Yazarlar tartışmalar için diferansiyel taramalı kalorimetre, Sasmit Deshmukh ve Webster Magcalas kurulum ve eğitim rollerinden ötürü (eski GE Healthcare ile), Joseph Mancini, Pawel Czudec, Thomas Cage (Malvern Instruments sınırlı) için müteşekkiriz.

1. Enstrüman Başlangıç <ol><li> Diferansiyel tarama kalorimetresi açın ve numune kaynamasını engellemek için hücrelerde basıncı artırmak yanı sıra oluşturma yüksek sıcaklıklarda kabarcıklar engeller. Bu, tipik olarak sisteme azot tedarik ederek elde edilir. </li><li> Hücre (örneğin, tantal, altın, platin, vs.) oluşturan malzemeye bağlı olarak, hücrenin zarar görmesini önlemek için üreticinin tavsiye basınca göre azot gazı besleme basıncını ayarlar. Örneğin, hücreye zarar verebilir 80 psi üzerinde bu prosedür geliştirmek için kullanılan cihaz için 45 psi&#39;de azot gaz kaynağının basıncı ve basınç ayarlamak. </li><li> Tüm temizlik maddesi depoları gerekli hacme kadar dolu olduğundan emin olun. gerekli temizleme maddeleri yıkama ve her bir örnek çalışmasından sonra, sırasıyla hücre temizlemek için deterjan ve su içerir. </li><li> Numune tutma bölmenin sıcaklığı ayarlayınuygun bir değer, tercihen 5 ° C&#39;ye kadar, deney öncesinde numunenin bütünlüğünü korumak için. </li></ol> 2. Numune Hazırlama <ol><li> deney için referans olarak kullanılacaktır tampona karşı örnek dialyze. Seçenek olarak ise, protein saflaştırma (örneğin, sütun elüsyon) son aşamasında toplanan elüsyon tamponu kullanılabilir. </li><li> Bu Kjedahl yöntemi 33 veya Lowry yöntemi 34 gibi en uygun protein konsantrasyonu belirleme yöntemini kullanarak protein numune konsantrasyonunu belirlemek. Sonuçların objektif karşılaştırma için, aynı çalışma içinde tutarlı bir şekilde aynı yöntemi kullanın. Gerekli konsantrasyon aralığı enstrüman modeline bağlı olarak değişebilir. 1 mg / ml - Bu protokolde kullanılan enstrüman için tercih çalışma aralığı 0.5 olduğunu. </li><li> vakum örnek ve referans tampon hacmi inaccur neden olabilir mikro kabarcık kurtulmak için DegasACY. Bu adım yeni kalorimetre modelleri için atlanabilir. </li><li> Laminer akış biyolojik tecrit kabininde bir mikropipet ve steril ipuçları kullanılarak, alet ile uyumlu 96 oyuklu plakalara çift örnekleri ve bunların ilgili tampon yükleyin. Tampon-tamponu, sırasıyla su işlemi için su ile tampon ile kuyu ilk iki çift son iki çift doldurun. Tampon tampon taramaları ölçümü (enstrümantasyon hatası yani değerlendirmesini) örnek yanı sıra bir temel kurmak için önce aracın uygunluğunu teyit etmek; Su taramaları çalıştırmak ise hücreleri temizlemek için. </li><li> bir sızdırmazlık film ile 96-plaka Kapak ve kuyular düzgün örnek kirlenmeyi önlemek için Biyogüvenlik Kurulu dışarı tabak almadan önce mühürlü olduğundan emin olun. </li><li> Doğru yönde örnek tutan bölmeye plaka koyun. </li></ol> 3. Deneysel Parametre Ayarı Not: i bağlınstrumentation numuneler manuel bir şırınga kullanarak, ya da otomatik olarak, bir otomatik numune alıcı ile hücre içine yerleştirilebilir. Bu durumda, (örneğin, bir sanayi ortamında) olarak, bir otomatik numune zaman kazanmak için kullanılır. <ol><li> satın alma yazılımı kullanarak, plaka bölüm 2.4 uyarınca yüklenen sırayla örnek bilgileri giriniz. Varsa aksi halde, önceki veri analizi (bölüm 4.2) için analiz yazılımı içine konsantrasyon değerleri girin, konsantrasyonları girin. </li><li> hücrelerde kalan hiçbir deterjan kalıntılarını sağlamak için birden fazla su ile durulama adımlarla takip edilmelidir her numune tarama, önce deterjanla hücrelerin temizlik sağlar seçeneği seçin. </li><li> 20 ° C&#39;ye kadar deney başlangıç ​​sıcaklığına ayarlayın, ancak, bu örnek önceden bilgisine bağlı olarak değişebilir. daha düşük bir başlangıç ​​sıcaklığı bilinmiyor örnekleri için uygulanabilir ise bilinen proteinleri için, önceden belirlenmiş bir başlangıç ​​sıcaklığı kullanılabilir. </li><li> Nihai sıcaklığı ayarlamakDeney, örneğin, 100 ° C&#39;dir. Nihai sıcaklık, numunenin önceki bilgisine bağlı olarak değişebilir. </li><li> Tipik tarama oranı deney tarama hızı, örneğin 60 ° C / h, ayarlayın. Ancak, tarama hızı, örneğin, numunenin önceki bilgisine bağlı olarak 90 ° C / h veya 120 ° C / h değişebilir. Açılım kinetiği değerlendirmek için farklı tarama hızlarında bilinmeyen örnekleri taramak için tavsiye edilir. </li><li> Rescan numuneler açılımı termal geri dönüşlülüğünü araştırmak. İkinci tarama için elde edilen entalpi ilk tarama için entalpi değerinin en az% 80 olması durumunda bir proteinin açılımı geri dönüşümlü olarak kabul edilir. </li><li> Kalorimetre hücrelerinin bütünlüğünü korumak için 10 ° C sonrası deney termostatı ayarlayın. </li><li> Deney ayar parametreleri deney çalıştırmadan önce doğru olduğundan emin olun. Her şey yerinde ise, deney başlar. </li></ol> 4. Veri Analysis <ol><li> Denemeden ham veri alma ve analiz için bir defada bir örnek seçin. Örnek tarama Çıkar referans tarama, yani tampon. NOT: Referans çıkarma DSC araçların yeni modelleri ile otomatik olarak yürütülür. </li><li> bu bölüm 3.1 uyarınca ihmal eğer örnek konsantrasyon değerini girin. </li><li> Fit ve açılımı üzerine su hidrofobik grupların maruz kalma sonucu protein katlanmış ve katlanmamış devletlerin ısı kapasiteleri farklılıkları hesaba edinilen termogramı çizgisinin çıkarın. Doğrusal ya da kübik eğri örnek için DSC profili şekline bağlı olarak uygulanabilir. Tutarlılık için montaj aynı tip bir çalışma, örneğin gerçek zamanlı stabilite çalışması sırasında kullanılacak sahiptir. Bu adım, Tepe noktası entegrasyonu geçiş entalpisi elde etmek için eğri işlemek için gereklidir. </li><li> lineer olmayan en küçük kareler kullanılarak Tepe noktası entegrasyonu gerçekleştirin. Ürünün göreBilgi iki devlet veya non-iki-devlet modelinin uygulayın. İki devlet modeli tek kooperatif termal geçişler için kullanılan ve daha fazla ürün bilgisi kullanılabilir duruma gelene kadar bilinmeyen proteinlerin olmayan iki devletli bir model uygulamak olabilir. Varsa, Ki-kare değeri sabit kalana kadar ekipmanın yazılımın mükerrer eğri işlevini kullanarak uydurma eğrisini ayarlamak. </li><li> Elde edilen sonuçlar geçiş sıcaklıkları (Tm), kalorimetrik entalpisi (AH) ve numunenin van&#39;t Hoff entalpisi (AH VH) orta değerlerini gösterecektir. </li></ol>

<ol>
	<li>Gill, P., Moghadam, T. T., Ranjbar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+scanning+calorimetry+techniques:+applications+in+biology+and+nanoscience.">Differential scanning calorimetry techniques: applications in biology and nanoscience.</a> J. Biomol. Tech. 21 (4), 167-193 (2010).</li><li>Watson, E. S., O'Neil, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+microcalorimeter.">Differential microcalorimeter.</a> Patent. , (1966).</li><li>O'Neill, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Analysis+of+a+Temperature-Controlled+Scanning+Calorimeter.">The Analysis of a Temperature-Controlled Scanning Calorimeter.</a> Anal. Chem. 36 (7), 1238-1245 (1964).</li><li>O'Neil, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+Specific+Heat+Functions+by+Differential+Scanning+Calorimetry.">Measurement of Specific Heat Functions by Differential Scanning Calorimetry.</a> Anal. Chem. 38 (10), 1331-1336 (1966).</li><li>Privalov, P. L., Monaselidze, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mol. Biol. 6, 7-33 (1975).</li><li>Privalov, P. L., Plotnikov, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adiabatic+differential+microcalorimeter.">Adiabatic differential microcalorimeter.</a> &#1040;&#1076;&#1080;&#1072;&#1073;&#1072;&#1090;&#1080;&#1095;&#1077;&#1089;&#1082;&#1080;&#1081; &#1076;&#1080;&#1092;&#1092;&#1077;&#1088;&#1077;&#1085;&#1094;&#1080;&#1072;&#1083;&#1100;&#1085;&#1099;&#1081; &#1084;&#1080;&#1082;&#1088;&#1086;&#1082;&#1072;&#1083;&#1086;&#1088;&#1080;&#1084;&#1077;&#1090;&#1088;. , (1970).</li><li>Andronikashvili, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calorimetric+study+of+the+nature+of+the+intramolecular+fusion+of+collagen,+isolated+from+transplantable+tumor.">Calorimetric study of the nature of the intramolecular fusion of collagen, isolated from transplantable tumor.</a> Dokl. Akad. Nauk. 183 (1), 212-214 (1968).</li><li>Andronikashvili, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Conformational Changes of Biopolymers in Solution. , 171-173 (1973).</li><li>Andronikashvili, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malignant+transformation+and+changes+in+various+physic-chemical+properties+of+macromolecules+and+supramolecular+structures.">Malignant transformation and changes in various physic-chemical properties of macromolecules and supramolecular structures.</a> Biofizika. 32 (5), 782-799 (1987).</li><li>Velicelebi, G., Sturtevant, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermodynamics+of+the+denaturation+of+lysozyme+in+alcohol-water+mixtures.">Thermodynamics of the denaturation of lysozyme in alcohol-water mixtures.</a> Biochemistry. 18 (7), 1180-1186 (1979).</li><li>Sturtevant, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heat+capacity+and+entropy+changes+in+processes+involving+proteins.">Heat capacity and entropy changes in processes involving proteins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 74 (6), 2236-2240 (1977).</li><li>Sturtevant, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+applications+of+differential+scanning+calorimetry.">Biochemical applications of differential scanning calorimetry.</a> Annu. Rev. of Phys. Chem. 38, 463-488 (1987).</li><li>Jackson, W. M., Brandts, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermodynamics+of+protein+denaturation.+A+calorimetric+study+of+the+reversible+denaturation+of+chymotrypsinogen+and+conclusions+regarding+the+accuracy+of+the+two-state+approximation.">Thermodynamics of protein denaturation. A calorimetric study of the reversible denaturation of chymotrypsinogen and conclusions regarding the accuracy of the two-state approximation.</a> Biochem. 9 (11), 2294-2301 (1970).</li><li>Privalov, P. L., Khechinashvili, N. N., Atanasov, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermodynamic+analysis+of+thermal+transitions+in+globular+proteins.+I.+Calorimetric+study+of+chymotrypsinogen,+ribonuclease+and+myoglobin.">Thermodynamic analysis of thermal transitions in globular proteins. I. Calorimetric study of chymotrypsinogen, ribonuclease and myoglobin.</a> Biopolymers. 10 (10), 1865-1890 (1971).</li><li>Privalov, P. L., Khechinashvili, N. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+thermodynamic+approach+to+the+problem+of+stabilization+of+globular+protein+structure:+a+calorimetric+study.">A thermodynamic approach to the problem of stabilization of globular protein structure: a calorimetric study.</a> J. Mol. Biol. 86 (3), 665-684 (1974).</li><li>Privalov, P. L., Potekhin, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanning+microcalorimetry+in+studying+temperature-induced+changes+in+proteins.">Scanning microcalorimetry in studying temperature-induced changes in proteins.</a> Methods Enzymol. 131, 4-51 (1986).</li><li>Veprintseva, O. D., Emelyanenko, V. I., Konstantinova, V. V., Shnyrov, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+structural+changes+in+bacteriophage+T4+tail+proteins.">The importance of structural changes in bacteriophage T4 tail proteins.</a> Biofizika. 33, 954-961 (1988).</li><li>Shutilova, N., Semenova, G., Klimov, V., Shnyrov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature-induced+functional+and+structural+transformations+of+the+photosystem+II+oxygen-evolving+complex+in+spinach+subchloroplast+preparations.">Temperature-induced functional and structural transformations of the photosystem II oxygen-evolving complex in spinach subchloroplast preparations.</a> Biochem. Mol. Biol. Int. 35 (6), 1233-1243 (1995).</li><li>Sanina, N. M., Kostetsky, E. Y. a., Shnyrov, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calorimetric+investigation+of+phosphatidyl+choline+from+membranes+of+marine+invertebrates.">Calorimetric investigation of phosphatidyl choline from membranes of marine invertebrates.</a> J. Evol. Biokhim. Physiol. 23, 451-460 (1987).</li><li>Oreshkin, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+changes+in+the+muscle+proteins+of+cured+beef+during+heating.">Conformational changes in the muscle proteins of cured beef during heating.</a> Meat Science. 16 (4), 297-305 (1986).</li><li>Kirkitadze, M., Hu, J., Tang, M., Carpick, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Qualification+of+a+differential+scanning+calorimetry+method+for+biophysical+characterization+of+monoclonal+antibodies+and+protein+vaccine+antigens.">Qualification of a differential scanning calorimetry method for biophysical characterization of monoclonal antibodies and protein vaccine antigens.</a> Pharm. Bioprocess. 2 (6), 491-498 (2014).</li><li>Jiskoot, W., Daan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods for structural analysis of protein pharmaceuticals. 3, (2005).</li><li>Plotnikov, V. V., Brandts, M., Lin, L. N., Brandts, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+ultrasensitive+scanning+calorimeter.">A new ultrasensitive scanning calorimeter.</a> Anal. Biochem. 250 (2), 237-244 (1997).</li><li>Plotnikov, V. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+autosampling+differential+scanning+calorimeter+instrument+for+studying+molecular+interactions.">An autosampling differential scanning calorimeter instrument for studying molecular interactions.</a> Assay Drug Dev. Technol. 1 (1), 83-90 (2002).</li><li>Freire, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+scanning+calorimetry.">Differential scanning calorimetry.</a> Protein Stability and Folding: Theory and Practice. Method in Molecular Biology. 40, 191-218 (1995).</li><li>Freire, E., van Osdol, W. W., Mayorga, O. L., Sanchez-Ruiz, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calorimetrically+determined+dynamics+of+complex+unfolding+transitions+in+proteins.">Calorimetrically determined dynamics of complex unfolding transitions in proteins.</a> Annu. Rev. Biophys. Biophys. Chem. 19, 159-188 (1990).</li><li>Johnson, C. R., Morin, P. E., Arrowsmith, C. H., Freire, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermodynamic+analysis+of+the+structural+stability+of+the+tetrameric+oligomerization+domain+of+p53+tumor+suppressor.">Thermodynamic analysis of the structural stability of the tetrameric oligomerization domain of p53 tumor suppressor.</a> Biochemistry. 34 (16), 5309-5316 (1995).</li><li>Kasimova, M. R., Sam, J. M., Freire, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+conformational+equilibrium+of+human+growth+hormone.">The conformational equilibrium of human growth hormone.</a> J. Mol. Biol. 277 (2), 409-418 (1998).</li><li>Saboury, A. A., Moosavi-Movahedi, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clarification+of+calorimetric+and+van't+hoff+enthalpies+for+evaluation+of+protein+transition+states.">Clarification of calorimetric and van't hoff enthalpies for evaluation of protein transition states.</a> Biochem Edu. 22 (4), 210-211 (1994).</li><li>Privalov, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcalorimetry+of+proteins+and+their+complexes.">Microcalorimetry of proteins and their complexes.</a> Protein Structure, Stability, and Interactions. Method in Molecular Biology. 490, 1-39 (2009).</li><li>Dehghan-Nayeri, N., Rezaei-Tavirani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Interpretation+of+Protein+Structure+Through+Relationship+of+Melting+Point+(Tm)+and+Enthalpy+of+Unfolding+(&#916;HU).">The Interpretation of Protein Structure Through Relationship of Melting Point (Tm) and Enthalpy of Unfolding (&#916;HU).</a> Int J Anal Pharma Biomed Sci. 4 (1), 47-50 (2015).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+testing+of+new+drug+substances+and+products.">Stability testing of new drug substances and products.</a> Guideline, ICH Harmonised Tripartite. 1 (2), (2003).</li><li>Kjeldahl, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neue+Methode+zur+Bestimmung+des+Stickstoffs+in+organischen+K&#246;rpern+(New+method+for+the+determination+of+nitrogen+in+organic+substances).">Neue Methode zur Bestimmung des Stickstoffs in organischen K&#246;rpern (New method for the determination of nitrogen in organic substances).</a> Zeitschrift f&#252;r analytische Chemie. 22 (1), 366-383 (1883).</li><li>Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+measurement+with+the+Folin+phenol+reagent.">Protein measurement with the Folin phenol reagent.</a> J. Biol. Chem. 193 (1), 265-275 (1951).</li><li>H&#214;hne, G., Hemminger, W., Flammersheim, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Differential Scanning Calorimetry. , (2003).</li><li>Porter, L. L., George, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+thermodynamic+definition+of+protein+domains.">A thermodynamic definition of protein domains.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109 (24), 9420-9425 (2012).</li><li>Frokjaer, S., Daniel, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+drug+stability:+a+formulation+challenge.">Protein drug stability: a formulation challenge.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 4, 298-306 (2005).</li><li>Johnson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+scanning+calorimetry+as+a+tool+for+protein+folding+and+stability.">Differential scanning calorimetry as a tool for protein folding and stability.</a> Arch. Biochem. Biophys. 531, 100-109 (2013).</li><li>Chiu, M. H., Elmar, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+scanning+calorimetry:+an+invaluable+tool+for+a+detailed+thermodynamic+characterization+of+macromolecules+and+their+interactions.">Differential scanning calorimetry: an invaluable tool for a detailed thermodynamic characterization of macromolecules and their interactions.</a> J. Pharm. Bioallied Sci. 3 (1), 39-59 (2011).</li><li>Hirst, J. D., Charles, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helicity,+circular+dichroism+and+molecular+dynamics+of+proteins.">Helicity, circular dichroism and molecular dynamics of proteins.</a> J. Mol. Biol. 243 (2), 173-178 (1994).</li><li>Kirkitadze, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+modules+of+the+vaccinia+virus+complement+control+protein+are+not+in+extensive+contact.">Central modules of the vaccinia virus complement control protein are not in extensive contact.</a> Biochem. J. 344 (1), 167-175 (1999).</li><li>Freire, E., Sch&#214;n, A., Hutchins, B. M., Brown, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+denaturation+as+a+tool+in+the+formulation+optimization+of+biologics.">Chemical denaturation as a tool in the formulation optimization of biologics.</a> Drug disc today. 18 (19), 1007-1013 (2013).</li><li>Wen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+differential+scanning+calorimetry+for+thermal+stability+analysis+of+proteins:+qualification+of+DSC.">Applications of differential scanning calorimetry for thermal stability analysis of proteins: qualification of DSC.</a> J. Pharm. Sci. 101 (3), 955-964 (2012).</li></ol>

Tüm yazarlar Sanofi Pasteur çalışanları vardır. iş Sanofi Pasteur tarafından finanse edildi ve bu video-makale için yayın ücreti Sanofi Pasteur tarafından ödendi. Yazarlar hiçbir ilgili bağlılıkları ya da yazının tartışılan konu veya malzeme ile bir finansal çatışma olan herhangi bir örgüt ya da kurum ile finansal katılımı var. Bunlar istihdam, danışmanlıklar, hisse senedi sahipliği veya seçenekleri ya da telif içerir. Hiçbir yazı yardımı bu yazının üretiminde kullanılmıştır.

Bu prosedür başarıyla istikrar ve ürün karşılaştırma çalışmaları 21 dahil olmak üzere çeşitli karakterizasyon testi paketleri, dahil edilmiştir. Gerçek zamanlı stabilite çalışmalarda, DSC, raf ömrünü belirlemek için Tm&#39;ye izlemek, hem de zaman içinde biyolojik F, bir tahmin etmek için kullanılır. Ürün karşılaştırılabilirlik açısından, süreç ve tesis değişikliğinin etkilerini yanı sıra üretilen birçok yapısal konformasyon anahtar üretim aşamalarının etkisini değerlendirmek için kullanılır. Bu genellikle ideal bir ürün olarak tayin edilmiştir referans ürüne üretilen partisinin Sh doğrudan karşılaştırılmasını gerektirir. Buna ek olarak, DSC ürün formülasyon çalışmaları 37 için yararlı bir analitik araç olduğunu kanıtlamıştır. Farklı tamponlar ve farklı konsantrasyonlarda bir proteinin Tm en kararlılık proffers formülasyonu tespit etmek için kullanılabilirProtein. Bu yöntem ve sonuçlarının objektifliği güvenilirliğini sağlamak için, aynı çalışmada (örneğin, aşı formülasyonu çalışması) içinde çalıştırmak için çalışma tutarlı test parametrelerini tutmak önemlidir. Bununla birlikte, işlem çeşitli proteinlerin fiziksel özelliklerde farklılık uyum için değiştirilebilir. Yapılabilir bir modifikasyon örneği deney 38, 39 tarama hızını değiştirmektedir. Daha hızlı bir tarama oranında incelenmiştir ısıtıldığında oluşturucu agrega eğilimli olan proteinler (örneğin, 120 ° C / saat) kalorimetre kılcal tıkanma gibi termik geçiş profilinin agrega katkı önlemek için. Bu oran tarayarak bir DSC deney 38 sonucunu etkileyebilir dikkati çekiyor. Termal geçiş zirve genişletilmesi yanlısı bazı tarama oranlarının artırılması ile gözlenmiştirproteinlerinin; Ancak, Tm oldukça sabit 38 kalmıştır. Ayrıca, numune hazırlama için diyaliz ve gaz giderme adımları da doğru sonuçlar 31 için çok önemlidir. Diyaliz örnek ve tampon kompozisyonu tek fark protein sağlar; Bu şekilde, numune tarafından emilen tüm aşırı ısı proteinin ısı kapasitesi ile de ilişkilendirilebilir. Termodinamik parametre ekstrapolasyon açılımı olay sabit hacim ve basınç 31 altında oluştuğunu varsayar olarak gaz alma, hassas ses analizini sağlar. varsayım sabit basınç kısmı prosedürünün bölüm 1.1 uyarınca sisteme azot basınçlandırma ile muhasebeleştirilir. Bu dairesel dikroizm (CD) Floresans Spektroskopileri olarak protein şeklindeki stabilitesini belirlemek için diğer yöntemler ile karşılaştırıldığında, DSC bir COM bir dizi avantaj sunarmaliyet ve zaman tasarrufu da dahil olmak üzere mercial ayarı. CD ve Floresans Spektroskopileri 6 enstrümantasyon ile ölçümlere göre Birincisi, bir diferansiyel taramalı kalorimetre adyabatik tasarımı daha iyi sıcaklık hassasiyetle termal stabilite ölçümü için izin verir. İkinci olarak, CD farklı olarak, DSC verilerin doğruluğu protein 39, 40 arasında helisite bağlı değildir; Ancak, CD DSC 41 ücretsiz olacağını ikincil yapının açılımı hakkında ek bilgi sağlar. Buna ek olarak, DSC sistemin basınç örnek kaynatmadan geniş bir sıcaklık aralığı test sağlar; Bu yüzden, proteinlere geniş bir DSC ile test edilebilir. DSC biyolojik termal stabilitesini belirlemek için, nispeten hızlı ve basit bir yaklaşım olsa da, sınırlama olmadan değildir. İlk olarak, noktahat çıkarma adımı ham veri analizi, insan tutarsızlık çeşit tanıttı; Böylece sonuçlar farklılıklar, farklı kullanıcılar arasında gözlemlenebilir. İkinci olarak, diferansiyel tarama kalorimetreleri toplu üretim ölçeğinde elde etmek zor olabilir asgari konsantrasyon sınırları var. geri dönüşümsüz termal denatürasyon Üçüncüsü, Sh mutlak değildir; ki içindeki senaryolarda türetilmiş ΔG (protein kararlılığının bir göstergesi) yanıltıcı anlamına gelmektedir. Bundan başka, yöntem, saflaştınlmış numuneler için yararlıdır. Herhangi bir etkileşim olup olmadığını İnceleme proteini veya yeni bir termal geçişler görünümü ile bir etkileşim olup olmadığını yabancı maddelerin varlığı Tm bir değişikliğe neden olabilir ya da. Her durumda termogramları, bu ek özellikler yanlış böylece sonuçların yorumlanmasını etki, örnekler atfedilebilir. Bu kısıtlamalara rağmen, DSC th hakkında detaylı termodinamik bilgi verebilir güvenilir bir yöntem olmaya devamDüzgün 42 uygulanması halinde süreci açılımı e proteini. Sonuç olarak, DSC aşı ürünler ve ara ürün için bir yapısal okuma aracı olarak önemli bir avantaj sunuyor. Aynı ürünün çok bir dizi için toplanan iki parametre, Tm ve Sh, proses değişiklikleri, formülasyon, ve tersiyer yapının depolama koşulları ve protein stabilitesi etkisini incelemek için kullanılabilir ampirik taban çizgisi olabilir ve viral antijenler 21, 43.

Diferansiyel tarama kalorimetrisi (DSC) ile doğrudan düzenlenmiş bir sıcaklık değişimi, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 sırasında bir referans bir numunenin yer alan ısı enerjisi emme farkını ölçer deneysel bir yöntemdir , 10, 11, 12. Bir diferansiyel tarama kalorimetresi Yürütülen yöntem, örnek bir hücre ve aynı zamanda 2, 13 üzerine her iki hücre sıcaklığının artırılması, aynı anda da, bir referans hücresi içine ısı enerjisi sokulması içerir14. , Numune ve referans bileşim içinde fark, farklı enerji miktarı hücreleri, 2, 12, 13 sıcaklığını yükseltmek için gerekli olacaktır. Bu durumda, hücreler arasındaki sıcaklık farkı telafi etmek için gerekli olan enerji, fazla miktarı ölçülür ve doğrudan örnek 1, 3 özel termodinamik özellikleri ile bağıntılandınlabilir. 1960&#39;larda, MJ O&#39;Neil ve Perkin Elmer E. Watson katı maddelerin, 2, 3, 4, ısı akışını ölçmek için, ilk diferansiyel tarama kalorimetre geliştirdi. Buna paralel olarak, PL Privalov ve Fizik Enstitüsü, DR Monaseldze EL Gürcistan Cumhuriyeti (eski SSCB) fo kullanılabilecek eşsiz bir diferansiyel adyabatik kalorimetre yarattır biyokimyasal araştırmalar 5, 6. Daha sonra, Gürcistan Fizik Enstitüsü, Cumhuriyet de Andronikashvili ekibi, bu tür DSC 7, 8, 9 kullanarak lifli ve küresel proteinler, DNA ve RNA gibi biyomoleküllerin ısı kapasitesi bildirdi. Sturtevant 10, 11, 12, Brandts 13 ve Privalov 14, 15, 16 liderliğindeki birkaç takım protein açılımı termodinamik detaylarını araştırmak için teori ve DSC pratik uygulamaların geliştirilmesi üzerinde duruldu. Bu fajlar, kloroplast, fosfolipid, sıvı kristaller, ve et proteinler gibi büyük supramoleküler yapıları okuyan DSC değeri de 17 bildirilmiştir </<html> sup&gt;, 18, 19, 20. DSC şimdi, biyomoleküllerin ısıl kararlılık değerlendirilmesi için özellikle proteinler 1, 21, 22 ilaç araştırma ve geliştirme alanında olağan hale gelmiştir. Bu deney 23, 24 yürütmek için kullanılan aletlerin duyarlılığı ve otomasyon bakımından gelişmeler çoğunlukla kaynaklanmaktadır. Burada, DSC deney, sıcaklığın bir fonksiyonu olarak, yani molar ısı kapasitesi nihai sonucu, aşağıdaki termodinamik parametreleri tahmin etmek için kullanılır (ısı kapasitesi (ΔCp), entalpi (AH), entropi değişim (ΔS) denklemi aşağıda kullanarak ve Gibbs serbest enerjisi (ΔG)): eq1.jpg &quot;/&gt; (1) <img alt="denklem 2" src="/files/ftp_upload/55262/55262eq2.jpg" /> (2) <img alt="denklem 3" src="/files/ftp_upload/55262/55262eq3.jpg" /> (3) <img alt="denklem 4" src="/files/ftp_upload/55262/55262eq4.jpg" /> (4) <img alt="Denklem 5" src="/files/ftp_upload/55262/55262eq5.jpg" /> (5) Nerede Cp ısı kapasitesi ölçülür; q test materyalinin içine ısı akışı olduğu; T 0 ve T, sırasıyla 22, 25 geçiş ilk ve son sıcaklık dereceleridir. Bu denklemler yukarıda iki devletli geçişi ve termal tersinir 22 açılımı tabi olabilir tek alan proteinler için de geçerli olduğunu fazlalaştı. Daha karmaşık proteinler (örneğin, olmayan iki devletli protein ve oligomerler) Analizi hFriere ve arkadaşları tarafından rapor edilmiştir ave. 26; Johnson ve diğ. 27; ve Kasimova ve diğ. 28. Bir protein, iki durum geçişini maruz veya termal denatürasyon sırasında ara maddeleri oluşturur olup olmadığını belirlemek için, deneysel olarak elde edilen entalpi (AH; ayrıca şu şekilde kalorimetrik entalpi Sh Cal adlandırılır), aynı zamanda (aşağıda verilen van&#39;t Hoff denklemi kullanılarak elde edilen entalpi karşılaştırılır van&#39;t Hoff entalpi olarak anılacaktır; Sh VH): <img alt="Denklem 6" src="/files/ftp_upload/55262/55262eq6.jpg" /> (6) Tm geçişin orta noktasını sıcaklığı, R, ideal gaz sabiti (1.987 kal mol-1 K-1) ve Y, katlanmamış durumda 16, 29 protein nüfusun bölümüdür. EğerSh VH Sh Cal eşittir; veya Sh VH / Sh Cal 1&#39;e eşit olduğu, daha sonra protein bir &quot;ya hep ya hiç&quot; geçiş (yani iki devletli geçiş) 16, 25, 29 uğrar. Ancak, Sh VH Sh Cal az ise; veya Sh VH / Sh Cal protein olmayan bir iki devletli geçişi 16, 25, 29 uğrar, daha az 1&#39;dir. Sh VH / Sh Cal oranı da bir termodinamik kooperatif birimi veya etki alanı 26 olarak erir protein yapısında oranına tekabül etmektedir. ΔG ve Sh gibi yukarıda sözü edilen termodinamik parametreler biyolojik içeren proteinlerin termal stabilitesi hakkında yararlı bilgiler sağlar<html> 30. Bu protokol için bildirilen değerler Ancak, vurgu, bu yayındaki T m ve Sh üzerine döşenecek. Tm katlanmış protein kıvrımlanmamış dengede olan geçiş, (örneğin, ΔG = 0) 25, 31 orta noktası sıcaklığıdır. Termal stabilite 31 daha yüksek bir proteinin Tm kadar yüksek olur. Sh (aynı zamanda termogramı olarak da bilinir) sıcaklık grafiğidir ısı kapasitesi tepe (ler) altında kalan alan karşılık gelen DSC deneyi 16, 25 bir ucunda oluşturulan. Bu proteinleri denatüre etmek için ve bir protein formülasyondaki aktif fraksiyonu (F) tahmin etmek için de kullanılabilir gerekli enerji (yani, bir numunedeki aktif yapının proteinlerin oranı), aşağıdaki denklem kullanılarak: jove_content &quot;&gt; <img alt="Denklem 7" src="/files/ftp_upload/55262/55262eq7.jpg" /> (7) Burada Sh protein örneğinin deneysel olarak türetilmiş entalpi ve Q da iyi karakterize edilmiş referans veya standart protein 22 için belirlenen entalpisini. F a tahmini ICH 32 uyarınca stres koşullarında stabilite çalışmaları ürünlerin gerçek zamanlı istikrarı izleme yanı sıra yürütülmesi için önemlidir. Sh karşılaştırılması da bir protein 31 üçüncül yapı konformasyon kompakt hakkında bilgi sağlar. Bu protokol, bir sanayi ortamında protein termal stabilitesini değerlendirmek için bir yöntem detayları ve yoğun aşı formülasyonunda kullanılmıştır. Tekrarlanabilir sonuçlar f üreten bir otomatik diferansiyel tarama kalorimetresi kullanılarak geliştirilmiştirya da 300 ug / mL gibi düşük bir protein konsantreleri.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1375">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:331px;">Differential Scanning Calorimeter</td>
			<td style="width:188px;">Malvern Instruments Ltd</td>
			<td style="width:119px;">28428948 (Via GE Healthcare)</td>
			<td style="width:739px;">Has an autosampler for automated dispensing of samples into the cell to reduce human effort and errors.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Contrad 100</td>
			<td style="width:188px;">Decon Laboratories Inc</td>
			<td align="right" style="width:119px;">1504</td>
			<td>Dilute with water to 20% before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">500&#181;L Polypropylene round bottom 96 well plate</td>
			<td>Canadian Life Science</td>
			<td>ML072100</td>
			<td>Equivalent plates from other suppliers (e.g., VW) can also be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">MicroCal ThermoVac&#160;</td>
			<td style="width:188px;">Malvern Instruments Ltd</td>
			<td style="width:119px;">N/Ap</td>
			<td>provided with the Cap VP DSC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Biosafety cabinet&#160;</td>
			<td style="width:188px;">Labconco</td>
			<td style="width:119px;">Logic+ - A2</td>
			<td>biocontainment laminar flow cabinet for sample preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Slide-A-Lyzer dialysis cassette</td>
			<td style="width:188px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">66810 or 66380</td>
			<td>to equilibrate the sample and buffer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

differential scanning calorimetry &#8212; a method for assessing the thermal stability and conformation of protein antigen

Diferansiyel tarama kalorimetrisi (DSC), sıcaklığın bir fonksiyonu olarak numunelerin molar ısı kapasitesini ölçer analitik bir tekniktir. Protein örnekleri durumunda, DSC profilleri termal stabilitesi hakkında bilgi ve bir ölçüde yapısal konformasyonunun değerlendirmek için kullanılabilen bir yapısal &quot;parmak izi&quot; olarak işlev görür. (T m erime sıcaklığı) ve üçüncül yapısını stabilize etkileşimleri bozmak için gerekli olan enerji (entalpi, AH) proteinlerin Termal geçiş sıcaklığını ölçen bir diferansiyel tarama kalorimetresi kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Karşılaştırmalar formülasyonlar yanı sıra üretim partiler arasında yapılır ve elde edilen değerleri arasındaki farklar termal stabilite ve yapısal konformasyonunda farklılık gösterir. Stabilite çalışmaları için bir endüstriyel ortamda DSC kullanımını gösteren yanı sıra önemli üretim aşamalarının izlenmesi Veriler bu pro etkinliği kanıtı olarak sunulmaktadırtokol. protein şeklindeki termal stabilitesini değerlendirmek için, diğer yöntemlere göre, DSC ve düşük maliyetli olan birkaç örnek hazırlama adımlarını gerektirir ve aynı zamanda protein açılma işleminin tam bir termodinamik bir profil sağlar.

Kalorimetre, aslında örnek çözeltisi içine ısı akışı hızındaki fark büyüklüğüne ve 35 tampon gibi en DSC deneyleri ham veriler, sıcaklık grafiğidir bir ısı akışı olarak gösterilmiştir. Her iki hücreler (yani örnek ve referans hücreleri) bir deney sırasında aynı çözümler içeriyor, bu nedenle, tarama ham veri gözlemlenebilir zirveleri ile düz bir çizgi olmalıdır. Gözlenen herhangi bir zirve neden örnek öncesinde analiz yeterli bir sistem uygunluk testi tampon taramaları çalışan enstrümantasyon hatası (örneğin hasarlı veya kontamine hücreler), isnat edilebilir. Şekil 1 kalorimetre analizi örnek öncesinde iyi çalışır durumda olduğunu belirten tipik bir tampon tarama sonucunu göstermektedir. Şekil 2, bir DSC deneyi için ham veriler fark ile gerçekleştirilen işlemleri göstermektedirİki protein örneklerinin erent çok. Daha önce ima gibi, gözlenen zirveleri örnekleri ve kendi tamponların ısı akışı farklılıklar vardır. Numune konsantrasyonu farklılıklar kalorimetre tarafından kaydedilen ısı kapasitesi değişikliklere sebep olabilir; Ancak, bu varyasyonlar prosedür bölüm 4.2 uygun olarak örnek analizi boyunca normalleştirilir. Daha yüksek konsantrasyonlar da düşük konsantrasyonlarda geçişe katkıda almayan ek termodinamik etki ortaya çıkarabilir. Buna ek olarak, her bir geçiş proteini 36 bir ya da daha fazla sayıda yapısal alanları içerebilir termodinamik alan temsil eder. Bu durumda, protein 1 işbirliği erime üzere üç yapısal alana sahiptir. Şekil 3 temel çıkarma ve mükerrer eğri fi sonra, yani Şekil 2&#39;de, sunulan protein 1 ve 2 için ham verilerin analizinde elde edilen sonuçları göstermektedirtting. Ortaya çıkan termogramlar oranının taranması için normalize edilmiş ve konsantrasyon (otomatik olarak önceden ayarlanmış analiz yazılımı algoritması tarafından yürütülen); böylece, sıcaklık grafikleri karşı karşılaştırılabilir ısı kapasitesi deney sonuçlarını sunma. Analiz yazılımı açılımı proteinin işbirliğinden bağlı Yukarıda verilen denklemler varyasyonları kullanan diğer termodinamik parametreler elde etmek, bu tür T m ve ΔCp olarak sıcaklık grafikler, karşı ısı kapasitesi verileri kullanır. ayarı, bilinmeyen örnekler test ederken uygun sıcaklık aralığı önemlidir. Şekil 4&#39;te gösterildiği gibi, Aksi takdirde, tam olmayan termogramlar, neden olabilir. Bu profillerden Tm elde edilebilir olsa da, Sh doğru bir şekilde tespit edilemez. Bu nedenle, örnek tamamen ısı geçişi yakalamak için daha büyük bir sıcaklık aralığı ile yeniden test edilmesi gereklidir. Bazı proteinler de yenidenadily formu artan sonrası geçiş ısı kapasitesi sonuçlanan tam denatürasyon sonra agrega: Şekil 2B gösterildiği gibi bu genellikle eksik termogramı olarak görünür. Ancak, daha yüksek bir son sıcaklığı ile yeniden test var termogramın o bölgede bir yapısal geçiş bir olay ya da protein agrega sadece ısı emici etkisi olup olmadığını teyit yardımcı olabilir. Termal stabilite endüstrisinde 37 protein ve protein bazlı ürünlerin en önemli fiziksel özelliklerden biri olan. ilaç olarak, formülasyon tampon ve nem ve sıcaklık gibi çevresel faktörlerin de dahil olmak üzere, farklı koşullar altında biyolojik kararlılığını belirlemek için kullanılır. Aynı zamanda üretim partiler arasında yapısal tutarlılığı sağlamak için önemli üretim aşamasını (örneğin, arıtma ve detoksifikasyon) izlemek için kullanılır. <strong<html> &gt; 5 Şekiller ve 6 kararlılık ve iki farklı proteinin yapısal konformasyon sırasıyla kimyasal detoksifikasyon ve saklama koşulları etkisini incelemek için DSC kullanımını göstermektedir. Tm ve Sh önemli farklılıklar sırasıyla yapısal değişiklikler ve protein parçalanmasını gösterir. Buna ek olarak, Şekil 6 üçüncü geçiş kaybı, bundan başka (örnekler, çok açılı bir ışık saçılım (sek-MALS) ile boyut dışlama kromatografisi ile analiz edildiğinde molekül ağırlığında bir azalma ile doğrulandı bir etki nin degradasyonunu göstermektedir veri gösterilemiyor). <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/55262/55262fig1.jpg" /> Şekil 1: Tampon tarar. gözlemlenebilir zirveleri ile her tarama degrade benzerlik enstrüman iyi çalışır durumda olduğunu ve tekrarlanabilir sonuçlar oluşturduğunu gösterir.//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55262/55262fig1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/55262/55262fig2.jpg" /> Şekil 2: DSC Deneyler toplanan ham veriler. Bu grafikler (yani önce bazal çıkarma ve eğri uydurma kadar) deneysel çalıştıktan sonra edinilen unanalyzed (ham) veri iyi temsilidir. Her satır bir üretim yeri temsil eder. Protein 2 termogramı sonrası geçiş bölgesinde, 100 ° C&#39;nin üzerinde bir ısı kapasitesinde artış ile sonuçlanan, ısıtma üzerine hali hazırda daha araya eğilimindedir. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55262/55262fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/55262/55262fig3.jpg" /><br/&gt; Şekil 3: DSC Veri Analiz. Bu grafikler (yani bazal çıkarma ve eğri uydurma sonra) analiz DSC verilerinin iyi temsilidir. Kırmızı çizgi termogramı için en uygun eğriyi temsil ederken mavi çizgi, bazal çıkarma sonra termogramı temsil eder. (A) Protein 1 Numune # 12 Tm ve Sh 80,16 ° C ve sırasıyla 1.69 x 10 6 cal / mol vardır. (B) Protein 1 Numune # 13 Tm ve Sh 80,15 ° C ve sırasıyla 1.71 x 10 6 cal / mol vardır. (C) Protein 2 Örnek # 21 Tm ve Sh 75.01 ° C ve sırasıyla 4.08 x 10 6 cal / mol vardır. (D) Protein 2 Örnek # 22 Tm ve Sh 75,67 ° C ve sırasıyla 4.22 x 10 6 cal / mol vardır. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55262/55262fig3large.jpg" target="_blank">Için tıklayınız</a>Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/55262/55262fig4.jpg" /> Şekil 4: Bir Eksik termogramını göstermektedir. Ham veri yetersiz sıcaklık aralığında analiz Protein 1 toplamak. Deneyin nihai sıcaklık 120 ° C olarak ayarlandı Şekil 2A için deney ile karşılaştırıldığında proteinin tüm geçiş profili uyum yoktu 90 ° C&#39;ye ayarlandı. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55262/55262fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/55262/55262fig5.jpg" /> Şekil 5: Veri protein 1. (A) proteini 1 tertier yapısı üzerinde kimyasal detoksifıkasyon etkisini gösteren Analiz hektar naif konformasyonuna ve bir toksin olduğu,2.57 x 10 5 cal / mol onun T 56.84 ° C&#39;de m Sh s. (B) Protein 1 (yani toksoid) ve detoksifiye şekli sırasıyla T m ve 81,01 ° C Sh değerlerini ve 1.89 x 10 6 cal / mol vardır. Nedenle, detoksifikasyon adım, detoksifıye edilmiş formuna daha fazla istikrar (daha yüksek Tm) sağlayan proteini 1 yapısal konformasyona varyasyon şekli getirmiştir sonucuna varılabilir. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55262/55262fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 6," src="/files/ftp_upload/55262/55262fig6.jpg" /> Şekil 6: Bu grafikler, depolama sıcaklığının etkisini göstermektedir veri Protein 3. konformasyon üzerinde saklama koşullarının etkisi gösteren Analiz (2-8 ° C) denge ve Pro tertier yapısına3 30 hafta boyunca tein. Tm ve 8. (A) Protein 3 ve depolama 38. haftada (B) Sh değerleri, aşağıdaki Tablo 1 &#39;de verilmiştir. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55262/55262fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Numune </td><td> Tm 1 (° C) </td><td> Sh 1 (cal / mol) </td><td> Tm 2 (° C) </td><td> Sh 2 (cal / mol) </td><td> Tm 3 (° C) </td><td> Sh 3 (cal / mol) </td></tr><tr><td> Protein, 3 8 hafta boyunca, 2-8 ° C&#39;de saklandı </td><td> 61.91 </td><td> 1.71 x 10 5 </td><td> 75,54 </td><td> 2.17 x 10 5 </td><td> 90,29 </td><td> 4.17 x 10 5 </td></tr><tr><td&gt; Protein 3 38 hafta boyunca 2-8 ° C&#39;de saklandı </td><td> 61,87 </td><td> 1.66 x 10 5 </td><td> 75,18 </td><td> 1.46 x 10 5 </td><td> 90.22 </td><td> 5.76 x 10 5 </td></tr></tbody></table> Tablo 1: 2 de depolama 8. ve 38. Haftasında Protein 3 Tm ve Sh Değerler - 8 ° C. Her iki zaman noktasında Tm değerleri benzer olmakla birlikte, Sh değerlerindeki fark Protein 3 tertiyer yapısı ile belirlenen saklama koşulu altında 30 hafta boyunca düştüğünü göstermektedir.

Watch this Scientific Journal Video about Differential Scanning Calorimetry Ã¢â‚¬â€ A Method for Assessing the Thermal Stability and Conformation of Protein Antigen at JoVE.com

Differential Scanning Calorimetry &#8212; A Method for Assessing the Thermal Stability and Conformation of Protein Antigen

Diferansiyel tarama kalorimetrisi, bir proteinin denatüre edilmesi gerekli ısı geçiş sıcaklığına (ler) ve toplam ısı enerjisini ölçer. elde edilen sonuçlar, aşı formülasyonlarında protein antijenlerinin termal stabilitesini değerlendirmek için kullanılır.

Diferansiyel Taramalı Kalorimetre - Protein Antigen Termal İstikrar ve Yapısının Değerlendirilmesi Bir Yöntem

Differential scanning calorimetry (DSC) is an analytical technique that measures the molar heat capacity of samples as a function of temperature. In the ...

differential-scanning-calorimetry-method-for-assessing-thermal

Nanyang Technological University

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Physics

Biochemistry

Unit 1

The First Law of Thermodynamics

SCIENTISTS IN ACTION

38.6K Görüntüleme.  Sanofi Pasteur Limited.  Diferansiyel tarama kalorimetrisi, bir proteinin denatüre edilmesi gerekli ısı geçiş sıcaklığına (ler) ve toplam ısı enerjisini ölçer. elde edilen sonuçlar, aşı formülasyonlarında protein antijenlerinin termal stabilitesini değerlendirmek için kullanılır. 

Video: Differential Scanning Calorimetry — A Method for Assessing the Thermal Stability and Conformation of Protein Antigen

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the excitability of neurons. The subcellular distribution of these channels in pyramidal neurons of hippocampal area CA1 is regulated by tetratricopeptide repeat-containing Rab8b interacting protein (TRIP8b), an auxiliary subunit. Genetic knockout of HCN pore forming subunits or TRIP8b, both lead to an increase in antidepressant-like behavior, suggesting that limiting the function of HCN channels may be useful as a treatment for Major Depressive Disorder (MDD). Despite significant therapeutic interest, HCN channels are also expressed in the heart, where they regulate rhythmicity. To circumvent off-target issues associated with blocking cardiac HCN channels, our lab has recently proposed targeting the protein-protein interaction between HCN and TRIP8b in order to specifically disrupt HCN channel function in the brain. TRIP8b binds to HCN pore forming subunits at two distinct interaction sites, although here the focus is on the interaction between the tetratricopeptide repeat (TPR) domains of TRIP8b and the C terminal tail of HCN1. In this protocol, an expanded description of a method for purifying TRIP8b and executing a high throughput screen to identify small molecule inhibitors of the interaction between HCN and TRIP8b, is described. The method for high throughput screening utilizes a Fluorescence Polarization (FP) -based assay to monitor the binding of a large TRIP8b fragment to a fluorophore-tagged eleven amino acid peptide corresponding to the HCN1 C terminal tail. This method allows &#39;hit&#39; compounds to be identified based on the change in the polarization of emitted light. Validation assays are then performed to ensure that &#39;hit&#39; compounds are not artifactual.

The interaction between HCN channels and their auxiliary subunit has been identified as a therapeutic target in Major Depressive Disorder. Here, a fluorescence polarization-based method for identifying small molecule inhibitors of this protein-protein interaction, is presented.

Yöntem HCN1 ve TRIP8b arasında protein-protein etkileşimi küçük molekül önleyicilerinin tespit edilmesi için

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Biyokimya

A Rapid Laser Probing Method Facilitates the Non-invasive and Contact-free Determination of Leaf Thermal Properties

Plants can produce valuable substances such as secondary metabolites and recombinant proteins. The purification of the latter from plant biomass can be streamlined by heat treatment (blanching). A blanching apparatus can be designed more precisely if the thermal properties of the leaves are known in detail, i.e., the specific heat capacity and thermal conductivity. The measurement of these properties is time consuming and labor intensive, and usually requires invasive methods that contact the sample directly. This can reduce the product yield and may be incompatible with containment requirements, e.g., in the context of good manufacturing practice. To address these issues, a non-invasive, contact-free method was developed that determines the specific heat capacity and thermal conductivity of an intact plant leaf in about one minute. The method involves the application of a short laser pulse of defined length and intensity to a small area of the leaf sample, causing a temperature increase that is measured using a near infrared sensor. The temperature increase is combined with known leaf properties (thickness and density) to determine the specific heat capacity. The thermal conductivity is then calculated based on the profile of the subsequent temperature decline, taking thermal radiation and convective heat transfer into account. The associated calculations and critical aspects of sample handling are discussed.

A method was developed to determine the specific heat capacity and thermal conductivity of leaf tissue by non-invasive, contact-free near infrared laser probing, which requires less than 1 min per sample.

Bir Rapid Lazer Yöntemi Yaprak Termal Özelliklerinin non-invazif ve İletişim serbest Tayini kolaylaştırır Probing

Plants can produce valuable substances such as secondary metabolites and recombinant proteins. The purification of the latter from plant biomass can be ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating these studies, reincorporation of detergent-solubilized membrane proteins into liposomes is a stochastic process where protein topology is impossible to enforce. This paper offers an alternative method to these challenging techniques that utilizes a liposome-based scaffold. Protein solubility is enhanced by deletion of the transmembrane domain, and these amino acids are replaced with a tethering moiety, such as a His-tag. This tether interacts with an anchoring group (Ni2+ coordinated by nitrilotriacetic acid (NTA(Ni2+)) for His-tagged proteins), which enforces a uniform protein topology at the surface of the liposome. An example is presented wherein the interaction between Dynamin-related protein 1 (Drp1) with an integral membrane protein, Mitochondrial Fission Factor (Mff), was investigated using this scaffold liposome method. In this work, we have demonstrated the ability of Mff to efficiently recruit soluble Drp1 to the surface of liposomes, which stimulated its GTPase activity. Moreover, Drp1 was able to tubulate the Mff-decorated lipid template in the presence of specific lipids. This example demonstrates the effectiveness of scaffold liposomes using structural and functional assays and highlights the role of Mff in regulating Drp1 activity.

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

This paper describes a method for assessing the interactions and assemblies of integral membrane proteins in vitro with various partner factors in a lipid-proximal environment.

İskele Lipozomlar kullanarak Lipid-proksimal protein-protein etkileşimleri Sulandırın için<em&gt; İn Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

A Protein Preparation Method for the High-throughput Identification of Proteins Interacting with a Nuclear Cofactor Using LC-MS/MS Analysis

Transcriptional coregulators are vital to the efficient transcriptional regulation of nuclear chromatin structure. Coregulators play a variety of roles in regulating transcription. These include the direct interaction with transcription factors, the covalent modification of histones and other proteins, and the occasional chromatin conformation alteration. Accordingly, establishing relatively quick methods for identifying proteins that interact within this network is crucial to enhancing our understanding of the underlying regulatory mechanisms. LC-MS/MS-mediated protein binding partner identification is a validated technique used to analyze protein-protein interactions. By immunoprecipitating a previously-identified member of a protein complex with an antibody (occasionally with an antibody for a tagged protein), it is possible to identify its unknown protein interactions via mass spectrometry analysis. Here, we present a method of protein preparation for the LC-MS/MS-mediated high-throughput identification of protein interactions involving nuclear cofactors and their binding partners. This method allows for a better understanding of the transcriptional regulatory mechanisms of the targeted nuclear factors.

We have established a method for the purification of coregulatory interaction proteins using the LC-MS/MS system.

LC-MS / MS Analizi Nükleer kofaktör ile etkileşimde proteinlerin yüksek verimli belirlenmesi için bir protein Hazırlama Yöntemi

Transcriptional coregulators are vital to the efficient transcriptional regulation of nuclear chromatin structure. Coregulators play a variety of roles in ...

Multimer-PAGE: A Method for Capturing and Resolving Protein Complexes in Biological Samples

There are many well-developed methods for purifying and studying single proteins and peptides. However, most cellular functions are carried out by networks of interacting protein complexes, which are often difficult to investigate because their binding is non-covalent and easily perturbed by purification techniques. This work describes a method of stabilizing and separating native protein complexes from unmodified tissue using two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis. Tissue lysate is loaded onto a non-denaturing blue-native polyacrylamide gel, then an electric current is applied until the protein migrates a short distance into the gel. The gel strip containing the migrated protein is then excised and incubated with the amine-reactive cross-linking reagent dithiobis(succinimidyl propionate), which covalently stabilizes protein complexes. The gel strip containing cross-linked complexes is then cast into a sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel, and the complexes are separated completely. The method relies on techniques and materials familiar to most molecular biologists, meaning it is inexpensive and easy to learn. While it is limited in its ability to adequately separate extremely large complexes, and has not been universally successful, the method was able to capture a wide variety of well-studied complexes, and is likely applicable to many systems of interest.

A method for stabilizing and separating native protein complexes from unmodified tissue lysate using an amine-reactive protein cross-linker coupled to a novel two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) system is presented.

Multimer-PAGE: Biyolojik örnekler olarak yakalamak için bir yöntem ve özümleme protein kompleksleri

There are many well-developed methods for purifying and studying single proteins and peptides. However, most cellular functions are carried out by ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. Hydrogen-Deuterium Exchange (HDX) measured at rapid time scales is uniquely suited to detect structures and hydrogen bonding networks that are briefly populated, allowing for the characterization of transient conformers in native ensembles. Coupling of HDX to mass spectrometry offers several key advantages, including high sensitivity, low sample consumption and no restriction on protein size. This technique has advanced greatly in the last several decades, including the ability to monitor HDX labeling times on the millisecond time scale. In addition, by incorporating the HDX workflow onto a microfluidic platform housing an acidic protease microreactor, we are able to localize dynamic properties at the peptide level. In this study, Time-Resolved ElectroSpray Ionization Mass Spectrometry (TRESI-MS) coupled to HDX was used to provide a detailed picture of residual structure in the tau protein, as well as the conformational shifts induced upon hyperphosphorylation.

Conformational flexibility plays a critical role in protein function. Herein, we describe the use of time-resolved electrospray ionization mass spectrometry coupled to hydrogen-deuterium exchange for probing the rapid structural changes that drive function in ordered and disordered proteins.

Zaman çözülmesi elektro sprey iyonizasyon Hidrojen-döteryum Değişim Kütle Spektrometre Protein Yapısı ve Dinamikleri incelenmesi için

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

A Colorimetric Method for Measuring Iron Content in Plants

Iron, one of the most important micronutrients in living organisms, is involved in basic processes, such as respiration and photosynthesis. Iron content is rather low in all organisms, amounting in plants to about 0.009% of dry weight. To date, one of the most accurate methods for measuring iron concentration in plant tissues is flame absorption atomic spectroscopy. However, this approach is time-consuming and expensive and requires specific equipment not commonly found in plant laboratories. Therefore, a simpler, yet accurate method that can be routinely used is needed. The colorimetric Prussian Blue method is regularly used for qualitative iron staining in animal and plant histological sections. In this study, we adapted the Prussian Blue method for quantitative measurements of iron in tobacco leaves. We validated the accuracy of this method using both atomic spectroscopy and Prussian Blue staining to measure iron content in the same samples and found a linear regression (R2 = 0.988) between the two procedures. We conclude that the Prussian Blue method for quantitative iron measurement in plant tissues is precise, simple, and inexpensive. However, the linear regression presented here may not be appropriate for other plant species, due to potential interactions between the sample and the reagent. Establishment of a regression curve is thus needed for different plant species.

We present a simple and reliable protocol for measuring iron content in plant tissues using the colorimetric Prussian Blue method.

Demir içeriği tesislerinde ölçme kolorimetrik yöntemi

Iron, one of the most important micronutrients in living organisms, is involved in basic processes, such as respiration and photosynthesis. Iron content ...

Assessing the Viability of a Synthetic Bacterial Consortium on the In Vitro Gut Host-microbe Interface

The interplay between host and microbiota has been long recognized and extensively described. The mouth is similar to other sections of the gastrointestinal tract, as resident microbiota occurs and prevents colonisation by exogenous bacteria. Indeed, more than 600 species of bacteria are found in the oral cavity, and a single individual may carry around 100 different at any time. Oral bacteria possess the ability to adhere to the various niches in the oral ecosystem, thus becoming integrated within the resident microbial communities, and favouring growth and survival. However, the flow of bacteria into the gut during swallowing has been proposed to disturb the balance of the gut microbiota. In fact, oral administration of P. gingivalis shifted bacterial composition in the ileal microflora. We used a synthetic community as a simplified representation of the natural oral ecosystem, to elucidate the survival and viability of oral bacteria subjected to simulated gastrointestinal transit conditions. Fourteen species were selected, subjected to in vitro salivary, gastric, and intestinal digestion processes, and presented to a multicompartment cell model containing Caco-2 and HT29-MTX cells to simulate the gut mucosal epithelium. This model served to unravel the impact of swallowed bacteria on cells involved in the enterohepatic circulation. Using synthetic communities allows for controllability and reproducibility. Thus, this methodology can be adapted to assess pathogen viability and subsequent inflammation-associated changes, colonization capacity of probiotic mixtures, and ultimately, potential bacterial impact on the presystemic circulation.

Assessing the Viability of a Synthetic Bacterial Consortium on the In Vitro Gut Host-microbe Interface

Gut host-microbe interactions were assessed using a novel approach combining a synthetic oral community, in vitro gastrointestinal digestion, and a model of the small intestine epithelium. We present a method that can be adapted to evaluate cell invasion of pathogens and multi-species biofilms, or even to test probiotic formulations&#39; survivability.

Sentetik bir bakteriyel konsorsiyum Vitro Gut ana bilgisayar-mikrop arabirimde canlılık değerlendirilmesi

The interplay between host and microbiota has been long recognized and extensively described. The mouth is similar to other sections of the ...

How to Stabilize Protein: Stability Screens for Thermal Shift Assays and Nano Differential Scanning Fluorimetry in the Virus-X Project

The Horizon2020 Virus-X project was established in 2015 to explore the virosphere of selected extreme biotopes and discover novel viral proteins. To evaluate the potential biotechnical value of these proteins, the analysis of protein structures and functions is a central challenge in this program. The stability of protein sample is essential to provide meaningful assay results and increase the crystallizability of the targets. The thermal shift assay (TSA), a fluorescence-based technique, is established as a popular method for optimizing the conditions for protein stability in high-throughput. In TSAs, the employed fluorophores are extrinsic, environmentally-sensitive dyes. An alternative, similar technique is nano differential scanning fluorimetry (nanoDSF), which relies on protein native fluorescence. We present here a novel osmolyte screen, a 96-condition screen of organic additives designed to guide crystallization trials through preliminary TSA experiments. Together with previously-developed pH and salt screens, the set of three screens provides a comprehensive analysis of protein stability in a wide range of buffer systems and additives. The utility of the screens is demonstrated in the TSA and nanoDSF analysis of lysozyme and Protein X, a target protein of the Virus-X project.

A protocol is presented to rapidly test the thermal stability of proteins in a variety of conditions through thermal shift assays and nano differential scanning fluorimetry. Buffer systems, salts and additives, together comprising three unique stability screens, are assayed with proteins to identify suitable buffers for functional and structural studies.

Protein dengelemek nasıl: istikrar ekranlar için termal kayması deneyleri ve Nano diferansiyel Fluorimetry virüs-X projede tarama

The Horizon2020 Virus-X project was established in 2015 to explore the virosphere of selected extreme biotopes and discover novel viral proteins. To ...

Human Peripheral Blood Neutrophil Isolation for Interrogating the Parkinson's Associated LRRK2 Kinase Pathway by Assessing Rab10 Phosphorylation

The leucine rich repeat kinase 2 (LRRK2) is the most frequently mutated gene in hereditary Parkinson&#8217; disease (PD) and all pathogenic LRRK2 mutations result in hyperactivation of its kinase function. Here, we describe an easy and robust assay to quantify LRRK2 kinase pathway activity in human peripheral blood neutrophils by measuring LRRK2-controlled phosphorylation of one of its physiological substrates, Rab10 at threonine 73. The immunoblotting analysis described requires a fully selective and phosphospecific antibody that recognizes the Rab10 Thr73 epitope phosphorylated by LRRK2, such as the MJFF-pRab10 rabbit monoclonal antibody. It uses human peripheral blood neutrophils, because peripheral blood is easily accessible and neutrophils are an abundant and homogenous constituent. Importantly, neutrophils express relatively high levels of both LRRK2 and Rab10. A potential drawback of neutrophils is their high intrinsic serine protease activity, which necessitates the use of very potent protease inhibitors such as the organophosphorus neurotoxin diisopropylfluorophosphate (DIFP) as part of the lysis buffer. Nevertheless, neutrophils are a valuable resource for research into LRRK2 kinase pathway activity in vivo and should be considered for inclusion into PD biorepository collections.

Mutations in the leucine rich repeat kinase 2 gene (LRRK2) cause hereditary Parkinson&#8217;s disease. We have developed an easy and robust method for assessing LRRK2-controlled phosphorylation of Rab10 in human peripheral blood neutrophils. This may help identify individuals with increased LRRK2 kinase pathway activity.