesinden bu yana zooplankton ekolojistlerinin Doliolidlerin laboratuvar bazlı beslenme, büyüme ve üreme oranlarını belirlemelerinin önünü açmıştır. Ayrıca bu yöntem doğada Doliolid diyet devrimci moleküler tabanlı araştırmalar için önünü açtı.
Cam temizleme protokolünün solunum tahriş edici reaktifleri içerdiğini ve iyi havalandırılan alanlarda kullanılması gerektiğini hatırlatmak isterim. Denizde çalışmak da tehlikeli olabilir, bu nedenle gemi güvenlik kurallarına uyun.
