Bu zaman kazandıran yöntem, anatomi ve yerel protein ve dokunun görselleştirilmesini optimize etmek için nörolojik çalışmalarda immünohistokimyasal prosedürlerin turları arasındaki değişkenliği azaltır. Bu tekniğin en büyük avantajı, birden fazla beyni tek bir donmuş blokta birleştirerek kriyoksiyon ve beyne monte etmek için geçen süreyi azaltmasidır. Bu teknik kemirgen beyinlerinin koronal bölümleri için optimize edilmiş olsa da, sagittal veya enine kesitlere veya kas veya karaciğer gibi dokuların farklı türlerine adapte edilebilir.
Başarılı transkardiyal perfüzyonu takiben, PBS'de 25 mililitrelik paraformaldehit şişedeki hayvanların beyinlerini 24 saat boyunca düzeltin. Bundan sonra, paraformaldehit beyin kaldırmak için künt uçlu forseps kullanın. Beyinleri TBS'de yaklaşık 20 mililitre %30 sakaroz çözeltisi içeren bir şişeye aktarın.
Onlar şişenin altına batana kadar beyin ve çözüm tutun. Sonra, bir buz kovası kuru buz bir yatak üzerine 500 mililitrelik cam kabı yerleştirin. Sonra kabın içine 300 ila 400 mililitre isopentane dökün.
Negatif 45 ve negatif 50 santigrat derece arasında isopentane koruyun. Tezgahın üst kısmında, tek kullanımlık gömme kalıbını optimal kesme sıcaklığı veya OCT bileşiğiyle yaklaşık yarım tam doldurun. Kalıp herhangi bir hava kabarcıkları kaldırmak için bir iğne kullanın.
Sakaroz çözeltisi ilk beyin kaldırmak için künt uçlu forseps kullanın. Sonra hemisfer ayırmadan önce beyincik ve koku ampulleri kaldırmak için yeni bir jilet kullanın. Sonra, beyinsayısal bir adlandırma sistemi verin.
Künt forceps kullanın, pozisyon iki yerleştirilecek beyin almak, ve yan ilk yukarı bakacak şekilde kesilecek ile yönlendirmek. OCT içine beyin indirin ve bağımsız durana kadar konumunu ayarlamak için cımbız kullanın. Bu tekniğin önemli bir değişiklik pozisyon bir boş alandır.
Bu alan megabeyin yönünün kolayca tanımlanmasını sağlamak ve bu nedenle her beyinle ilişkili hayvanı tanımlamak için belirlenmiştir. Tüm beyinler kalıp konumlandırılmış sonra, beynin üstleri kapsayacak yeterli OCT eklemek, sonra herhangi bir hava kabarcıkları kaldırmak için bir iğne kullanın. Perçelerin OKT'de kısmen batırılmasını sağlamasını sağlayan persepslerle kalıbın köşesini tutun.
Daha sonra, kalıp içine kalıp indirin böylece kalıp alt üçte sular altında. 30 saniye sonra, isopentane içine tüm kalıp indirin ve forceps bırakın. Üç dakika sonra, isopentane kalıp kaldırmak için forceps kullanın.
Hemen alüminyum folyo kalıp ve içeriğini sarın ve uygun etiket. Megabeyni en az 24 saat boyunca negatif 20 derecelik bir dondurucuya aktarın. İlk olarak, kriyostat kabinenin sıcaklığını negatif 19 dereceye ayarlayın.
Dondurucudan megabeyni çıkarın ve kriyostat yerleştirin. Sonra kriyostat bir chuck ve iki ince uçlu boya fırçaları yerleştirin. Bundan sonra, slaytları megabeyin kimlik numarası ve slayt numarasıyla etiketlendirin ve slaytları kaydırak ısıtıcıya yerlebir edin.
Sonra, megabeyin açın ve kalıp köşeleri kesmek için bir jilet kullanın. Chuck üzerine OCT ince bir tabaka dağıtın. Sonra hızlı bir şekilde chuck üzerinde megabrain yerleştirin.
OCT tamamen donduktan sonra, megabeynin kenarlarına IKI milimetrelik bir EKIM katmanı uygulayın ve aynanın üzerine yanlardan aşağı doğru çalışmasına izin verin. Chuck'ın kenarlarından ve altından fazla OCT'yi kaldırmak için bir jilet kullanın. İlk olarak, chuck kriyostat chuck başında megabrain ile monte pozisyon.
Sonra istenilen kalınlıkta kriyostat ayarlayın. Doku toplama için istenilen beyin bölgesine ulaşmak için gerekli OCT ve doku kırpın. Daha sonra sahneye dayanacak kadar anti-roll plakasını indirin ve tek bir kesit almak için kriyostat sapını çevirin.
Yavaşça anti-roll plaka kaldırın, doku bölümüne dokunulmaz dikkatli olmak. Düz yatana kadar doku bölümünü çıkarmak için boya fırçalarını hafifçe kullanın. Gerekirse, yuvarlanmayı önlemek için paintbrushes kullanarak OCT düz tutun.
Daha sonra slayt ıstırağını kaydırıcıdan çıkarın ve slayt etiketi tarafını megabeyin bölümünün üzerine doğru kaydırın ve slayta yapışmasını bekleyin. Hızlı bir şekilde doku bölümüne PBS bir damla uygulayın. PBS'ye batırılmış ince uçlu bir fırça kullanarak, doku bölümündeki kabarcıkları fırçalayın ve slaytta düz yatmak için dokuyu aç.
Son olarak, slaytı 45 dakika kuruması için kaydırak ısıtıcısına yerleştirin ve slayı negatif 80 santigrat derecede saklayın. Bu protokolde dokuz hayvanın beyin dokusu aynı anda hazırlandı ve kriyodize edildi. Kriyoding inardından sonra, Kriyokoruma kalitesini değerlendirmek için H&E boyama yapılabilir.
Mikroglianın iyonize kalsiyum bağlayıcı molekülü bir veya Iba1 boyamasının temsili sonuçları, tek bir megabeyinüzerinde her çalışma beyni arasında tutarlı bir boyama olduğunu göstermektedir. Bu prosedürü denerken, çatlak veya erime önlemek için megabeyin donma ve daha sonra anormal doku bütünlüğüne yol açan doku yeniden donma sırasında sürekli sıcaklığı izlemek için hatırlamak önemlidir. Boyama sırasında gruplar arasında farklılık yaratabileceği ve görüntüleme ve analiz sırasında önyargı ve öznelliği azaltabileceği için farklı tedavi gruplarını ayrı ayrı megabeyinlerde ayırmak tavsiye edilmez.
Paraformaldehit ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve PBE giymek ve başlıkta çalışmak gibi önlemlerin her zaman bu işlemi gerçekleştirirken alınması gerektiğini unutmayın.
