Reaksiyonlarda katalizör olarak enzimlerin kullanılması reaksiyon için gerekli enerji miktarını azaltabilir ve toksik yan ürünleri azaltabilir. Ancak, enzimlerin endüstride kullanımı sınırlıdır, çünkü enzimler kararlı değildir ve pahalı olabilir. Bu protokol, koşulların enzim aktivitesine zararlı olup olmadığını veya enzimdeki değişikliklerin stabilitesini artırıp artırmadığını belirlemek için gereken süreyi azaltabilir.
Bu tekniğin en büyük avantajı geleneksel enzim stabilitesi tahlillerinden daha az insan saati gerektirmesidir. Ayrıca, bu protokol çok çeşitli enzimlerle kullanılabilir, çünkü ısıyı serbest bırakan veya emen herhangi bir reaksiyonla kullanılabilir. Başlamak için, 0.1 molar sodyum asetat tampon hazırlayın.
1,000 mililitrelik bir kabın içinde 800 mililitre distile su ölçün. Sonra, tartmak 8.2 susuz sodyum asetat gram, ve beher ekleyin. Bir karıştırma plakası üzerine beher yerleştirin.
Kabın içine bir karıştırma çubuğu yerleştirin ve tamamen eriyene kadar karıştırmak için karıştırma plakası açın. Susuz sodyum asetat tamamen çözündüğünde, çözeltinin pH'ını ölçmek için kalibre edilmiş bir pH metre kullanın. Buna göre 4.6 istenilen pH elde etmek için 1 molar hidroklorik asit veya sodyum hidroksit eklemek için bir pipet kullanın.
Toplam hacim 1.000 mililitreye ulaşana kadar kabın içine distile su ekleyin. Enzim çözeltisini hazırlamak için, 15 mililitrelik bir silindirde, 0,1 molar sodyum asetat tamponunun 8 mililitresini ölçün. Daha sonra, enzim ile 15 mililitrelik konik tüp içine tampon çözeltisi ekleyin ve enzim eriyene kadar şiddetle sallayın.
Toplam birim 10 mililitreye ulaşana kadar daha fazla arabellek çözümü ekleyin. Enzim çözeltisini kullanıma kadar 4 santigrat derecede saklayın. Substrat çözeltisini hazırlamak için, substratı tartın ve 100 mililitrelik cam kabına yerleştirin.
Tampon çözeltisinin 20 mililitresini ölçmek için mezun olmuş bir silindir kullanın ve sonra cam kabına ekleyin. Bir karıştırma plakası üzerine beher yerleştirin ve beher içine bir manyetik karıştırma çubuğu yerleştirin. Isıyı açın ve karıştırma hızını buna göre ayarlayın.
Substrat eriyene kadar karıştırmadevam edin. Substrat çözeltisini 15 mililitrelik konik bir tüpe dökün ve toplam hacmi 45 mililitre olana kadar daha önce hazırlanmış sodyum asetat tamponu ekleyin. Karıştırmak için tüpü sallayın.
Substrat çözeltisini kullanıma kadar oda sıcaklığında saklayın. Bilgisayarda ITC Çalıştır'ı açın ve kuruluma tıklayın. Karıştırma oranını tıklatın ve 350 rpm olarak ayarlayın.
Şırınga nın boyutunun 50 mikrolitre olduğunu kontrol edin. Sıcaklığı 55 dereceye ayarlayın ve güncellemeye basın. ItC cihazının gerektiği gibi ısınması veya soğuması için yeterli zaman tanımak için ilerlemeden önce en az bir saat bekleyin.
Enzimi yüklemeden önce, referans hücrenin 350 mikrolitre distile su ile yüklendiğinden emin olun. Örnek hücreyi temizlemek için yükleme şırıngasını yüzde 2 temizleme çözeltisinin 500 mikrolitresi ile doldurun. İğneyi dikkatlice örnek hücreye takın, hücreyi doldurun ve aynı şırıngayı kullanarak sıvıyı yavaşça çıkarın.
Sıvıyı bir kabın içine atın. Bu adımı yüzde 2 temizleme solüsyonuyla, üç kez yüzde 70 etanol ile tekrarlayın ve sonra damıtılmış suyla on kez yıkayın. Numune hücresi temizlendikten sonra yükleme şırıngasını 450 mikrolitre enzim çözeltisi ile doldurun.
İğneyi numune hücresinin dibine kadar dikkatlice takın ve hava kabarcıklarının oluşmasını önlemek için yavaşça 100 mikrolitrelik çizgiye doğru bastırın. Daha sonra, 50 mikrolitrelik titrasyon şırıngını, iğne ucunu suya koyarak üç kez yıkayın ve suyu yavaşça şırıngaya alın ve suyu bir atık kabına dağıtın. Artık suyu temizlemek için substrat çözeltisi ile üç kez durulayın.
Bundan sonra, şırınga herhangi bir hava kabarcıkları olmadan dolu olana kadar çözelti çizerek substrat çözeltisi ile titrasyon şırınga doldurun. Şırınga hala substrat çözeltisindeyken, pistonu çıkarın ve yaklaşık 2 mikrolitre havanın şırınganın üst kısmına girmesine izin verin ve pistonu yeniden takın. ITC'nin burette sapını çıkarın, şırıngayı burette sapının içine yerleştirin ve sıkı olana kadar vidala.
Titrasyon şırıngasının ucunu tüy bırakmayan bir dokuyla silin ve burette sapını dikkatlice ITC aletine yerleştirin ve yerine kilitleyin. Deneme kurulumu için artımlı titronu seçin. Enjeksiyonları ayarlamak için ekle'yi tıklatın.
Enjeksiyon aralığını 5, 400 saniye, enjeksiyon hacmini 4 mikrolitreye ve enjeksiyon sayısını dörde ayarlayın. Ayarları onaylamak için Tamam'a basın. Equilibration kutusunda, otomatik denge ve beklenen büyük ısıları seçin.
İlk taban çizgisini 300 saniyeye ayarlayın. Çalıştırmayı başlatmak için karıştırma hızının yanındaki başlat simgesini tıklatın ve ardından anahtar sembolünün yanında bulunan başlat'ı tıklatın. Dosyayı kaydedin ve enstrümanın çalışmasına izin verin.
Verileri çözümlemek için Nano Analyze'da dosyayı açın. Verileri tıklatın ve veri sütunlarını seçin. Tüm verileri seçin, kopyalayın ve verileri Microsoft Excel'e yapıştırın.
0 yapmak için 300 saniye de gerekli değeri ekleyerek 0 taban çizgisi ayarlayın. Bu düzeltmeyi ısı oranı değerlerinin tüm sütununa uygulayın. Ardından, titrasyon sırasında değerin oluştuğu zamana göre minimum veya maksimum değerlerin grafiklerini çizin.
Bu protokolde, LAKtaz aktivitesinin ITC veri izleri pH 4.6 tampon 55 santigrat derece, 45 santigrat derece, 35 santigrat derece ve 25 santigrat derece laktaz çözeltisi içine laktoz dört ardışık enjeksiyonları ile gösterilir. Karıştırma ısısı için 55 santigrat derecede enzim kontrolü yapılmadı. Enzimin her enjeksiyonu için, karıştırma bir başlangıç ekzotermik ısı vardır, ve daha sonra, laktoz laktaz katalize enfortermik hidroliz reaksiyonu tamamlanana kadar oluşur, ve ısı hızı taban çizgisine döner.
Her enjeksiyondan sonra endotermik pik minimum, enzimatik aktivitenin azalması nedeniyle önceki enjeksiyondan biraz daha azdır. Beklendiği gibi, her enjeksiyon için enzim stabilitesi artan sıcaklık ile azalır. Kontrol deneyi, 25 santigrat derecedeki laktaz aktivitesinin enzim aktivitesinde dört enjeksiyondan sonra seyreltme nedeniyle yüzde 8 oranında azaldığını gösteriyor.
Dördüncü enjeksiyonun tsurelde yüzde 73'lük bir azalma gösterdiği düşünülürse, gerçek enzim aktivitesi kaybı bu nedenle yüzde 65'tir. Böylece, laktaz seyreltme her enjeksiyon sonucu, enzim aktivitesi üzerinde yüzde 11 nispeten küçük bir etkisi vardı. Enzim ve substrat çözeltilerinin yapmak için kullanılan tamponun mümkün olduğunca yakın eşleşmesi önemlidir.
pH veya konsantrasyon uyumsuzluk reaksiyon ısı maskeleyebilir karıştırma daha büyük bir ısı neden olabilir. Bu protokolü enzimlerin incelenmesi ve reaksiyon sırasında salınan veya emilen ısı oranını ölçerek kararlılıklarını belirlemek için uygulayabilirsiniz.
