Mikroenjeksiyon ile 3Boyutlu Doku Kaynaklı İnsan Organoid Kültür Sistemlerinde Cryptosporidium Enfeksiyonunun İncelanması

Bu sporozoit arınma ve mikroenjeksiyon prosedürü kullanılarak, aslında herhangi bir konak mikrop herhangi bir doku kaynaklı organ sisteminde incelenebilir. Bu tekniği kullanarak, organoid lümen veya organoid apikal tarafına enjekte saf sporozoitlerin miktarını kontrol edebilirsiniz. C.parvum sporozoitleri arındırmak için ookisti 15 mililitrelik bir tüpe aktarın ve mililitre ekssifotik orta konsantrasyonbaşına yedinci ookistiçin bir kere 10'da hücreleri yeniden askıya alın.

37 santigrat derecede 60 ila 90 dakika sonra, ookistlerle uygun bir yıkama çözeltisinin 14 mililitresini karıştırın ve hücreleri santrifüj le çökün. Ookistlerin kaybolmasını önlemek için süpernatant'ı dikkatlice aspire edin ve sporozoik peleti üç kez 10 ile dmem konsantrasyonunun bir ila iki mililitresi başına yedinci ookist arasında yeniden askıya alın. Kalan ookistleri ve kabukları çıkarmak için, üç mikrometre lik gözenek boyutunda polikarbonat filtre ile donatılmış 47 mililitrelik filtre tutucu aparatı ile donatılmış 10 mililitrelik şırınga varilini dört derece santigrat derecede 15 mililitrelik bir tüpe yerleştirin.

Filtre montajına 7,5 mililitre sporozoit süspansiyon ekleyin. Tüm hacim ağırlık tarafından süzgeç geçti, dMEM başka bir 7.5 mililitre ile süzgeç aracılığıyla kalan hücreleri yıkayın. Tüm yıkama süzgeç geçti, 10 dakika santrifüj ile filtrelenmiş sporozoit süspansiyon toplamak ve uygun bir organoid kültür ortamı 50 ila 100 mikrolitre pelet etiket, ile takviye 0.05% hızlı yeşil boya, ve L-glutatyon, betain, L-sistein, linoleik asit, ve taurin içeren tampon azaltıcı içerir.

Parazitleri 3Boyutlu organoidin apikal tarafına mikroenjekte etmek için, önce cam enjeksiyon kılcal damarları hazırlamak için bir mikropipet çekmecekullanın. Eğer doğrudan ookistler enjekte etmeyi seçerseniz, sporozoitler veya oocysts kolay bir akış sağlamak için dokuz ila 12 mikrometre çapı na kılcal damar ucu kesmek için forceps kullanın ve oocyst veya sporozoit süspansiyon etiketli hızlı yeşil boya ile her kılcal doldurmak için mikro yükleyici ipuçları kullanın. Daha sonra, ilk sporozoit dolu kılcal damarı bir mikroenjektöre yükleyin ve her organoide süspansiyonun 100 ila 200 nanolitresini mikroenjekte etmek için 5 x büyütme ve sabit bir basınçla ters bir mikroskop kullanın.

Ekssestasyon protokolü, ookistlerin yaklaşık %70-80'inden sporozoitlerin salınımını sağlar. Bu nedenle, kalan ookist kabukları üç mikrometre filtrasyon yoluyla filtre etmek esastır. Ekskissiz ookistlerin neredeyse %100'ünü çıkarın.

Ayrıca, yeşil bir boya eklenmesi tüm organoidlerin enjeksiyonu sağlamaya yardımcı olur, ve enjeksiyondan sonra en az 24 saat boyunca enjekte organoidlerin görselleştirilmesisağlar. Bu iyi uygulanan bir yöntem olmasına rağmen, tarama elektron mikroskobu ekscystation süreci sporozoitler veya ookistler zarar vermedi sağlamak için kullanılabilir. Organoid lümen içine ookistlerin eşit miktarda enjeksiyon uygular görsel olarak basit mikroskobik görüntüleme ile doğrulanabilir.

İmmünofloresan tahlilleri de Cryptosporidium tarafından enfekte hücrelerin türlerini keşfetmek için kullanılabilir. Diferansiye organoidler beş gün boyunca enfekte olduktan sonra, ookistlerin bir kısmının yapışkan bir slayt üzerine kurutulması, ookistlerin metanol ile sabitlenmesi ve DAPI lekelerinin uygun ookist spesifik antikorla birleştirilmesi ile ookistlerin varlığı doğrulanabilir. Maksimum sonuçlar için, taze ookistler kullanın, tüm enjeksiyonlar için aynı kılcal kullanın, ve enjeksiyondan sonra her gün medya değiştirin.

Bu tekniği kullanarak, çeşitli laboratuvarlar şimdi konak-mikrop etkileşimleri çalışma organoidler kullanmaya başlıyor. Benzer organoid mikrokültür ortamlarında kommensalların yanı sıra diğer patojenleri de inceliyoruz. Cryptosporidium bir insan paraziti olduğundan, seviye 2 güvenlik yönetmeliklerine göre bu deneyleri gerçekleştirmek önemlidir.