לימוד זיהום הצפנה ברקמה תלת-ממדית-מערכות תרבות מיקרואיד של האדם הנגזר על ידי מיקרו-הזרקה

באמצעות הליך טיהור ומיקרו-ג'ינג'יט זה של ספורוזויט, ניתן ללמוד למעשה כל חיידק מארח בכל מערכת איברים המופקת מרקמות. באמצעות טכניקה זו, אנו יכולים לשלוט על כמות ספורוזואיטים טהורים מוזרק לתוך לומן אורגנואיד או בצד האפי של האורגנואיד. כדי לטהר את C.parvum sporozoites, להעביר את oocyst לצינור 15 מיליליטר ו להשתמש מחדש את התאים באחת פעמים 10 כדי oocyst השביעי לכל ריכוז בינוני excystation מיליליטר.

לאחר 60 עד 90 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, לערבב 14 מיליליטר של פתרון לשטוף מתאים עם oocysts, ומעים את התאים על ידי צנטריפוגה. שאפו את העל-טבעי בזהירות כדי להימנע מאיבוד אוציסטות והתינו מחדש את גלולת הספרוזואיקון ב-3 פעמים 10 עד ל-1-2 מיליליטר של ריכוז DMEM. כדי להסיר את כל oocysts הנותרים ופגזים, מניחים חבית מזרק 10 מיליליטר מצויד ב מכשיר מחזיק מסנן 47 מיליליטר מצויד במסנן פוליקרבונט בגודל נקבובית שלושה מיקרומטר לתוך צינור 15 מיליליטר בארבע מעלות צלזיוס.

הוסף 7.5 מיליליטר של ההשעיה ספורוזויט להרכבת המסנן. כאשר הנפח כולו עבר דרך מסננת על ידי כוח הכבידה, לשטוף את כל התאים הנותרים דרך מסננת עם עוד 7.5 מיליליטר של DMEM. כאשר כל הכביסה עברה דרך מסננת, לאסוף את ההשעיה ספורוזואיט מסונן על ידי צנטריפוגה במשך 10 דקות ולתייג את גלולה ב 50 כדי 100 microliters של מדיום תרבות אורגנואידית מתאימה, בתוספת 0.05% צבע ירוק מהיר, ו L-גלוטתיון, betaine, L-cysteine, חומצה לינולאית, ו taurine המכיל חיץ

כדי microinject את הטפילים לתוך הצד apical של אורגנואיד 3D, תחילה להשתמש מושך micropipette להכין נימים הזרקת זכוכית. השתמש במקלפים כדי לחתוך את קצה נימי לקוטר 9 עד 12 מיקרומטר כדי לאפשר זרימה קלה של sporozoites או oocysts, אם תבחר להזריק oocysts ישירות, ולהשתמש טיפים מיקרו מטעין כדי למלא כל נימי עם צבע ירוק מהיר שכותרתו oocyst או השעיה sporozoite. לאחר מכן, לטעון את נימי הראשון מלא ספורוזויט לתוך microinjector ולהשתמש מיקרוסקופ הפוך בהגדלה 5x ולחץ מתמיד microinject 100 כדי 200 nanoliters של ההשעיה לתוך כל organoid.

פרוטוקול excystation תוצאות שחרורו של sporozoites מכ 70 עד 80% של oocysts. לכן, חיוני לסנן את קליפות oocyst הנותרים באמצעות סינון שלושה מיקרומטר. הסר כמעט 100% מהבעיות הבלתי מוסברות.

יתר על כן, תוספת של צבע ירוק מסייע להבטיח את הזריקה של כל האורגנואידים, ומאפשר הדמיה של אורגנואידים מוזרק לפחות 24 שעות לאחר ההזרקה. למרות שזו שיטה מתורגל היטב, סריקת מיקרוסקופ אלקטרונים יכול לשמש כדי להבטיח כי תהליך excystation לא לפגוע sporozoites או oocysts. הזרקת כמויות שוות של oocysts לתוך לומן אורגנואיד יכול להיות מאושר חזותית על ידי הדמיה מיקרוסקופית פשוטה.

בדיקות immunofluorescence יכול לשמש גם כדי לחקור את סוגי התאים הנגועים Cryptosporidium. לאחר האורגנואידים המובחנים נדבקו במשך חמישה ימים, נוכחותם של sporozoites בתוך oocysts ניתן לאשר על ידי ייבוש חלק של oocysts על שקופית דבק, תיקון oocysts עם מתנול, ושילוב כתמי DAPI עם נוגדן ספציפי oocyst מתאים. לקבלת תוצאות מרביות, יש להשתמש ב-oocysts טריים, להשתמש באותו נימי עבור כל הזריקות ולשנות את המדיה כל יום לאחר ההזרקה.

באמצעות טכניקה זו, מעבדות שונות מתחילות כעת להשתמש באורגנואידים כדי לחקור אינטראקציות בין חיידקים מארחים. אנו לומדים commensals, כמו גם פתוגנים אחרים בהגדרות מיקרוקולטורה אורגנואידית דומה. כמו Cryptosporidium הוא טפיל אנושי, חשוב לבצע ניסויים אלה על פי תקנות בטיחות ברמה 2.