Biyoreaktör şişelerinde kültürlenen hücrelerden ekzozozomla zenginleştirilmiş klimalı ortamın hasat edilmesi ve sakaroz yastık ultracentrifugation ile izolasyon, minimal kontamine proteinler veya ekzozomal olmayan veziküller ile yüksek verimin ekzozom hazırlanmasına neden olur. Döteryum oksit içinde hazırlanmış tek bir sakaroz yastığının kullanılması, kesintisiz bir sakaroz degradesinin zahmetli hazırlanmasını sağlar ve gerekli yoğunluğu elde etmek için gereken sakaroz miktarını azaltır. Bu protokolde hazırlanan ekzozomlarda siRNA kapsülünün etkili in vitro teslim pankreas kanseri için yeni nesil RNA girişim tabanlı tedavi olarak bu sistemin potansiyelini vurgulamaktadır.
Başlamak için, kültür HEK-293 normal ortamda hücreleri, el yazması açıklandığı gibi. Hücreleri dört T75 şişesine genişletin ve %90 biraraya gelene kadar büyüyün. Bir biyoreaktör şişesi hazırlamak için, membran ıslatmak için biyoreaktör şişesi orta rezervuar içine normal orta 50 ila 100 mililitre ekleyin.
Dört T75 şişesinden tüm HEK-293 hücreleri toplayın ve bir santrifüj tüpünde 15 mililitre ekzozom tükenmiş ortamda yeniden askıya alın. Daha sonra, biyoreaktör şişesinin hücre bölmesi için bu hücre süspansiyonu dikkatlice eklemek için künt dolgu iğnesine bağlı 20 mililitrelik bir şırınga kullanın. Daha sonra, biyoreaktör şişesinin orta haznesini normal ortamla doldurun, 500 mililitreye kadar, ve 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın, bir hafta boyunca %5 CO2.
Kuluçka bir hafta sonra, dışarı dökerek biyoreaktör şişesi orta rezervuar tüm orta çıkarın. Künt dolgu iğnesine bağlı 20 mililitrelik bir şırınga kullanarak, hücre bölmesinden tüm ortamı çıkarın. Daha sonra, orta rezervuara 50 ila 100 mililitre normal ortam ve künt bir dolgu iğnesine bağlı 20 mililitrelik şırınga kullanarak hücre bölmesine 15 mililitre taze ekzozom tükenmiş ortam ekleyin.
Daha sonra, biyoreaktör şişesinin orta haznesini 500 mililitreye kadar normal orta ile doldurun. 37 santigrat derecede kuluçka, bir hafta için %5 CO2. Toplanan şartlı ortamı önceden temizlemek için, 500 kez g'de dört santigrat derecede beş dakika santrifüj edin.
Supernatant'ı yeni bir tüpe aktarın ve peleti atın. Kurtarılan supernatant ile bu santrifüj adımı tekrarladıktan sonra, supernatant tekrar kurtarmak ve pelet atın. Sonra, 15 dakika ve dört santigrat derece için 2, 000 kez g kurtarılan supernatant santrifüj.
Supernatant tutun ve pelet atın. Süpernatantı, 20 mililitrelik şırıngaya bağlı 22 mikrometrelik bir filtreden taze bir santrifüj tüpüne filtreleyin. Bu arada, döteryum oksit% 25 sakaroz çözeltisi hazırlamak için, doğru evrensel bir tüp içinde sakaroz 1.9 gram tartmak.
Sonra, ağırlık 7,6 gram ulaşana kadar döteryum oksit ekleyin. Daha sonra, önceden temizlenmiş klimalı orta 22,5 mililitre ile ultracentrifuge tüp doldurun. Tüpe cam bir pipet yerleştirin.
Çözelti koşullu orta altında ayrı bir tabaka oluşturur, böylece pipet yoluyla sakaroz çözeltisi üç mililitre ekleyin. Katmanlı klimalı orta/sakaroz çözeltisi içeren tüpü dikkatlice salıncak-out rotor kovasına yerleştirin. Kovayı rotora sabitle.
Rotoru ultracentrifuge'a yerleştirin ve 100,000 kez g'de dört santigrat derecede 1,5 saat döndürün. Tüpten iki mililitre sakaroz tabakası toplayın, p1000 pipetkullanarak bir seferde bir mililitre, ucu 10 mikrolitreucuye bağlı, ve yıkamak için 20 mililitre filtrelenmiş PBS içeren ultracentrifuge şişeye ekleyin. Tüpü sabit açılı bir rotora yerleştirin ve 100,000 g'de 1,5 saat boyunca dört santigrat derecede santrifüj edin.
Dikkatle supernatant kaldırmak için 10 mililitrelik serolojik pipet kullanın. Filtrelenmiş PBS 400 mikrolitre ile pelet resuspend. Elektroporasyonbaşlamadan önce, 30 dakika boyunca buz üzerinde elektroporasyon cuvette önceden soğutun.
Mikrosantrifüj tüpünde 33 mikrogram siRNA ile yedi mikrogram ekzozomları karıştırın. 150 mikrolitre hacmi elde etmek için sitrik asit tampon ekleyin. Plastik bir pipet kullanarak elektroporasyon cuvette ekzozozom-siRNA karışımı ekleyin ve cuvette kap.
Cuvette'yi elektroporatörün cuvette tutucusuna doğru yönde yerleştirin ve elektroporatörün tornalama tekerleği180 derecesaat yönünde döndürün. İstediğin programı seçin ve elektroporasyonbaşlatmak için Başlat düğmesine basın. Ekran başarılı bir nabız gösterir.
Daha sonra tekerleği saat yönünün tersine 180 derece geri çevirin ve cuvette'yi çıkarın. Yeni bir mikrosantrifüj tüp içine cuvette örnek kaldırmak için plastik bir pipet kullanın. Hemen kullanılmadığı takdirde tüpü daha fazla işleme alınmadan önce buzüzerinde veya buzdolabında saklayın.
Serbest siRNA kaldırma başlatmak için, iki kez dengelemek için boyut dışlama kromatografi sütun u aracılığıyla filtrelenmiş PBS 3,5 mililitre geçirin. Daha sonra, filtrelenmiş PBS 350 mikrolitre elektroporated örnek 150 mikrolitre eritin ve SEC sütununa aktarın. Sütundan eluted ilk 500 mikrolitre fraksiyonu bir mikrofuge tüp içine toplamak ve F0 olarak işaretleyin. Ardından, sütuna 500 mikrolitre filtrelenmiş PBS ekleyin.
Bir sonraki kesir toplayın ve F1 olarak işaretleyin. Toplam 10 500 mikrolitrelik kesirler veya F9 kadar toplanana kadar PBS ekleme ve elüsk kesirleri toplama tekrarlayın. Son olarak, örnek artıklarını kaldırmak için sütunu filtrelenmiş PBS ile en az iki kez yıkayın ve el yazmasında açıklandığı gibi denemelere devam edin. İletim elektron mikroskobu kullanılarak yapılan morfolojik analizler HEK-293 ekzozomlarının 100 nanometreden biraz daha büyük küresel yapılar olduğunu göstermiştir.
Bu sonuç, ekzozomların boyut dağılımını da gösteren nanopartikül izleme analizi ölçümü ile aynı fikirdedir. Ayrıca, onlar ekzozomal belirteçleri CD81, CD9 ve CD63 için pozitif idi. El yazmasında açıklandığı gibi boyut dışlama kromatografisi kullanılarak saflaştırılan ekzozomların yüzde geri kazanımı ve siRNA'nın yüzde geri kazanımı hesaplanmıştır.
Ekzomit sonrası kurtarma %75 siRNA standart eğrisi kullanılarak, ekzozomlarda siRNA'nın kapsülleme verimi floresan Atto655-siRNA yüklü ekzozomların in vitro alımının akış sitometri nitel analizinin yaklaşık %10-20 oranında olduğu hesaplanmış ve siRNA kapsüllü eksozomlarla tedavi edilen PANC-1 hücrelerinin floresan sinyalinde en büyük değişime sahip olduğunu göstermiştir. Bu bulgu ile doğrulandı PANC-1 hücreleri siRNA kapsüllü ekzozomlar ile tedavi atto655 sinyal için popülasyon pozitif daha yüksek bir yüzdesi kaydedilmiş bu boşaltılmış ekzozomlar ve siRNA karışımı ile tedavi ile karşılaştırıldığında. SiRNA hücresel alımı da önemli ölçüde daha yüksek olan PANC-1 hücreleri siRNA kapsüllü ekzozomlar ile tedavi ile karşılaştırıldığında ekzozom-siRNA karışımı ile tedavi, siRNA kapsüllü ekzozomlar PANC-1 hücreleri tarafından içselleştirilmiş olduğunu doğruladı ve etkili hücre içi siRNA teslim.
Sakaroz çözeltisini hazırlarken sakaroz ve döteryum oksitin çok doğru bir şekilde tartılması ve depolama sırasında yoğunluk değişimini önlemek için her zaman taze hazırlanmış sakaroz çözeltisi kullanılması önemlidir. Konfokal mikroskopi, ekzozomlarda kapsüllenmiş siRNA'nın hücrelere dahiliyetini daha da doğrulamak ve hücresel alımsonrasında hücre içi ticaretini incelemek için gerçekleştirilebilir. Bu protokol, ekzozom tarafından verilen siRNA'nın genspesifik nakavtını değerlendirmemize olanak sağlar ve RNA girişim tabanlı kanser tedavisinde yeni hedef doğrulama için bir araç olarak hizmet vermektedir.
