Bu protokol, serbest bırakma oranını ve ilgi bir protein olan amiloid miktarını kontrol etmek için kullanılacak mikroboncukların imalatı açıklar. Mikroboncuklar hücreleri uygun bir biyomalzeme içinde hareketsiz hale getirecek ve onları çevrelerindeki çevreden koruyacak, ayrıca yan ürün ve besin alışverişini çevreleriyle paylaşmalarına olanak sağlayacaktır. Bu tekniği kullanarak hücreleri kapsülleme mikrop boyutunun yanı sıra hücre sayısının sıkı kontrol sağlar ve biz çeşitli üretim parametreleri ayarlayarak bunu.
Yani bu protokolde tanımlanan hücreleri kapsüllemek bize hem in vitro hem de in vivo sistemlerinde kullanmak için amiloidin kronik salınımını daha fazla sağlayacaktır, ve fikir bu bize hastalığın mekanizmalarını daha iyi anlamamızı sağlayacak ve aynı zamanda yeni tedavileri test etmemize olanak sağlayacaktır. Bu yöntem, kontrollü sistemi formüle etmek ve tek başına veya birlikte olsun, birçok hücre tipi için herhangi bir biyomolekül salınımını incelemek için kullanılabilir. Başlamak için, kuvözden neredeyse kabarık bir şişe çıkarın.
Hücreleri %0,25 tripsin-EDTA çözeltisi ile tedavi edin ve hücreleri ayırmak için 37 C'de 5 ila 10 dakika kuluçkaya yatırın. DMEM/F12 ortamını ekledikten sonra hücreleri 50 mililitrelik bir tüpe toplayın. Hücreleri 1000 RPM'de beş dakika santrifüj edin.
Supernatant çıkarın ve hepes tamponlu tuzlu pelet son istenen hücre konsantrasyonu iki katına çıkarmak için pelet yeniden askıya. 50 mililitrelik bir santrifüj tüp,% 2 ağırlık ve hacim aljinat çözeltisi istenen hücre konsantrasyonu içeren son bir süspansiyon elde etmek için% 4 ağırlık ve hacim aljinat çözeltisi ile bire bir oranında bu hücre süspansiyon karıştırın. Kapsülleme parametrelerini ayarlamak için kapsülleme makinesinin hızını maksimum ekstrüzyon hızına ayarlayın ve ardından voltajı ve frekansı ayarlayın.
Mikroboncukları 20 mililitrelik şırıngayla imal etmek için hücre aljinat süspansiyonunun beş mililitresini yükleyin ve kapsülatöre bir şırınga takın. Kapsülleyiciyi başlatmak için, hücre aljinalit süspansiyonu besleyiciden geçirerek akışı etkinleştirin ve bir damlacık akışı enjektörden geçirilir. İlk tektip olmayan akışı önlemek için atık kabında ilk bir mililitre toplamak.
Sonra damlacıkları kalsiyum klorür jelleşme banyosu içine düşmesine izin kalan dört mililitre çalışmaya devam edin. Jelleşme banyosu ile temas halinde, damlacıklarda aljinat anında jelleşme banyosunda kalsiyum iyonları ile çapraz bağlantılar, küresel mikroboncuklar oluşturan. Bir dakika sonra, manyetik platformdan jelasyon kabı çıkarın ve mikroboncuklar oda sıcaklığında jelasyon tamamlamak için ajitasyon olmadan daha dört dakika dinlenmek için izin.
Mikroboncuklar almak için, ilk herhangi bir büyük aljinit enkaz veya eserler kaldırmak için steril cımbız bir çift kullanın. Plastik bir pipetin ucunu kestikten sonra, jelleşme banyosundaki mikroboncukları atık kabın üzerinde tutulan 74 mikrometrelik örgü filtreye aktarmak için kullanın. Başarıyı sağlamak için, mikroboncuklara zarar vermemek için her zaman plastik bir pipetin ucunu keseriz ve kapsülleme den sonra boncukları her bir damardan diğerine aktardığımızda bunu yaparız.
Kafes filtresini bir santrifüj tüp üzerinde ters çevirin. Pipet tüp aşağı boncuk yıkamak ve onları beş dakika boyunca bu ortamda dengelemek için izin üzerine uygun kültür orta. Daha sonra daha önce kuluçka ve daha fazla deney için uygun ortam ile dolu bir şişe onları aktarın.
Kapsülleme ve kültür den sonra hücre canlılığını değerlendirmek için, yavaşça mikroboncuklar bozmak ve kapsüllenmiş hücreleri serbest bırakmak için çözünme karışımı ekleyin. Bir hücre kültürü kuluçka hücreleri inkübasyon nazik ajitasyon ile 10 dakika boyunca 37 C de% 5 karbondioksit ile takviye. Trippan mavisi ile boyanarak ve hemositometre odası kullanarak bu hücrelerin hücre canlılığını tahmin edin.
Mikrop stabilitesini değerlendirmek için, bir mikroskop ve görüntüleme yazılımı kullanarak bir zaman diliminde her mikroboncuk popülasyonundan bir numunenin ortalama çapını ölçün. Hazırlıktan sonra bu protokol kullanılarak tek tip ve küresel aljinat mikroboncukları başarıyla üretildi. Standart hücre kültürü koşullarında bir gün sonra, kapsüllenmiş 7PA2 hücreleri mikroboncuklar eşit olarak dağıtıldı.
7PA2 hücre proliferasyonu MTS testi kullanılarak test edildiğinde, yedi günlük bir süre içinde aljinatlı veya aljinatsız olarak yetiştirilen 7PA2 hücrelerinin davranışı arasında anlamlı bir fark yoktu. 7PA2 hücrelerinin 2D ve 3D kültürlerinden analiz edilen koşullu ortam, her iki kültürde de amiloid-beta 1-42 düzeylerinde sürekli bir artış saptandı. Mikroboncuklardan veya 3D kültürden amiloid-beta 1-42 salınım oranı, profil de 2D kültürden yayımlanan benzer.
Aljinat mikroboncuklarında kapsüllenen 7PA2 hücreleri amiloid-betanın sürekli salınımı için etkili bir şekilde kullanılabilir. Sıçan beyninde engraftment için mikroboncuklar büyük bir lezyon oluşturmadan gömülü olması için yeterince küçük olmalıdır. İnvivo amaçlı olarak beynin içine milimetre ölçekli bir boncuk yerleştirmek işe yaramazken, bu protokol kullanılarak imal edilen bir mikrop, farenin hipokampusunun içine yerleştirilmesi için uygun bir boyuta sahiptir.
Son üründeki hücrelerin eşit dağılımını olduğundan emin olmak için hücre aljinalit süspansiyonundaki hücreleri iyice karıştırmak önemlidir ve bu da her mikroptaki amiloidin tek tip salınımını garanti eder.
