Deneysel idrar yolu enfeksiyonları veya İye'ler verilmiş farelerde hücre içi bakteri toplulukları veya IBT'ler gözlenmiştir. Ayrıca insan İye hastalarının idrar çökeltilerinde de görüldüler. Bugün tanımladığımız teknik, tek IPC'leri deneysel olarak enfekte olmuş farelerden ayırmanın bir yolu.
Ağız mikropipetleme tekniği enfekte fare mesanelerinden hücre içi bakterileri izole etmek için mevcut tek tekniktir. Cam ağız pipetleri hazırlamak için, cam kılcal bir tüpün her iki ucunu da sıkıca çimdikler ve tüpün ortasını açık alev kaynağı üzerinden ekseni boyunca ileri geri eşit şekilde döndürün. Cam yumuşadığında, kılcal damarı ısı kaynağından çıkarın ve camı hemen ayırın.
Çekilen kılcal damar ideal son uzunluğu tek mesane epitel hücreleri izole etmek için uygun bir iç çapı sağlamak için bir çekilmemiş kılcal daha uzun 3-5 santimetre daha uzundur. Cam soğuduğunda, cam kılcal damarortasının daha dar olup olmadığını ve tüpün iç kısmı hala boş olup olmadığını kontrol edin. Bir eliyle çekilen kılcal damarın büyük ucunu toplayarak, kılcal damarı en dar noktasında kavramak için forseps kullanın, forsepslerin kılcal damarı ezmeden sıkıca kavrayabilmek için yeterli güçle kullanılmasını sağlar.
En dar noktada çekilen kılcal damarı tutturmak için forsepsleri hızla bükün. Daha sonra, 100 milimetre Petri kabına ağız mikropipet büyüklüğünde kılcal yerleştirin ve UV 30 dakika boyunca kabı sterilize. Mesane hasat için, supine pozisyonda bir fare yerleştirin ve% 70 etanol ile karın bölgesisterilize.
Etanol sterilize edilmiş enstazı ve cerrahi makas kullanarak, üretral açıklık üzerinde bir santimetre lik bir enine deri kesi yapmak ve periton içeriğini ortaya çıkarır farenin tüm ön boyunca V şeklinde bir kesim oluşturmak için farenin üst ekstremitedoğru çapraz kesi genişletmek. Yeni sterilize araçları kullanarak, farenin pelvik bölgesine yakın yağ pedlerini hafifçe aşağı doğru itin ve mesanenin çıkıntı ya da apex'teki maruz kalan mesanenin kavrağı nın bozulmasına neden olur. Mesane üzerinde sıkı bir kavrama tutulması, mesane serbest etmek için üreter ve üretra kesilmiş ve sadece kesici mesane nin açılması içine yuvarlak forceps bir şaft ucu eklemek.
Apeks ikavrama ve yuvarlak forseps neredeyse tamamen kapalı tutmak forseps serbest, yavaşça yuvarlak forseps uzak mesane ağzının dış ucunu çekmek için forseps ikinci bir çift kullanın ve yuvarlak forseps diğer ucu üzerinde mesane içinde dışarı açmak için. Daha sonra, ters mesanenin ucundan ters mesaneye soğuk PBS mililitresine yavaşça ikna etmek için ikinci çift forceps'ü kullanın. Ve ters mesanenin dışındaki iç epitel hücre tabakasını iki çift temiz çertel ile nazikçe kazıyın.
Tüm hücreler kazındığında, çekilen cam kılcal damarın çekilmemiş ucunu bir aspiratör tüpünün kauçuk fişe takın ve bir mililitrelik pipet ucunun dar ucunu tüpün diğer açık ucuna sıkıca yerleştirin. İki mililitrelik kesme pipetinin dar ucunu bir mililitrelik pipet ucunun açık, daha geniş ucuna sıkıca yerleştirin ve kazınmış hücre süspansiyonunu bir diseksiyon mikroskobunun altına yerleştirin. 20 ila 40 X büyütme kullanarak, IbC'leri büyük floresan agregalar olarak tanımlayın ve cam kılcal damarın ince ucunu, kapiller eylem yoluyla istenmeyen hacim alımını azaltmak için bir saniye liğine taze bir PBS tüpüne batırın.
Bir IBC ilgi bulunduğunda, yavaşça IBC doğru kılcal tüpün açık ucunu getirmek ve cam kılcal içine IBC rehberlik etmek için aspire pipet çok küçük bir emme kuvveti uygulayın. Daha sonra, boş bir 1.5 mililitrecentrifuge tüp için kılcal hareket ve tüp içine damlacık ve IBC dışarı çıkarmak için hafif bir pozitif basınç uygulayın. Toplama tüpünde tek bir izole IBC varlığının diseksiyon mikroskobu ile doğrulanmasına ek olarak, izole IBC'nin saflığı konfokal mikroskopi ile doğrulanabilir.
İzole hücreler hem E.coli hem de üroplakin için lekelenmeli ve 50 ila 120 mikrometre boyutunda olmalıdır. İzolasyondan sonra, bireysel IBC'deki bakteri hücrelerinin varlığı ve canlılığı, genomik eşdeğerler için koloni oluşturan birim niceleme veya kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu ile doğrulanabilir. Özellikle, aynı protokol ile izole enfekte olmayan epitel hücreleri bakteri ölçülebilir miktarda göstermez.
Ayrıca, kantitatif ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyon analizi, ayrı ayrı izole edilmiş ve birleştirilmiş IbC'lerde bakteri genlerinin varlığını doğrulamaktadır. Her zaman bir ağız mikropipet almak ve kolayca sıvı dışarı atmak emin olun. Ağız mikropipeti tıkanmış hissederse kılcal damarı veya tüm cihazı değiştirmekten çekinmeyin.
Bu ağız mikropipetleme tekniği, deneysel bir İye sırasında oluşturan hücre içi popülasyonları doğrudan ve özellikle incelememize olanak sağlar. Bu teknik olmadan, bu hücre içi popülasyonlar hücre dışı bakterilerle kontamine olur ve sayıca azdır. Diğer bazı enfeksiyöz ajanlar, bu uygulamada kullandığımız E.coli'den daha kolay aerosolize edilebilir veya bulaşabilir.
Bu nedenle, bu nedenle, kullanılan uygulamaya bağlı olarak filtre ekleme veya tüpün uzatılması gibi bazı ek denetimler garanti edilebilir. Bu ağız mikropipetleme tekniği kullanılarak izole edilen IBC'ler daha sonra QRTPCR veya RNA dizilemesi gibi diğer tek hücre analizlerinde kullanılabilir.
