Este protocolo explica la fabricación de microperdas, que se utilizará para ayudar a controlar la tasa de liberación y la cantidad de amiloide que es una proteína de interés. Las microperlas inmovilizarán las células en un biomaterial adecuado y las protegerá de su entorno circundante, además de permitirles intercambiar subproductos y nutrientes con su entorno circundante. Encapsular células utilizando esta técnica asegura un control estricto del tamaño de la micropera, así como el número de célula, y lo hacemos ajustando varios parámetros de fabricación.
Así que encapsular las células descritas en este protocolo nos dará más de una liberación crónica de amiloide para utilizar tanto en sistemas in vitro como in vivo, y la idea sería que esto nos daría una mejor comprensión de los mecanismos de la enfermedad y también nos permitiría probar nuevos tratamientos. Este método se puede utilizar para formular el sistema controlado y estudiar la liberación de cualquier biomoléculas para muchos tipos de células, ya sea solo o en combinación. Para comenzar, retire un matraz casi confluente de la incubadora.
Tratar las células con 0.25%solución de trippsina-EDTA e incubar a 37 C durante cinco a 10 minutos para separar las células. Después de añadir el medio DMEM/F12, recoja las células en un tubo de 50 mililitros. Centrifugar las células a 1000 RPM durante cinco minutos.
Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en solución salina tamponada HEPES para duplicar la concentración celular final deseada. En un tubo centrífugo de 50 mililitros, mezcle esta suspensión celular en una proporción de uno a uno con una solución de alginato de 4% de peso y volumen para obtener una suspensión final que contenga la concentración celular deseada en una solución de alginato de 2% de peso y volumen. Para establecer los parámetros de encapsulación, establezca la velocidad de la máquina encapsuladora en la velocidad máxima de extrusión y, a continuación, establezca el voltaje y la frecuencia.
Para fabricar las microperras, en una jeringa de 20 mililitros, cargue cinco mililitros de la suspensión de alginato celular y conecte una jeringa al encapsulador. Para iniciar el encapsulador, active el flujo que empujará la suspensión de alginato celular a través del alimentador, y se extruirá una corriente de gotas a través de la boquilla. Recoger el primer mililitro en el vaso de residuos para evitar el flujo inicial no uniforme.
A continuación, continúe ejecutando los cuatro mililitros restantes permitiendo que las gotas caigan en el baño de gelación de cloruro de calcio. Al entrar en contacto con el baño de gelización, el alginato en las gotas se cruza instantáneamente con los iones de calcio en el baño de gelación, formando microperas esféricas. Después de un minuto, retire el vaso de geleración de la plataforma magnética y deje que las micropercinas descansen durante otros cuatro minutos sin agitación para completar su gelificación a temperatura ambiente.
Para recuperar las micropergas, primero use un par de pinzas estériles para eliminar cualquier escombro o artefacto de alginato grande. Después de cortar el extremo de una pipeta de plástico, úselo para transferir las microperlas desde el baño de gelación a un filtro de malla de 74 micrómetros sobre un vaso de residuos. Para asegurar el éxito, siempre cortamos el extremo de una pipeta de plástico para evitar dañar las microperlas y lo hacemos cada vez que transferimos perlas de un recipiente a otro después de la encapsulación.
Invierta el filtro de malla sobre un tubo centrífugo. Pipetear el medio de cultivo apropiado sobre él para lavar las cuentas por el tubo y dejar que se equilibren en ese medio durante cinco minutos. A continuación, transfieralos a un matraz previamente lleno con el medio adecuado para la incubación y otros experimentos.
Para evaluar la viabilidad de la célula después de la encapsulación y el cultivo, agregue la mezcla de disolución para interrumpir suavemente las microperlas y liberar las células encapsuladas. Incubar las células en una incubadora de cultivo celular suplementada con 5% de dióxido de carbono a 37 C durante 10 minutos con agitación suave. Estimar la viabilidad celular de estas células tiñendo con azul tripano y utilizando una cámara de hemocicómetro.
Para evaluar la estabilidad de las microperras, mida el diámetro medio de una muestra de cada población de microperma durante un período de tiempo utilizando un microscopio y un software de imágenes. Después de la preparación, se generaron con éxito microperas de alginato uniformes y esféricos utilizando este protocolo. Después de un día en condiciones de cultivo celular estándar, las células encapsuladas de 7PA2 se distribuyeron uniformemente en microperlas.
Cuando se probó la proliferación celular 7PA2 utilizando un ensayo de MTS, no hubo diferencia significativa entre el comportamiento de 7 CÉLULAs 7PA2 cultivadas con o sin alginato durante un período de siete días. Los medios condicionados analizados a partir de cultivos 2D y 3D de células 7PA2 revelaron un aumento constante en los niveles de amiloide-beta 1-42 en ambos cultivos. La tasa de liberación de amiloide-beta 1-42 de microperas, o cultivo 3D, es similar en perfil al liberado de la cultura 2D.
7PA2 células encapsuladas en microperlas de alginato se pueden utilizar eficazmente para la liberación sostenida de amiloide-beta. Los micropers para el injerto en el cerebro de la rata deben ser lo suficientemente pequeños como para estar incrustados sin crear una lesión grande. La implantación de un cordón a escala milimétrica dentro del cerebro para fines in vivo no funcionaría, mientras que una microperla fabricada con este protocolo tiene un tamaño adecuado para la inserción dentro del hipocampo de la rata.
Para asegurarnos de que tenemos una distribución uniforme de las células en el producto final, es importante mezclar a fondo las células en la suspensión del alginato celular, y esto garantiza la liberación uniforme de amiloide de cada micropera.
