كان توافر الكائنات الحية النموذجية القابلة للاستزراع أساسيًا للتقدم في العديد من مجالات الدراسة. هذا البروتوكول، على حد علمنا، هو النهج الوحيد المتاح لمعالجة Doliolids. توفر تكنولوجيا زراعة Doliolid الموثوقة نموذجًا تجريبيًا فريدًا لدراسة الكائنات الحية المهمة لبعض أكثر المناطق إنتاجية في المحيط التي تمثل أقدم أسلاف التطور من الفقاريات.
هذه التقنية هي فريدة من نوعها لأنها تحافظ على جزيئات الغذاء الطحالب والكائنات العالقة في عمود الماء دون ملامسة جدران الحاوية لأنها تجربة في الطبيعة. ويمكن تطبيق طريقة الاستزراع هذه على زراعة أنواع أخرى من الجيلاتين والقشريات الصغيرة أو الألواح. لأن Doliolids لديها دورة حياة معقدة ، وفهم والاعتراف باحتياجات كل مرحلة من مراحل الحياة أمر بالغ الأهمية.
تعلم دورة الحياة وكيفية التعرف عليها والتعامل معها يتطلب الكثير من الممارسة. في تجربتنا، الطريقة الوحيدة لتعلم هذه التقنية زراعة هو أن نرى ذلك ونفعل ذلك. كما ظهر في هذا الفيديو أيضاً العديد من المشاركين الآخرين في المشروع، بما في ذلك إيرين أرنيسون، ونيكولاس كاستالين، وناتاليا لوبيز، ولورين لامبوي، وبريانا بيرس، وآريا رودريغيز- سانتياغو، وتيريل سكاربورو.
قبل إنشاء وتربية الثقافات Doliolid في المختبر، وتنظيف وتعقيم 1.9 و 3.8 لتر الزجاج الجرار ثقافة من خلال غمرها في محلول برمنغنات البوتاسيوم هيدروكسيد الصوديوم. السماح للجرانات لنقع بين عشية وضحاها. ثم نقل الجرار إلى محلول بيسلفيت الصوديوم.
السماح للجرانات لنقع بين عشية وضحاها. المقبل شطف الجرار جيدا مع المياه الأيونية. السماح للجرانات لتجف.
للحفاظ على الثقافات الأسهم، واستخدام تقنيات ثقافة axenic صارمة. كل أسبوعين نقل 0.5 ملليلتر من الثقافة القديمة سنسينت إلى 25 ملليلتر من وسائل الإعلام نمو جديدة في أنابيب الثقافة الزجاجية 55 ملليلتر معقمة. لإعداد كميات أكبر من العوالق النباتية لتغذية Doliolids، نقل أربعة ملليلترات من العوالق النباتية من مخزونات أكسينيك إلى 500 ملليلتر قارورة زراعة الأنسجة البلاستيكية التي تحتوي على 200 ملليلتر من وسائل الإعلام النمو لتلقح في واحد إلى 50 تخفيف.
احتضان الثقافة في حاضنة بيئية أو غرفة بيئية في 20 درجة مئوية مع دورة 12 إلى 12 ساعة ضوء الظلام تحت إضاءة باردة من الضوء الأبيض 65 إلى 85 microEinsteins لكل متر مربع. وضع قارورة الثقافة شقة لتعظيم الإضاءة. دوامة بلطف الثقافة يوميا.
توجه إلى البحر. لتحديد موقع دولوليد على الجرف القاري، نشر أداة أوقيانوغرافية لمكافحة المخدرات لتحديد الظروف المائية التي تساعد على وجود دولوليدس عن طريق تحديد درجة حرارة المياه والملوحة والفلوروفيرل ألف. تأكيد ظروف المياه عن طريق إجراء سحبات الشباك الاستكشافية باستخدام شبكات ألواح ية متخصصة.
بدلاً من ذلك، استخدم نظام تصوير تحديد الموقع للكشف عن Doliolids. الآن تشغيل ونش لاسترداد CTD. جمعت زجاجات نيسكين المثبتة على وردة CTD مياه البحر من الموقع الذي تقع فيه دولوليدس وعلى العمق الذي يحتوي على أعلى تقديرات الكلوروفيرل.
شطف ثلاثة دلاء 22 لتر مع مياه البحر وملء مع مياه البحر إلى ما يزيد قليلا عن نصف كامل. ملء صافي سمك القد نهاية تماما مع مياه البحر ونرفق نهاية سمك القد إلى الشبكة. نشر الشبكة.
خفض ورفع الشبكة من خلال عمود المياه، والحفاظ على زاوية سحب مائل من 15 إلى 25 درجة وسرعة النشر والاسترجاع العمودي لا تزيد عن 15 مترا في الدقيقة. مرة واحدة على الشبكة هو على متن نقل بلطف وتقسيم محتويات نهاية سمك القد في الدلاء البلاستيكية كل تحتوي على مياه البحر السطحية التي تم جمعها من الموقع. باستخدام ماصة زجاجية واسعة تتحمل بلطف خلط محتويات الكأس مع ماصة باستخدام حركات عمودية وأفقية.
باستخدام السبابة، قم بإنشاء شفط شعري لالتقاط ونقل Doliolids. القبض على Doliolids من العوالق النباتية المختلطة في الكوابر. بعد إضافة Doliolids، إضافة ثقافة Rhodomonas في جرة إلى تركيز النهائي من حوالي خمس مرات 10 إلى 10 إلى الثلث إلى الخلايا الرابعة لكل ملليلتر.
تحقق من لون الجهاز الهضمي من Doliolids. يحدد اللون الأحمر أن الـ Doliolids تتغذى بنشاط. لمنع Doliolids من الوقوع في الواجهة الهوائية والمياه، ملء تماما الجرار مع غير المصفاة، ومياه البحر الغنية بالجسيمات لتجنب مساحة الرأس.
ضع قطعة من البلاستيك التفاف على فتحة جرة. تجنب خلق فقاعات الهواء التي يمكن أن تلحق الضرر أيضا الحيوانات. المسمار بعناية الغطاء على جرة وعكس بلطف جرة لتحديد ما إذا كانت فقاعات موجودة.
إذا كانت الفقاعات موجودة، قم بملء المزيد من مياه البحر لإزالتها. بعد أن يتم تعبئة الجرار reseal مع الغطاء ومسح المياه الزائدة من خارج جرة. جبل كل جرة على عجلة الدولاب عن طريق وضع جرة على القضبان المعدنية العمودية مغطاة أنابيب المطاط وبين خرطوم الفولاذ المقاوم للصدأ المشبك.
تأكد من أن الجزء الخلفي من جرة خففت ضد أنابيب المطاط. ضبط المسمار لتشد من خرطوم المشبك حول جرة. السماح للجران لتدوير في 0.3 دورة في الدقيقة للحفاظ على Doliolids في التعليق.
بعد ثلاثة أيام من التراكم لظروف المختبر نقل 100 إلى 150 ملليلتر من المياه الزرع من جرة إلى حاوية عينة وقياس تركيز الطحالب باستخدام عداد كولتر. بناء على تقدير تركيز الطحالب، إضافة الطحالب كافية لتحقيق التركيز في جرة الثقافة إلى 40 إلى 95 ميكروغرام من الكربون للتر الواحد. استخدام مضادة الجسيمات لرصد تركيزات الطحالب بعد Doliolids تم تغذية لتوجيه قرار مدى تواتر ومقدار الطحالب لإضافة إلى الثقافات.
الحفاظ على تركيزات العوالق النباتية في الجرار الثقافة بين 40 إلى 95 ميكروغرام من الكربون للتر الواحد. يتطلب زراعة Doliolids دعمهم من خلال دورة حياتهم المعقدة. تطوير اليرقات والبويضات والممرضات الأوائل.
مرة واحدة على الأقل من ثمانية trophozooids مرئية على cataphor الممرضة، ونقل ما لا يقل عن أربع ممرضات في جرة زراعة جديدة. مرة واحدة في phorozooids تصل إلى ثلاثة ملليمترات في الحجم ، والحد من عدد الحيوانات في جرة. عندما تصبح الفوروزويد أكبر من خمسة ملليمترات وقد وضعت مجموعات gonozooid إزالة جميع ما عدا أربعة phorozooids.
يقدم هذا البروتوكول لمحة عامة عن نهج جمع زراعة Dolioletta gegenbauri. وكانت معدلات إزالة الطحالب متشابهة بتركيزات تتراوح بين 20 و60 ميكروغراماً من الكربون لكل لتر، وانخفضت مع زيادة التركيزات الغذائية. وزادت معدلات إزالة الألغام زيادة تناسبية على نطاقات درجات الحرارة الداعمة لنمو D.gegenbauri.
ولوحظت معدلات نمو تتراوح بين 0.1 و 0.7 ملليمتر يومياً كدالة على درجة الحرارة وتوافر الأغذية. تعتمد زراعة دولوليد على النجاح في تكرار الظروف المحيطية واستيعاب احتياجات الحيوانات طوال دورة حياتها المعقدة. وبالتالي ، فإن التعامل اللطيف مع الحيوانات أثناء القبض عليها وعزلها وتربيةها مطلوب.
ويجب رصد التركيزات الغذائية بصورة متكررة وتعديلها. وهذا صحيح بشكل خاص خلال مراحل اليرقات النامية والحياة اللوئيدة. وقد صممت هذه الطريقة خصيصا لتربية أنواع العوالق الحيوانية الصغيرة في قاعدة الشبكة الغذائية البحرية.
وستكون هذه الطريقة مفيدة، على سبيل المثال، في دراسة الاستجابات المتعلقة بالألواح الحيوانية لتغير المناخ. ومنذ تطورها، مهدت هذه التقنية الطريق أمام علماء البيئة في العوالق الحيوانية لتحديد معدلات التغذية والنمو والتكاثر في المختبرات في دوليوليدس. بالإضافة إلى ذلك، مهدت هذه الطريقة الطريق لتحقيقات ثورية جزيئية لنظام دوليوليد الغذائي في الطبيعة.
وأود أن أذكركم بأن بروتوكول تنظيف الزجاج ينطوي على الكواشف التي هي مهيجات الجهاز التنفسي وينبغي استخدامها في المناطق ذات التهوية. يمكن أن يكون العمل في البحر أيضا خطرة لذلك اتبع قواعد سلامة السفينة.
