Bu yöntem böbrek hastalığı alanında anahtar soruları cevaplamak için yardımcı olabilir. Özellikle normal ve hastalıklı hallerde glomerulus anlayışında. Glomerüler biyoloji mevcut hücre türlerinin çeşitliliği ve eşsiz yapısı nedeniyle çalışmak zor olabilir.
Bu tekniğin en büyük avantajı basit yöntemler ve ekipmanlar kullanarak sağlam glomerül için hazır bir kaynak sağlamaktır. Bu teknik, normal ve hastalıklı böbrekte filtrasyon bariyerini anlamamıza etki eder. Özellikle, glomerüler yaralanma idrariçine serum proteinlerinin anormal yüksek salgılayan yol açan proteinürik kronik böbrek hastalığı anlayışımıza ışık tutabilir.
Genel olarak, bu teknik yeni bireyler son örnek yeterli verim ve saflık elde zorluk olacaktır. Prosedürü gösteren Brittney Rush, laboratuvarımdan bir teknisyen. Başlamak için, bir ötenazi sıçan ın ön karın saç kaldırmak için saç makası kullanın.
Maruz kalan cildi temizlemek için %70 etanol kullanın. Sonra, cerrahi makas kullanarak, deride bir orta hat kesi yapmak. İç organları ortaya çıkarmak için, kas tabakası ile bir orta hat kesi yapmak.
Bulmak ve hank's tamponlanmış tuz çözeltisi veya HBSS 30 mililitre buz üzerine yerleştirilen bir steril 50 mililitreplastik konik tüp içine böbrekler ve yer izole. Buz üzerindeki tüpü steril hücre kültürüne aktarın. Böbrekleri buzüzerine yerleştirilen beş mililitre HBSS içeren steril bir Petri kabına aktarın.
Makas ve keskin forceps kaldırmak ve perirenal yağ atmak için kullanın. Böbrek çevreleyen kapsülkaldırmak ve atmak için, küçük bir yüzeysel kesi yapmak ve daha sonra yavaşça böbrekten çekmek için keskin forceps kullanın. HbSS beş mililitre ile ikinci bir Petri kabında steril bir gazlı bez üzerine böbrekler yerleştirin ve orta sagital bölümü ile ikiye her böbrek bölmek.
Koyu renk ve merkezi konumu ile tespit edilebilir medulla kaldırmak ve atmak için bir neşter kullanın. HbSS beş mililitre ile üçüncü bir Petri kabına ağırlıklı olarak böbrek korteks içeren kalan parçaları aktarın. Parçalar bir milimetreden küçük olana veya bir hamur oluşana kadar kıymak için steril bir jilet kullanın.
500 mililitrelik bir atık kabının üzerinde 180 mikrometrelik bir elek üst ve alt ıslak için% 1 BSA PBS kullanın. Bu adım, eleği proteinle kapladığı ve glomerruli yapışmasını azalttığı ve daha sonra verimi artıracağı için önemlidir. Karışık korteksi elek küçük bir kenarına yerleştirin.
10 mililitrelik tek kullanımlık şırınganın dokulu dalgıç flanşını kullanarak eleleden dokuyu buz üzerine yerleştirilen bir alt tavaya yerleştirin. Numune seyreltilmesini önlemek ve elek durulamaiçin alt tavada ki sıvı toplamayı yeniden kullanmak için mümkün olduğunca az kullanarak HBSS ile periyodik olarak durulayın. Tamamlanmış elemeden sonra, gevşek yapışan glomerüli yakalamak için tencerenin altından HBSS ile elek altını dikkatlice yıkayın.
Alt tavadaki tüm sıvıyı 20 ölçü iğnesi ile donatılmış 10 mililitreşile bölün. Alt tavaya en az üç kez iğne ile sıvı geçirin. Son koleksiyon için, 90 mikrometre elekten geçirmeye hazır olana kadar şırıngada sıvı içeren glomeruli tutun.
Bu arada,% 1 BSA PBS ile kızarma ve bir atık kabı içine alt tavayı yıkayın. 90 mikrometrelik bir elek üst ve alt ıslak ve daha sonra alt tava üstüne yerleştirmek için% 1 BSA PBS kullanın. Şırıngadaki numuneyi elekkenarının bir kenarına uygulayın.
Daha önce olduğu gibi elek yoluyla doku mush için dokulu bir piston flanş kullanın. Doku yıkamak ve elek bir kenarından her şeyi toplamak için alt tavadan çözelti kullanın. Eleme tamamlandıktan sonra, gevşek yapışılmış olabilecek glomerüli yakalamak için tencerenin altından HBSS tamponu ile elek altını dikkatlice yıkayın.
50 mililitrelik plastik konik tüp içine alt tavadan tüm sıvı toplayın. Bir atık kabı içine alt tava yıkamak için% 1 BSA PBS kullanın. Daha sonra 75 mikrometrelik bir elek üst ve alt ıslak% 1 BSA PBS kullanın.
Elele, buz üzerine yerleştirilen alt tavanın üstüne yerleştirin. Numuneyi elekbir kenarına uygulayın ve sıvı kolayca akın. Elek üstünü en az 20 mililitre 1%BSA PBS ile bir atık kabına durulayın ve elek altını dikkatlice yıkayın.
75 mikrometre elek üstünde kalan glomeruli toplamak için, bir Petri kabında glomeruli toplamak için gerekli olduğu kadar HBSS ile elek baş aşağı durulayın. Buz üzerinde 50 mililitrelik plastik konik tüp içine elek glomeruli toplamak. 1800 kez G'de dört santigrat derecede beş dakika santrifüj ettikten sonra, pipet kullanarak süpernatantı dikkatlice çıkarın.
10 mililitre soğuk HBSS peletyeniden askıya. Örnekleri birleştirin ve santrifüj tekrarlayın. HBSS beş mililitre glomeruli yeniden askıya.
Toplam glomeruli saymak için, bir cam slayt üzerinde örnek 10 mikrolitre damla yerleştirin, bir mikroskop altında saymak ve toplam verim almak için 500 kat. İzole yapılar boru yapıları olmadan hemen hemen tüm glomeruli oluşmalıdır. Tübüller varsa ve alt akım uygulamanızı etkilerse, numunenin tamamı 90 mikrometre elek için uygulanarak ve protokol o noktadan itibaren tekraredilerek kaldırılabilir.
Burada açıklanan protokol glomeruli izole verimli ve son süspansiyon yoğun bir saflık% 95'ten fazla ve boru segmentleri veya diğer hücre tiplerinden minimal kontaminasyon ile glomeruli ile doludur. Bu glomeruli morfolojisi görüntülemek için hematoksin ve eozin lekeleri ile boyanabilir. Ayrıca, işlenmeden sonra bile tüm protokol boyunca yapılarını korurlar.
Onlar bozulmamış ve canlı podositler, mesangial hücreler ve endotel hücreleri korumak. İzole glomeruli in vivo patoloji simüle etmek için kimyasal yaralanmalara maruz kalmıştır. Özellikle glomerüler filtrasyon bariyerinin yükünü bozan protamin sülfat.
Sağlıklı glomerrulin aksine, protamin sülfat tedavi glomerül, nefron belirgin bir azalma ve WT1 için pozitif çekirdekleri bir dizi var. İletim elektron mikroskobu ile bakıldığında, sağlıklı glomerül tipik ayak süreçleri göstermektedir. Protamin sülfat tedavisinden sonra ayak prosesleri podosit yaralanmasını gösteren uzamış veya effaced edilir.
İzole glomerüllerde hücre canlılığını belirlemek için, apoptoz ispat belirteci olarak cleaved caspase three gözlendi. Glomeruli'nin izolasyonundan bir saat sonra, sıfırda ve bir saat sonra, üç tane cleaved caspase yoktu. Birkaç hücre de iki ve dört saat içinde zaman içinde ilerleyici bir artış ile apoptoz belirtileri gösterdi.
Apoptotik hücrelerin en fazla sayı 24 ve 48 saat olarak kaydedildi. Bu sonuçlara dayanarak, izole glomeruli hemen sonra çoğu deney için izolasyon kullanılmasını öneririz. Bu yordamı gerçekleştirirken, hızlı ve verimli bir şekilde çalışmak önemlidir.
Böbrek izole olduğu andan itibaren glomeruli bozulmaya başlar. Glomeruliyi ne kadar hızlı izole ederseniz, o kadar çok poz vermek zorunda kalırsınız, izolasyon, manipülasyon. İzolasyondan sonra, izole glomeruli fizyolojik veya patolojik koşulları uyarmak için kimyasal veya biyolojik ajanlara maruz kalınabilir.
Ve numuneler protein veya RNA izolasyonu, histoloji veya immünofloresan ve elektron mikroskopisi için proses edilebilir. 1950'lerde gelişiminden bu yana, bu teknik glomerüler biyoloji eğitimi nde araştırmacılar yardımcı olmuştur. Genel olarak, bu protokol normal ve hastalıklı durumlarda bozulmamış glomerülin in morfolojik ve hücresel özelliklerini değerlendirmek için bir yöntem sağlar.
Bu yöntem proteinürik kronik böbrek hastalığı anlayışımıza yardımcı olabilir ve gelecekteki tedavilerin geliştirilmesine yardımcı olabilir.
