Bu prosedürün genel amacı Yüzme Kaynaklı Felç veya SWIP göstermektir, C.elegans dopamin sinyalizasyon değerlendirmek için bir davranışsal tedavi. SWIP içinde veya dopaminerjik sinaps ile ilgili genlerin hızlı bir şekilde tanımlanmasını sağlar. Bu yöntem, örneğin ilaçlar veya dopamin taşıyıcı mutasyonlar neden olduğu ekstrasellüler dopamin aşırı tarafından üretilen etkilerin araştırılmasını sağlar.
Test sırasında test edilen tüm solucanların aynı süre boyunca yüzmesini sağlamak için hayvanların çözeltiye hızlı bir şekilde aktarılması gerekir. Prosedürü gösteren Sirisha Kudumala ve Serene Sossi olacaktır. İkisi de laboratuvarımda çalışıyor.
Solucan başlangıç kültürleri kurmak için, iyi beslenen C.elegans içeren bir tabak agar küçük parçalar kesmek ve bireysel NA22 E.coli plakalar içine agar parçaları aktarmak için steril bir spatula kullanın. Plakaları 3-4 gün boyunca 20 derecede kuluçkaya yattıktan sonra, stereo mikroskop altında gravid yetişkinlerin varlığını görsel olarak doğrulayın. Senkronize bir solucan popülasyonu elde etmek için, gravid yetişkinlerle dolu bir tabağa su fışkırtın.
Solucanları yerinden çıkarmak için plakayı hafifçe döndürün ve solucanları 15 mililitrelik polistiren konik bir tüpe aktarmak için bir bertaraf pipeti kullanın. Solucanları ikinci bir plakadan tüpe çektikten sonra, solucanları yıkama başına 15 mililitre otoklavlı su da üç yıkama için santrifüj ile toplayın. Su son yıkamadan sonra berrak görünmelidir.
Son santrifüjden sonra, solucanlara taze hazırlanmış sodyum hipoklorür sodyum hidroksit çözeltisinin beş mililitresini ekleyin ve bir girdap ile hızla karıştırın. Tüpü bir kayanın üzerine yerleştirin, bir damla solucan çözeltisini cam mikroskop kaydıranın üzerine yerleştirin ve dört ila sekiz dakika boyunca her iki dakikada bir stereoskop altında solucan lysis'i kontrol edin. Solucanların yaklaşık %70'i lysed ve yumurtalar serbest bırakıldığında, yumurta tamponu ilavesi ile hemen lysis durdurun.
Sonra embriyolar ve solucan leşleri dört kez kalan çamaşır suyu kaldırmak için yıkar arasında taze yumurta tampon ile pelet resuspending santrifüj. Son yıkamadan sonra, pelet beyaz görünmelidir. Otoklaved su beş mililitre pelet resuspend ve% 60 sakaroz beş mililitre santrifüj ile karkas lardan embriyoları ayırmak için.
Yoğunluk gradyan ayrımından sonra tüpü santrifüjden dikkatlice çıkarın ve üst menisküste yüzen embriyoların 3-4 mililitresini yeni bir 15 mililitrelik konik tüpe aktarmak için cam pasteur pipetkullanın. Sakaroz ve ardından M9 tamponunda üç yıkama yıkama kaldırmak için embriyoları otoklavlı suile üç kez yıkayın. Son yıkamadan sonra, yumurtaların yumurtadan çıkması ve L1 larva evresinde kalması için embriyoları bir gecede 10 mililitre taze M9 tamponu yla çalkalayın.
Shaker üzerinde en fazla 14 saat sonra, larvalar tarafından yayımlanan herhangi bir feromonları kaldırmak ve su bir mililitre larva resuspend otoklav ile üç kez L1 larvaları yıkayın. Solucanların bir aliquot'unu 1'den 10'a kadar seyreltin ve cam bir kaydıra 1:10 mikrolitre damla ekleyin ve solucanları stereo mikroskop altında sayın. Ortalama solucan sayısı elde etmek için tekrarlayın.
Bir oda sıcaklığında NA22 plaka üzerine solucan çözeltisi yeterli damlacıkları eklemek için bir pipet kullanın kültür için üçüncü solucanlar için yaklaşık bir kez 10 tohum ve damlalar kuruyana kadar plaka yarısı açık bırakın. Daha sonra plakayı kapalı ve baş aşağı 20 derecede yaklaşık 44 ila 48 saat veya solucanlar stereo mikroskop altında görsel olarak doğrulanan geç L4 aşamasına ulaşana kadar kuluçkaya yatırın. SWIP'nin manuel değerlendirmesi için, 0,5 milimolar amfetaminli veya olmayan 40 mikrolitre kontrol çözeltisini cam nokta plakaya ekleyin.
Stereoskop altında, kirpik küremi ile 8 ila 10 geç L4 sahne solucanları seçin ve solucanlar pick hareket ve çözüm içine yüzmek kadar çözüm içeren kuyuda pick batırın. Zamanlayıcıyı çalıştırın. Kuyuya salınan solucan sayısını not edin ve her dakika işaretinde Toplam 10 dakika boyunca SWIP gösteren solucan sayısını gözlemleyin ve kaydedin.
Yordamın sonunda, ham verileri bir elektronik tabloya kopyalayın ve her dakika felç olan solucan sayısını, test edilen toplam solucan sayısına bölerek ve 100 ile çarparak felç olan solucanların yüzdesini hesaplayın. Yüzde değerlerini herhangi bir grafik ve istatistiksel yazılıma kopyalayın ve XY grafik biçimini kullanarak verileri y ekseninde Y ekseninde ve x ekseninde zaman üzerinde SWIP yüzde değerleriyle çizin. Kontrol ve amfetamin ile tedavi edilen gruplar arasında istatistiksel analiz ve tedavi süresi, örneğin iki yönlü ANOVA ve post hoc analizi kullanılarak yapılabilir.
Yüzmekaynaklı felcin otomatik analizi için, izleme yazılımı analizini çalıştırmak için kamerayı, solucan izci yazılımını ve komut dosyasını ayarlayın ve daha önce gösterildiği gibi tek bir geç aşama L4 solucanını cam nokta plakaya yerleştirmek için kirpik çekme kullanın. Daha sonra bir seferde bir solucanın yüzme videolarını kaydedin ve solucan bükme frekansını hesaplamak için solucan izci yazılımını kullanın, solucan dövme frekansını elde etmek için izleme yazılımıyla sağlanan komut dosyasını takip edin ve solucan dövme verilerinden ısı haritaları oluşturun. Kontrol çözeltisinde test edilen solucanların çoğu en az 10 dakika boyunca sürekli yüzer.
Kontrol veya amfetamin maruz solucanlar gözlem in ilk dakikasında SWIP göstermez. Ancak, kontrol solüsyonu ile tedavi edilen solucanlar 10 dakika boyunca yüzmeye devam ederken, amfetamin ile tedavi edilen solucanlar iki dakikalık tedaviden sonra SWIP sergilemeye başlar. Ve 10 dakika sonra, hayvanların %66'sı SWIP gösteriyor.
Burada kontrole veya amfetamine maruz kalan hayvanların ısı haritalarına ait örnekler, amfetamin le tedavi edilen hayvanlarda gözlenen felçte beklenen önemli bir artışla gösterilmiştir. Bu titreyi denemeden önce, C.elegans toplama ve gelişimsel evreleme ile iyi tanışmalıdır. SWIP davranışında dopaminerjik sistemin tutulumu dopaminerjik proteinlerin ekspresyonu olmayan hayvanlar veya Reserpine ile dopamin veziküllerinin tükenmesi ile doğrulanmalıdır.
SWIP dopaminerjik sinaps etki eden ilaçların etki mekanizmasında yer alan yeni proteinlerin belirlenmesinde etkili olabilir.
