Yazarlar mikroskobu deneyleri ile mükemmel teknik yardım için Glen Slocum (Wisconsin Tıp Koleji) ve Colleen A. Lavin (Nikon Instruments, Inc.) teşekkür etmek istiyorum. Gregory Blass yazının kritik redaksiyon için kabul edilmektedir. Bu araştırma (AS) 1-15-BS-172, ve (DVI) Nefroloji American Society Ben J. Lipps Araştırma Bursu hibe Sağlık hibe HL108880 ve American Diabetes Association Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenmiştir.

Hayvan kullanımı ve refah Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından incelenen ve onaylanan protokoller aşağıdaki Laboratuvar Hayvanları Bakımı ve Kullanımı NIH Kılavuzu&#39;na uygun olmalıdır. 1. Böbrek Gömme <ol><li> (Ancak farklı yaş ve cinsiyet diğer suşları uygun değişikliklerle kullanılabilir, bir Sprague Dawley suşu olan önerilen) 8 ila 12 haftalık erkek sıçan kullanın. </li><li> IACUC protokolü tarafından izin verilen prosedüre göre hayvan anestezisi; anestezi derinliği izlemek ve hayvan kontrol edin. cerrahi ayrıntılı bir açıklama 1.3 gerçekleştirilebilir göre - 1.8 Ilatovskaya ark bulunabilir 7. </li><li> Uygun anestezi sonrasında, sıcaklık kontrollü cerrahi masaya hayvan koyun (yukarı uzunluğu 3 inç) karın orta hat kesi yapmak ve vena kava ve aorta ortaya çıkarmak. </li><li> Çölyak ve superior mezenterik arterler ve abdominal etrafında bitişik harfleri yerleştirinyukarıda aort; Arter yok. </li><li> Renal arterlerin altında abdominal aorta incelemek ve çevresinde iki bitişik harfler koyun, ancak lige yok künt, daha sonra bitişik harfler üzerinde aorta kelepçe ve alt iplik kravat. </li><li> Kelepçe altında (PBS ile dolu bir şırınga pompası takılı) bir polietilen PE50 boru ile aort kateter ve ikinci dikilen ile kateter düzeltmek; , kelepçe kaldırmak pompa açın ve aorta bağlanır ve çölyak arterler ile mezenterik. Hızla baskıyı hafifletmek için renal ven kesi yapmak. </li><li> / Dakika 6 ml &#39;lik bir oranda, 2 veya 3 dakika için önceden soğutulmuş PBS ile aort infüze. </li><li> Perfüzyon, rüsumat durdurun ve 7 böbrekler açarlar ve PBS çözüm buz üzerine koydu. IACUC tarafından onaylanmış protokole göre hayvan Euthanize. </li></ol> Sıçan glomerulusların 2. izolasyonu <ol><li> RPMI 1640 içinde% 5 BSA, taze çözelti 30 ml hazırlayın. </li><li> Bir jilet ve makas kullanarak,Her iki böbreğin korteks izole ve ardından homojen hale gelinceye kadar kıyma. Bu prosedür, önceki 7 tarif edilmiştir. </li><li> 100 gözlü paslanmaz çelik elek içinden geçen aşaması esnasında kıyılmış doku itin bir spatula kullanılarak (BSA / RPMI çözeltisi% 5 önceden ıslatılmış). Akış ve yer çekimi kuvveti ile akış ile 140 ağ elek boyunca geçmesine izin toplayın. </li><li> Bir ön-ıslatılmış 200 gözenekli elek kullanılarak bir elek 140 ağ toplanan akış geçirgen filtre süzüntü atmak ve 10, elek üst yıkama - ilgili tortu glomerül toplamak için hazırlanmış BSA / RPMI çözeltisi 15 ml Elek. </li><li> Kadar 20 dakika boyunca tüpün altındaki glomerüller tortu 15 ml tüp buz üzerinde glomerül BSA / RPMI çözeltisi koyun ve bildirin. Tüpün alt glomerüller konsantre açıkça görülecektir. Tüp içinde yaklaşık olarak 2 ml bırakarak, fazla çözelti çıkarın. </li></ol> 3. Tek kanallı Patch-kelepçe Electrophysiology <ol><li> MW 70.000 ile kaplanarak 5 x 5 mm kapak cam cips hazırlayın - 150.000 poli-ʟ-lizin ve kurumaya bırakın. Kapak cam başına su içinde% 0.01 steril filtre edilmiş çözeltisi, yaklaşık 30 ul kullanın. </li><li> RT deneysel çözümler Isınma ve patch-kelepçe odasını ve pipet doldurun. TrpC kanalları izleme, mM banyo solüsyonu kullanın: 126 NaCl, 1 CaCl2, 10 HEPES, 2 MgCl2, 10 glukoz, pH 7.4; Pipet: 126 NaCl, 1.5 CaCl2, 10 HEPES, 10 glukoz; pH 7.4. <ol><li> Tavsiye çalışmalarda (ilgili olmayan endojen kanal aktivitesini engellemek için pipet solüsyonuna inhibitörleri ekleme vardır: 100 uM niflumik asit ya da DIDS (Ca2 + ile aktive edilen Cı engellemek için - kanalları), 10 mM TEA (inhibe yüksek ölçüde iletkenliğe sahip Ca2 + - bağımlı K + kanalı), 10 nM iberiyotoksin (,) 10 uM nikardipin Ca2 + ile aktive edilen K + kanallarını bloke etmek (N-tipi Ca engellemek2+ doğrudan patch-kelepçe deneyden önce kanalları)). </li></ol></li><li> Yavaşça glomerüller içeren çözüm karıştırmak ve sonra poli-ʟ-lizin kaplı kapak cam cips bunun yaklaşık 50 ul uygulayın. Glomerül yaklaşık 5 dakika süreyle tutunma olsun. </li><li> Patch-kelepçe odasına banyo solüsyonu ile önceden doldurulmuş için glomerül cam cips taşı; serbest glomerül kaldırılmasını sağlamak için 1 dakika için / dakika 3 ml bir oranda bölme serpmek. </li><li> Bir hücre ekli modunda 7 geleneksel bir yama-kelepçe deney. Bir cam pipet ile, (7-10 M? Pipet direnci), bir pipet ve hafif bir emme (izole glomerulus yüzeyi üzerinde bir podosit bağlanmış bir pipet uygulayarak podosit membran arasında yüksek dirençli bir yalıtım oluşturmak ilgili, Şekil 2&#39;de gösterildiği gibi olduğu sol). </li><li> Hücre bağlı ölçümler için, sekiz kutuplu Bessel filtresi ile 300 Hz akımları düşük geçmektedir. </li><li> U6 saat - se kadar 4 için patch-kelepçe deneylerinde glomerüller izole. Buz üzerinde stok glomerüller fraksiyonu tutun. </li></ol> Podositler hücre içi kalsiyum konsantrasyonu 4. oranlı metrik Konfokal floresans ölçümleri <ol><li> Konik tüp, 0.5 ml (2.5 açıklanan) glomerüller fraksiyonu 500 ul yerleştirin ve kalsiyum boyalar Fura Kırmızı, AM ve Fluo-4, AM ekleyin. 2 mm ve (DMSO içinde çözülmüş -20 ° C&#39;de saklayın) Fura Kırmızı, AM ve Flu-4, GM, sırasıyla 1 mM stok konsantrasyonları kullanımı ve glomerüller fraksiyonunun 500 ul her bir boya 2.5 ul kullanın. Hemen boyaların ilave edilmesinden sonra, alüminyum folyo ile tüp kapsamaktadır. </li><li> Oda sıcaklığında 1 saat için en az 20 dakika kadar bir döner çalkalayıcı üzerinde yer borular. Not: Farmakolojik maddeler, bu aşama sırasında eklenebilir. </li><li> Cam lamelleri hazırlanması poli-ʟ-lisin ile kapak ve 70 ° C&#39;ye kadar ısıtıldı levha seti kullanarak kurutma sağlar. </li><li> Kalsiyum boyalar yükleme komplet sonraE, poli-ʟ-lizin kaplı kapak çözeltiyi içeren glomerül 100 ul uygulamak ve bununla ilgili olarak, 5 dakika için yüzeye dönelim. Bir görüntüleme odasına glomerüller bağlı lamelleri monte edin ve banyo çözeltisi (() mM olarak ihtiva eden: MgCl2 145 NaCl, 4.5 KCl, 2, 10 HEPES, pH 7.35) ile serpmek 3 ml / dk hızda kaldırmak için bekâr glomerüller ve kalan boyalar. </li><li> Bir 488 nm eksitasyon dalga boyu ve radyasyon filtreleri (sırasıyla Fluo-4 ve Fura Red için 525/25 ve 650/25 nm) konfokal lazer tarama mikroskobu ayarlayın. İstediğiniz bir frekans ve çözünürlük görüntüleme yazılımı ayarlayın. </li><li> Aydınlık içinde glomerüller bulun ve sonra floresan sinyalinin tespiti açın. Sinyalin doygunluk önlemek için her boya için lazer yoğunluğunu ayarlar. Doğrudan cama bağlı Podositler ile odak düzlemi seçin. Bu ilaca yanıt olarak bir glomerulus büzülmesiyle kaynaklanan etkiyi en aza indirirUygulama. Seçim glomerulus iyi cama takılı olduğundan çift çek; </li><li> Seçim odak düzlemi görüntüleme başlayın, (yüksek çözünürlüklü görüntü için 60X / NA 1.4 veya benzer objektif lens kullanın. Hızlı Ca 2+ geçici değişiklikleri görmenizi 4 sn set frekans ile 512 x 512 görüntü almak) ilgi ilaçları uygulamak ve yanıtı kaydedin. <ol><li> (Glomerül yüzeyinde Podositler görüntülenmesini sağlamak için, mümkün olduğu kadar camın yüzeyine yakın olarak) arzu edilen bir odak düzlemi seçin. Fluo4 ve FuraRed kanallarda floresan yoğunluğunu kontrol edin ve glomerulus açıkça aydınlık görülür olduğundan emin olun. </li><li> Görüntüleme başlatın. Herhangi bir ilaç uygulamasından önce, bazal floresans rekor en az 1 dakika sinyali (hiçbir ani sivri veya sinyal solma) kararlı olduğundan emin olmak için. </li><li> Bir mikropipet yardımıyla istenilen ilaçları uygulayın; dikkatli olmak ve ilaç iyi diffüz başardı sağlamak ve glomer ulaşmakulus. Gerekirse, seçilen odak düzlemi izlemek ve çünkü ilaç uygulamasının odak dışına taşımak olmadığını kontrol ediniz hafifçe banyo çözüm karıştırın. </li><li> Fluo4 ve FuraRed sinyalleri için flüoresan yoğunluğundaki değişimlerle kaydedin. Kayıt sinyal plato seviyesine ulaştığında veya bir zirveye ulaşır ve daha sonra bazal dönene kadar bekleyerek, yeterince uzun olduğundan emin olun. Gerekirse Çözelti değişiklik ya da başka herhangi bir ilaç ilave gerçekleştirin. </li><li> Kaydı durdurmak ve yazılım özgün biçiminde dosyayı kaydedin. </li></ol></li></ol> Kalsiyum Ölçümleri 5. Görüntü Analizi <ol><li> Yerli ND2 formatındaki görüntüleri içe izin veren ND Programı eklentisi ile donatılmış ImageJ açık yazılım ile görüntü analizi yapın. </li><li> Görüntü dizisi İthalat; Kanal bölmek ve bir hyperstack gri tonlama modu kullandığınızdan emin olun. </li><li> O kadar ImageJ yazılımı analiz → Araçlar → ROI yöneticisi yolunu izleyinkalem ROI yöneticisi penceresi. Oval seçim aracını ve ROI Yöneticisi &quot;Add (t)&quot; fonksiyonunu kullanarak faiz (Podositler) birkaç bölgeleri seçin. Son ROI olarak arka planda alanı seçin; (→ Kaydet fazla) seçilen ROI kaydedin. </li><li> Analizler için seçilen kanalı içeren pencereyi vurgulayın. , YG Yöneticisi Çoklu Ölçüm işlevi → Daha kullanın dışarı çıkar diyalog içinde &quot;tek satır dilim başına&quot; kutusunu işaretleyin ve sonra Tamam &#39;ı tıklatın. seçeneğini ayarlayın Ölçümleri → menü seçeneği Sonuçlar girmek &quot;gri Ortalama değer&quot; ve görüntülenir her ROI için piksel yoğunluğu değerlerini hesaplamak: Sonuçlar Sonuçları penceresinde ayarlanabilir formatında gösterilir Her ROI için ayrı sütunlarda Sonuçları penceresi. </li><li> Tercih veri analiz yazılımı içine her bir kanal (Fluo-4 ve Fura Kırmızı) için ölçülen ROI yoğunluk değerlerini kopyalayın; Her bir DAT dan çıkarma arka plan yoğunluğu değerleribir nokta. </li><li> Her bir zaman noktası için, Fura kırmızı kanallara Flu-4 yoğunluklarının oranı hesaplanır. Plot dağılım / her ROI için Ca 2+ geçici hat noktası zamanı değişir. Seçilen glomeruli için ortalama / SE değerlerini hesaplamak. Not: Zaman sütunu 4,5 seçilen görüntüleme frekansına göre ayarlanması gerekir. </li></ol> Flu-4 Floresan Sinyal kullanma 6. Hücre içi kalsiyum Konsantrasyon Hesaplamaları <ol><li> Glomerulusların bir örneğini alın ve 4.7 adıma deneysel protokol yukarı gerçekleştirin. Eşiğe kaydından sonra banyo çözeltisine ve kayıt floresan yoğunluğu artışı (10 uM olmalıdır banyo odasında nihai konsantrasyon) İyonomisin ekleyin. Yoğunluk maksimuma ulaşır ve çürüme başladığında, MnCI2 eklemek floresan 8 gidermek için (nihai konsantrasyon 5 mM olmalıdır). </li><li> 6.1 elde edilen verileri analiz edin. Elde edilen Flu-4 sinyal ROI yoğunluğu değerleri doğrultusunda kopyalamaTercih analiz yazılımı ile 5,1-5,5 açıklanan protokole. </li><li> Bir formül kullanılarak ROI karşılık gelen Podosit olarak (nM) hücre içi kalsiyum konsantrasyonunu hesaplayın: <img alt="Denklem 1" src="/files/ftp_upload/52850/52850equation1.jpg" /> Kd Fluo-4 (345 nM) sabit, önceden belirlenmiş bir ayrılma olduğu, F (taban) için kalsiyum konsantrasyonunun hesaplanması olan zaman noktasında yoğunluğudur ve F dakika ve Fmax de yoğunluk değerleri (iyonomisin uygulama sonrası) ve (MnCI2) ile flöresan soğutmadan sonra, maksimum kalsiyum yük noktası, sırasıyla, (Şekil 3&#39;e bakınız). </li></ol>

<ol>
	<li>Machuca, E., Benoit, G., Antignac, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+nephrotic+syndrome:+connecting+molecular+genetics+to+podocyte+physiology.">Genetics of nephrotic syndrome: connecting molecular genetics to podocyte physiology.</a> Hum. Mol. Genet. 18, R185-R194 (2009).</li><li>Haraldsson, B., Nystrom, J., Deen, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+the+glomerular+barrier+and+mechanisms+of+proteinuria.">Properties of the glomerular barrier and mechanisms of proteinuria.</a> Physiol. Rev. 88, 451-487 (2008).</li><li>Patrakka, J., Tryggvason, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+role+of+podocytes+in+proteinuria.">New insights into the role of podocytes in proteinuria.</a> Nat. Rev. Nephrol. 5, 463-468 (2009).</li><li>Savin, V. J., Sharma, R., Lovell, H. B., Welling, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+albumin+reflection+coefficient+with+isolated+rat+glomeruli.">Measurement of albumin reflection coefficient with isolated rat glomeruli.</a> J. Am. Soc. Nephrol. 3, 1260-1269 (1992).</li><li>Gloy, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiotensin+II+depolarizes+podocytes+in+the+intact+glomerulus+of+the+Rat.">Angiotensin II depolarizes podocytes in the intact glomerulus of the Rat.</a> J. Clin. Invest. 99, 2772-2781 (1997).</li><li>Nitschke, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiotensin+II+increases+the+intracellular+calcium+activity+in+podocytes+of+the+intact+glomerulus.">Angiotensin II increases the intracellular calcium activity in podocytes of the intact glomerulus.</a> Kidney Int. 57, 41-49 (2000).</li><li>Ilatovskaya, D., Staruschenko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-channel+analysis+of+TRPC+channels+in+the+podocytes+of+freshly+isolated+glomeruli.">Single-channel analysis of TRPC channels in the podocytes of freshly isolated glomeruli.</a> Methods Mol Biol. 998, 355-369 (2013).</li><li>Snitsarev, V. A., McNulty, T. J., Taylor, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+heavy+metal+ions+perturb+fura-2+measurements+of+basal+and+hormone-evoked+Ca2++signals.">Endogenous heavy metal ions perturb fura-2 measurements of basal and hormone-evoked Ca2+ signals.</a> Biophys. J. 71, 1048-1056 (1996).</li><li>Fukuda, A., Fujimoto, S., Iwatsubo, S., Kawachi, H., Kitamura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+mineralocorticoid+and+angiotensin+II+receptor+blockers+on+proteinuria+and+glomerular+podocyte+protein+expression+in+a+model+of+minimal+change+nephrotic+syndrome.">Effects of mineralocorticoid and angiotensin II receptor blockers on proteinuria and glomerular podocyte protein expression in a model of minimal change nephrotic syndrome.</a> Nephrology (Carlton). 15, 321-326 (2010).</li><li>Abramowitz, J., Birnbaumer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology+and+pathophysiology+of+canonical+transient+receptor+potential+channels).">Physiology and pathophysiology of canonical transient receptor potential channels).</a> FASEB J. 23, 297-328 (2009).</li><li>Heeringa, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+TRPC6+mutation+that+causes+childhood+FSGS.">A novel TRPC6 mutation that causes childhood FSGS.</a> PLoS ONE. 4, e7771 (2009).</li><li>Zhang, X., Song, Z., Guo, Y., Zhou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+novel+role+of+TRPC6+in+vitamin+D+ameliorating+podocyte+injury+in+STZ-induced+diabetic+rats.">The novel role of TRPC6 in vitamin D ameliorating podocyte injury in STZ-induced diabetic rats.</a> Mol. Cell. Biochem. 399, 155-165 (2015).</li><li>Bohrer, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+the+puromycin-induced+defects+in+the+transglomerular+passage+of+water+and+macromolecules.">Mechanisms of the puromycin-induced defects in the transglomerular passage of water and macromolecules.</a> J. Clin. Invest. 60, 152-161 (1977).</li><li>Olson, J. L., Rennke, H. G., Venkatachalam, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+the+charge+and+size+selectivity+barrier+of+the+glomerular+filter+in+aminonucleoside+nephrosis+in+rats.">Alterations in the charge and size selectivity barrier of the glomerular filter in aminonucleoside nephrosis in rats.</a> Lab. Invest. 44, 271-279 (1981).</li><li>Schiessl, I. M., Castrop, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiotensin+II+AT2+receptor+activation+attenuates+AT1+receptor-induced+increases+in+the+glomerular+filtration+of+albumin:+a+multiphoton+microscopy+study.">Angiotensin II AT2 receptor activation attenuates AT1 receptor-induced increases in the glomerular filtration of albumin: a multiphoton microscopy study.</a> Am J Physiol Renal Physiol. 305, F1189-F1200 (2013).</li><li>Ilatovskaya, D. V., Levchenko, V., Ryan, R. P., Cowley, A. W., Staruschenko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NSAIDs+acutely+inhibit+TRPC+channels+in+freshly+isolated+rat+glomeruli.">NSAIDs acutely inhibit TRPC channels in freshly isolated rat glomeruli.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 408, 242-247 (2011).</li><li>Peti-Peterdi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+wave+of+tubuloglomerular+feedback.">Calcium wave of tubuloglomerular feedback.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 291, F473-F480 (2006).</li><li>Peti-Peterdi, J., Warnock, D. G., Bell, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiotensin+II+directly+stimulates+ENaC+activity+in+the+cortical+collecting+duct+via+AT(1)+receptors.">Angiotensin II directly stimulates ENaC activity in the cortical collecting duct via AT(1) receptors.</a> J. Am. Soc. Nephrol. 13, 1131-1135 (2002).</li><li>Ilatovskaya, D. V., Palygin, O., Levchenko, V., Staruschenko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+characterization+of+the+P2+receptors+profile+in+the+podocytes+of+the+freshly+isolated+rat+glomeruli.">Pharmacological characterization of the P2 receptors profile in the podocytes of the freshly isolated rat glomeruli.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 305, C1050-C1059 (2013).</li><li>Ilatovskaya, D. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiotensin+II+has+acute+effects+on+TRPC6+channels+in+podocytes+of+freshly+isolated+glomeruli.">Angiotensin II has acute effects on TRPC6 channels in podocytes of freshly isolated glomeruli.</a> Kidney Int. 305, C1050-C1059 (2014).</li><li>Schaldecker, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+the+TRPC5+ion+channel+protects+the+kidney+filter.">Inhibition of the TRPC5 ion channel protects the kidney filter.</a> J. Clin. Invest. 123, 5298-5309 (2013).</li><li>Roshanravan, H., Dryer, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP+acting+through+P2Y+receptors+causes+activation+of+podocyte+TRPC6+channels:+role+of+podocin+and+reactive+oxygen+species.">ATP acting through P2Y receptors causes activation of podocyte TRPC6 channels: role of podocin and reactive oxygen species.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 306, F1088-F1097 (2014).</li><li>Anderson, M., Roshanravan, H., Khine, J., Dryer, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiotensin+II+activation+of+TRPC6+channels+in+rat+podocytes+requires+generation+of+reactive+oxygen+species.">Angiotensin II activation of TRPC6 channels in rat podocytes requires generation of reactive oxygen species.</a> J. Cell. Physiol. 229, 434-442 (2014).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Burada tarif edilen bir yaklaşım, kemirgen glomerül Podositler kalsiyum işleme analizi sağlar. Bu teknik, patch-kelepçe tek kanallı elektrofizyoloji ve floresan rasyometrik konfokal görüntüleme uygulama sağlar. Bununla birlikte, her iki yaklaşım da kendi ayrı ayrı kullanılabilir. Önerilen protokol 1) böbrek temizleme dahil olmak üzere birçok nispeten basit adımları vardır; 2) diferansiyel eleme ile glomerül izolasyonu; 3) patch-kelepçe elektrofizyolojik deneyler veya hücre içi kalsiyum değişiklikler rasyometrik konfokal görüntüleme için floresan kalsiyum etiketleme boya ile glomerül inkübasyon. Glomerül, Gloy göre modifiye edilmiş bir protokol izole etmek için ve ark., 5 kullanılmıştır. ayırıcı eleme mevcut tekniğin başlıca avantajı, karmaşık ve zaman alıcı bir aşamasını gerektirmeyen, böylece Bowman kapsülü olmayan glomerül üreten ve olmasıdırmanuel decapsulation evi. İzole fraksiyonunda glomerül çoğunluğu decapsulated edilir, ancak araştırmacı da, kapsüllü glomerül olduğunu farkında olmalıdır. Kapsül Podositler ulaşmasını engeller uyuşturucu gibi, Bowman kapsülü çıkardı glomerül görüntülü emin olmak için önemlidir. Şekil 2&#39;de görüldüğü gibi kapsüllü glomerüller pürüzsüz ve yuvarlak şekilli görünmesi ise decapsulated glomerül, farklı kılcal damarların ve Podosit organları ile kaba bir yüzeye sahiptir. Ayrıca, Fluo4 ve FuraRed yüklenen glomerül decapsulated olanlara kıyasla daha az yoğun floresan sinyal yayarlar kapsüllü. Elde edilen sıçan glomerül fraksiyon% 95 (proksimal tübül izleri ile) saf ve gerektiğinde kolayca western blot veya başka bir moleküler biyoloji uygulamaları için kullanılabilir olması. Bu hazırlık Podositler kılcal bağlı olduğu son derece önemlidir, bir parçası olarak sağlam ayak süreçleri ve fonksiyonunu muhafazaYerel glomerulus süzme tertibatı makine. Podositler kalsiyum taşıma mekanizmaları diyabet veya yüksek tansiyon 9-12 gibi hastalıklarda, böbrek komplikasyonları geliştirme ve önlenmesinde önemli bir düzenleyici rol alırlar. Akut yaralanma Podosit morfolojisi ve yapısını değiştirir ve proteinüri 2,3,13-15 neden olabileceği gerçeği ile kanıtlandığı gibi Podositler, geçirgenlik bariyerleri önemli katkı sağlamaktadır. Bu nedenle, kolayca bu hazırlanmasında taranabilir ilaçlara, bu hücrelerin, kalsiyum girişinin yanıt gözlemlemek için büyük bir önem taşımaktadır. Araştırmacı patolojik durumda Podositler tarama ise, genellikle, proteinüri ve glomerüller hasara neden örneğin, hipertansiyon ya da diyabet için, glomerül verimi sağlıklı hayvanlarda daha az saf olabilir anlaşılmalıdır. Her zaman kaybını önlemek için izolasyon sürecinin her aşamasında glomerülü kesirler izlemek için tavsiye edilirdokusu. Bazı durumlarda, yaş ya da çok genç hayvanlar ile ilgili yoğun hastalıklı glomerülü veya glomerül daha büyük / küçük gözenekli elek seçimi de dahil olmak üzere yalıtım işlemi için ayrı ayrı ayarlama gerektirebilir. Biz Podositler 16 kalsiyum trpC kanallarının inhibisyonu non-steroid anti-inflamatuar ilaçların etkinliğini belirlemek için başlangıçta bu yaklaşımı uyguladık. Bu çalışmalar 7,16-22 ardından biz Podositler fonksiyonu kontrol eden pek çok kritik mekanizmaların oluşturulması için anlatılan teknikleri kullandı. Mesela biz sıçan Podositler P2 (pürinerjik) reseptörlerinin profili tarif ve fare glomerüllerinde Anjiotensin II kalsiyum akını düzenlenmesini tanımladık. Daha sonra el yazması 20 de tarif edildiği gibi, bir protokol fare gibi sıçanlarda değil, aynı zamanda diğer türlerde de sadece benzer çalışmalar gerçekleştirmek için adapte edilebilir. İki floresan kullanımı ile oranlı metrik kalsiyum flüoresan görüntüleme (boyalar - Fluo-4 ve Fura Kırmızı) ilave veri güvenilirlik sağlar ve gereken kalsiyum görüntüleme diğer floresan boyalar ile kombine edilebilir, eğer Podositler içindeki diğer maddelere değişiklikleri izlemek için. Örneğin, DAF-FM boya yardımı ile nitrik oksit ölçmek için bu yaklaşımı kullandık. Patch-Clamp elektrofizyoloji tek başına kullanılabilir ya da kalsiyum görüntüleme ile kombinasyon halinde (kurulum izin). Dışında kalsiyum kanallarından, teknik, diğer iyon kanallarının aktivitesini kayıt olanak verir. Son zamanlarda Dr Kurutma grubunun 23 tarafından gösterildiği gibi Dahası, transfeksiyon ve siRNA&#39;nın kullanımı daha da uygulamanın alanını genişletebilir. Konvansiyonel Epifloresans mikroskopi yerine daha az uygun konfokal görüntüleme burada kullanılabilir. Ancak, araştırmacı geniş alan floresan mikroskobu etkin hassasiyet genellikle out-of-focus ışığı ile sınırlı olduğunu farkında olmalıdır. Konfokal IMAGin Bu (karşılaştırmag) Tek ROI (Podosit) ya da ayak süreçlerinin yüksek görüntü çözünürlüğü üretmek için yetersizlik gibi sınırlamalar olur. Bu glomerülleri ve derin doku yüzeyi arasındaki ayırt etmek zor olduğu gibi Ayrıca, geniş alan mikroskopisi Podositler belirlenmesini zorlaştırır. Şu an itibariyle konfokal görüntüleme için çeşitli fluorophores ticari kullanılabilirliği çok daha iyi ve hızla genişleyen olduğunu. Alternatif olarak, Epifloresans çalışmaları kolaylıkla eşzamanlı hücre içi Ca 2+ ve tek kanal etkinlik kaydı sağlayabilir bir elektrofizyolojik kurulum ile kombine edilebilir. Filtre teker monokromator ve nötral yoğunluk filtreleri kurulum ile glomerülün Podositler ve Fura2-AM yükleme yaygın olarak kullanılan, ama her zaman kaliteli, yüksek çözünürlüklü görüntüleme için uygun değildir. Aynı zamanda izole, fonksiyonel glomerulus fizyolojik uyaranlara yanıt olarak hacmini değiştirmek mümkün olduğuna dikkat edilmelidir. Araştırmacı gerçekleştiren bu süre farkında olmalıDeneyler ve dikkatle odak kaybını önlemek için konfokal çalışmalar sırasında odak düzlemi seçin ve istenmeyen daralma veya gevşeme test etmek için yeni ilaçların seçimi üzerine kontrol deneyleri gerçekleştirmek. Bu teknik kemirgen kökenden çeşitli farmakolojik tedaviler veya diğer manipülasyonlar sonra tek iyon kanalında kalsiyum akını değişiklikleri ve bireysel hücreler seviyelerini izlemek için eşsiz bir fırsat sunmaktadır. Değiştirilmiş bir protokol kuşkusuz derece değerli bilgiler sağlayacaktır böbrek biyopsileri, elde edilen dokular için uygulanabilir Bu teknik, aynı zamanda, insan böbrek hastalığı çalışmalarında kullanılabilir. Ayrıca, kalsiyum konsantrasyonu ölçümleri normal ve patolojik şartlarda Podositler dahilinde ele kalsiyum düzenlenmesinde içine derinlemesine ve mekanik anlayış daha sağlayabilir gerçek zamanlı olarak elektrofizyolojik patch-kelepçe deneyler ile eşleştirilmiş olabilir.

Böbrekler, çeşitli maddeler için homeostatik dengeyi korumak ve toplam kan basıncını belirleyen bir şekilde kan hacmini düzenler. Hiper veya hipotansiyon arasında değişen renal filtrasyon, geri emiliminin veya salgı kurşun bozukluklar veya eşlik patolojik durumlar, sonunda böbrek nakli gerektiren son dönem böbrek hastalığı için. kapiller endotel, bazal membran ve epitel hücreleri tek-hücre tabakası - - yarık diyafram bütünlüğü ve işlevi 1 korunmasında önemli bir rol oynamaktadır Podositler renal filtreleme birimi (glomerulus) üç tabakadan oluşur. Permselektif glomerüler filtre Disfonksiyon gibi proteinüri olarak makromoleküllerin, idrar kaybına neden olur. Çeşitli ajanlar glomerüller filtrasyon bariyerinin bütünlüğünü belirleyen Podositler ve ayak süreçleri, yapısını etkileyebilir. Podositler glom bakım katılaneruli filtrasyon işlevi. Bu Podosit tarafından uygunsuz kalsiyum taşıma hücre hasarı yol açar ve nefropatilerin 2,3 çeşitli biçimlerde ilerlemesinde önemli bir rol oynadığı tespit edilmiştir. Bu nedenle, podosit fonksiyonunun çalışmalar için etkili olacaktır hücre içi kalsiyum konsantrasyonu değişiklikleri, doğrudan ölçümü için izin veren bir modelinin geliştirilmesi. İzole glomerüller önce albümin yansıma katsayısı ölçümü 4 ve bütün hücre elektrofizyolojik patch-kelepçe ölçümlerde 5,6 integral hücresel akımların değerlendirmesini değiştirir dahil çok sayıda çalışmalarda kullanılmıştır. Mevcut yazıda, farmakolojik ajanların uygulamalarına tepki olarak hücre içi kalsiyum konsantrasyonu değişiklikleri ölçmek hücrelerin içinde kalsiyum bazal düzeylerini tahmin ve bireysel kalsiyum kanalları aktivitesini değerlendirmek için araştırmacı izin veren protokol açıklar. Ratometric kalsiyum konsantrasyonu ölçümleri ve patch-kelepçe electrophysiology sırasıyla podosit ve kanal aktivitesi olan hücre içi kalsiyum konsantrasyonu değişiklikleri belirlemek için kullanıldı.

<table><tbody><tr><td>Fluo4 AM</td><td>Life Technologies</td><td>F14217</td><td>500 &amp;micro;l in DMSO</td></tr><tr><td>FuraRed AM</td><td>Life Technologies</td><td>F-3020</td><td></td></tr><tr><td>Poly-&amp;#671;-lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F-68</td><td>solution</td></tr><tr><td>Ionomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I3909-1ML</td><td></td></tr><tr><td>Tube rotator</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-090-753</td><td>Germany</td></tr><tr><td>Nikon confocal microscope (inverted)</td><td>Nikon</td><td>Nikon A1R</td><td>Laser exitation 488 nm. Emission filters 500-550 nm and 570-620 nm</td></tr><tr><td>Objective</td><td>Nikon</td><td>Plan Apo 60x/NA 1.4 Oil</td><td></td></tr><tr><td>Cover Glass</td><td>Thermo Scientific</td><td>6661B52</td><td></td></tr><tr><td>High vacuum grease</td><td>Dow Corning</td><td></td><td>Silicone Compound</td></tr><tr><td>Software</td><td>Nikon</td><td>Nikon NIS-Elements</td><td></td></tr><tr><td>Recording/perfusion chamber</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-26</td><td></td></tr><tr><td>Patch clamp amplifier</td><td>Molecular Devices</td><td>MultiClamp 700B</td><td></td></tr><tr><td>Data acquisition system</td><td>Molecular Devices</td><td>Digidata 1440A</td><td>Axon Digidata&amp;reg; System</td></tr><tr><td>Low pass filter</td><td>Warner Instruments</td><td>LPF-8</td><td>8 pole Bessel</td></tr><tr><td>Borosilicate glass capillaries</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B150F-4</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette puller</td><td>Sutter Instrument Co</td><td>P-97</td><td>Flaming/Brown type micropipette puller</td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Narishige</td><td>MF-830</td><td>Japan</td></tr><tr><td>Motorized micromanipulator</td><td>Sutter Instrument Co</td><td>MP-225</td><td></td></tr><tr><td>Inverted microscope</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti</td><td></td></tr><tr><td>Microvibration isolation table</td><td>TMC</td><td></td><td>equipped with Faraday cage</td></tr><tr><td>Multichannel valve perfusion system</td><td>AutoMake Scientific</td><td>Valve Bank II</td><td></td></tr><tr><td>Recording/perfusion chamber</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-26</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td>Molecular Devices</td><td>pClamp 10.2</td><td></td></tr><tr><td>Nicardipine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N7510</td><td></td></tr><tr><td>Iberiotoxin</td><td>Sigma</td><td>I5904-5UG</td><td></td></tr><tr><td>Niflumic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0630</td><td></td></tr><tr><td>DIDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D3514-25MG</td><td></td></tr><tr><td>TEA chloride</td><td>Tocris</td><td>T2265</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Life Technologies</td><td>11835030</td><td>without antibiotics</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8327</td><td>30% albumin solution</td></tr><tr><td>Temperature controlled surgical table</td><td>MCW core</td><td></td><td>for rodents</td></tr><tr><td>Steel sieves:</td><td></td><td></td><td>#100 (150 &amp;mu;m), 140 (106 &amp;mu;m)</td></tr><tr><td>Gilson, Inc SIEVE 3 SS FH NO200</td><td>Fisher Sci</td><td>50-871-316</td><td></td></tr><tr><td>Gilson, Inc SIEVE 3 SS FH NO270</td><td>Fisher Sci</td><td>50-871-318</td><td></td></tr><tr><td>Gilson, Inc SIEVE 3 SS FH NO400</td><td>Fisher Sci</td><td>50-871-320</td><td></td></tr><tr><td>mesh 200</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>s4145</td><td>screen for CD-1</td></tr><tr><td>Binocular microscope</td><td>Nikon</td><td>Eclipse TS100</td><td></td></tr><tr><td>Binocular microscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ745</td><td></td></tr><tr><td>Syringe pump-based perfusion system</td><td>Harvard Apparatus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polyethylene tubing</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PE50</td><td></td></tr><tr><td>Isofluorane anesthesia</td><td><a href="http://www.vetequip.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> VetEquip, Inc.</a></td><td>911103</td><td></td></tr><tr><td>Other basic reagents</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

single-channel analysis and calcium imaging in the podocytes of the freshly isolated glomeruli

Podocytes (renal glomerular epithelial cells) are known to regulate glomerular permeability and maintain glomerular structure; a key role for these cells in the pathogenesis of various renal diseases has been established since podocyte injury leads to proteinuria and foot process effacement. It was previously reported that various endogenous agents may cause a dramatic overload in intracellular Ca2+ concentration in podocytes, presumably leading to albuminuria, and this likely occurs via calcium-conducting ion channels. Therefore, it appeared important to study calcium handling in the podocytes both under normal conditions and in various pathological states. However, available experimental approaches have remained somewhat limited to cultured and transfected cells. Although they represent a good basic model for such studies, they are essentially extracted from the native environment of the glomerulus. Here we describe the methodology of studying podocytes as a part of the freshly isolated whole glomerulus. This preparation retains the functional potential of the podocytes, which are still attached to the capillaries; therefore, podocytes remain in the environment that conserves the major parts of the glomeruli filtration apparatus. The present manuscript elaborates on two experimental approaches that allow 1) real-time detection of calcium concentration changes with the help of ratiometric confocal fluorescence microscopy, and 2) the recording of the single ion channels activity in the podocytes of the freshly isolated glomeruli. These methodologies utilize the advantages of the native environment of the glomerulus that enable researchers to resolve acute changes in the intracellular calcium handling in response to applications of various agents, measure basal concentration of calcium within the cells (for instance, to evaluate disease progression), and assess and manipulate calcium conductance at the level of single ion channels.

Burada Podositler kalsiyum seviyeleri akut değişiklikler ölçülerek değerlendirilmesi amaçlanmıştır. 1, taze bir Podositler yüksek çözünürlüklü canlı floresan konfokal görüntüleme ve tek iyon kanalı aktivitesi kayıtları gerçekleştirmek için tasarlanan deney protokolünün şematik bir temsilini göstermektedir, Şekil İzole kemirgen glomerüller. Sıçan anestezi sonra Kısaca, böbrekler kan bunları temizlemek için PBS ile yıkanmalıdır. Ardından, böbrekler kesilmiş ve decapsulated ve glomerül diferansiyel eleme yoluyla böbrek korteks izole edilir edilir. Numunenin bir kısmı patch-kelepçe analizi için alınabilir ve geri kalanı floresan kalsiyum boyalar Fluo-4, AM ve Fura Kırmızı yüklenebilir, konfokal rasyometrik kalsiyum görüntüleme gerçekleştirmek için AM. Tek iyon kanalı aktivitesinin elektrofizyolojik ölçümler glomerül izolasyonundan sonra hemen gerçekleştirilebilir. İyon cha Aktivitennels yama klemp yöntemi hücre bağlı ve bütün hücre konfigürasyonları, her iki ölçülebilir. Gösterilen yaklaşımın uygulanabilirliğini göstermek için tek trpC gibi kalsiyum-iletken iyon kanalı aktivitesinin (Şekil 2) kaydıdır. Buna ek olarak, bu, hücre-geçirgen ya da reseptör bağlanma, tek iyon kanallarının seviyesinde Podositler kalsiyum akışı üzerindeki etkilerini test etmek için ilaç uygulamak mümkündür. Tek iyon kanalı etkinlik değerlendirmesini sağlayan bir yaklaşım Podosit fonksiyonunu karakterize veri çeşitli üretir. Bununla birlikte, büyük ölçüde tüm hücre seviyesinde kalsiyum konsantrasyonu değişikliklerinin ölçülmesiyle desteklenebilir. Bu tür çalışmalar yapmak, taze izole glomerül yüksek verimlilik konfokal görüntüleme için floresan boyalar ile yüklendi. Yüksek optik çözünürlük sayesinde bir anda birkaç Podositler kalsiyum düzeyleri izlemek mümkündür. 3 sürülme süresini gösterir ŞekilPodosit içinde kalsiyum konsantrasyonu değişiklikleri değerlendirmek için tasarlanmış tipik deney için kurs. Podosit içinde bazal kalsiyum konsantrasyonu Fluo-4 floresan dayalı değerlendirilmiştir. 1 dakika boyunca (F), bazal sinyal yoğunluğu kaydedildikten sonra, İyonomisin uygulanır ve daha sonra MnCI2 söndürüldü olan, en yüksek floresan (Fmax) ulaşılabilir neden olur (F dakika not edilmiştir) hazırlandı. 6.3 aşağıdaki formüle göre, deneyin her bir zaman noktasında Fluo-4 sinyalin yoğunluğu daha sonra hücre içinde kalsiyum iyonları, gerçek konsantrasyon tercüme edilebilir. Grafikte görüldüğü gibi, arka plan (yaklaşık 400 rasgele birim) içinde fluoresans ortalaması sağlıklı sigara apoptotik hücrelerde hücre içi kalsiyum için normal bir konsantrasyon aralığı içinde 140 nM, anlamına gelir. açıklanan yaklaşımın önemi ve faydası akut kalsiyum transie ölçmek için izin veren başka bir uygulama tarafından haklıçeşitli ilaçlara yanıt olarak Podositler olarak nts. Şekil 4A önce ve 10 um ATP ilave edildikten sonra (4,5 tarif edilmiştir), 2 mM kalsiyum içeren çözelti içinde Flu-4 ve Fura kırmızı ile boyanmış sıçan glomerül temsili görüntüleri göstermektedir. Yeşil dramatik bir artış dikkat (Fluo-4 AM) (oklarla işaretli) Podositler floresan ve Fura Kırmızı floresan bir düşüş (kırmızı Pseudocolor). FuraRed iner ise hücre içinde kalsiyum konsantrasyonu, 4 şiddeti artar Fluo arttırır zaman Fluo4 ve FuraRed, ters bir şekilde, yani 488 nm dalgaboyu kalsiyum konsantrasyonunda bir artış göstermektedir. Bu nedeniyle FuraRed fluorofor ikili uyarım doğası mümkündür. Eksitasyon dalga boyuna bağlı olarak, floresan karşılık gelen bir artış veya azalış, kalsiyum-bağlı (420 nm) veya kalsiyum içermeyen (488 nm) florofor olarak davranabilir. Bu nedenle, tek başına bir rasyometrik görüntüleme modunda FuraRed kullanımı ancak requir mümkün420 nm ve 488 nm - iki uyarma dalga boyu es. Bu, en az iki kez (bir eksitasyon dalga boyu kullanımı ile karşılaştırıldığında) görüntüleme sıklığını azaltacaktır; Araştırmacı görüntüleme hızlı ayak uydurmak istiyorsanız eğer, görüntü çözünürlüğü azaltılmalıdır. Bu flüoroforlar, aynı 488 nm lazeri tarafından uyarılır ve emisyon spektrumlarına iyi bir farklılaşma temin edilebilir Bununla birlikte, Fluo 4 ile FuraRed, görüntüleme frekans çözünürlüğü veya azalma kaybı olmadan rasyometrik modu ile birlikte kullanılabilir. ROI özetlenmiştir tipik bir geçici Şekil 4A&#39;da oklar Şekil 4B&#39;de gösterilmektedir ile işaretlenmiş; Grafik net bir şekilde birkaç dakika içinde azalır 10 uM ATP ilave edildikten sonra Fluo4 / FuraRed yoğunluk oranı akut bir artış ortaya koymaktadır. Görüntüler her 4 saniye alındı ​​ve bu nedenle, bu teknik, hücre içindeki kalsiyum konsantrasyonunda hızlı bir değişiklik gözlenmesi sağlar. Deneysel protokol 1. şematik gösterimi Şekil. Hayvan doğru anestezi ve cerrahi için hazırlandıktan sonra, böbrekler, kan uzaklaştırmak için PBS ile temizlendi. Ardından, böbrekler kesilmiş ve decapsulated ve glomerül diferansiyel eleme yoluyla böbrek korteks izole edilir edilir. Burada, örnek bir parçası patch-kelepçe analizi için alınır ve geri kalan floresan kalsiyum boyalar ve konfokal rasyometrik kalsiyum görüntüleme yapılır ile yüklenir. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52850/52850fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52850/52850fig2highres.jpg" width="700" /> Podo içinde trpC kalsiyum kanallarının aktivitesini gösteren Şekil 2. Temsilcisi kayıttaze izole sıçan glomerüllerin lenfositler. Sol panel hücre bağlı konfigürasyonda bir elektrofizyolojik kayıt sırasında glomerülün yüzeyinde Podosit gövdesine bağlanan yama-kelepçe pipet gösterir; Bir glomerulus kapsüllü bir parçası resmin sağ alt köşesinde görülebilir. Bir -40 mV tutan potansiyelinde sıçan glomerül Podosit yapılan bir hücre bağlı yama trpC benzeri kanallar faaliyet Temsilcisi akım izi sağda gösterilir. c ve o ben kapalı ve açık kanal seviyelerini ifade, sırasıyla. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52850/52850fig2highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/52850/52850fig3highres.jpg" width="500" /> Şekil 3. Temsilcisi deney hücre içi kalsiyum düzeyini değerlendirmek için tasarlanmış<html> Podositler. glomerüller Fluo-4, AM, floresan yoğunluğu başlangıca ve ionomisin ve MnCl 2 ilave edildikten sonra kaydedilmektedir ile yüklenir, hücre içi kalsiyum konsantrasyonunu ölçmek için. Grafik boya ve düşük floresan yoğunluğu (F dk) sonuçları söndürür ve MnCI2, (Fluo-4 floresan, F max maksimum üreten) iyonomisin tepki olarak floresan sinyal değişiklikleri gösterir. Her zaman noktası için floresan (sol apsis) yoğunluğu 6.3&#39;de formülüne göre (sağ apsis) nanomol gerçek kalsiyum konsantrasyonu tercüme edilebilir. F F max ve F min hesaplanmıştır zaman zaman noktalarında Podositler gösteren görüntülerle-parçalar unutmayın. Burada gösterilen grafik bir daire (ROI) ile işaretlenmiş Podosit floresan yoğunluğunu yansıtır; görüntüler her 4 saniyede alındı.&quot;nk&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/52850/52850fig4highres.jpg" width="650" /> Şekil ATP yanıt Podositler kalsiyum geçici 4. ölçülmesi. (A) önce ve 10 uM ATP ilave edildikten sonra 2 mM kalsiyum içeren çözelti içinde Fluo-4 (yeşil Pseudocolor) ve Fura Red (kırmızı Pseudocolor) ile boyandı, vahşi tip sıçan glomerul gösteren Örnek görüntüler. İlacın uygulanmasından önce daha düşük yoğunlukta, yeşil renkli flüoresan not edilmelidir. (B) 10 mikron ATP uygulanmasıyla Podositler uyarılmış hücre içi kalsiyum geçici örneğini özet. Inci kalsiyum deposu ve kalsiyum akını uyarılması ve tükenme hesapları ilacın, ilave aşağıdaki Flu-4 / Fura Kırmızı floresan yoğunluğu oranında güçlü ve hızlı bir artış dikkatE dışındaki hücre içinde, hücre içi kalsiyum konsantrasyonunun yükselmesi ile sonuçlanır. Hata çubukları aynı glomerulus 11 Podositler için hesaplanan ortalamaların standart hatası temsil etmektedir. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52850/52850fig4highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Single-channel Analysis and Calcium Imaging in the Podocytes of the Freshly Isolated Glomeruli at JoVE.com

Single-channel Analysis and Calcium Imaging in the Podocytes of the Freshly Isolated Glomeruli

Changes in the intracellular calcium levels in the podocytes are one of the most important means to control the filtration function of glomeruli. Here we explain a high-throughput approach that allows detection of real-time calcium handling and single ion channels activity in the podocytes of the freshly isolated glomeruli.

Taze İzole glomerulusların Podositler Tek kanallı Analizi ve Kalsiyum Görüntüleme

Podocytes (renal glomerular epithelial cells) are known to regulate glomerular permeability and maintain glomerular structure; a key role for these cells ...

single-channel-analysis-calcium-imaging-podocytes-freshly-isolated

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

10.9K Görüntüleme.  Medical College of Wisconsin. Changes in the intracellular calcium levels in the podocytes are one of the most important means to control the filtration function of glomeruli. Here we explain a high-throughput approach that allows detection of real-time calcium handling and single ion channels activity in the podocytes of the freshly isolated glomeruli. 

Video: Single-channel Analysis and Calcium Imaging in the Podocytes of the Freshly Isolated Glomeruli

Imaging of Podocytic Proteins Nephrin, Actin, and Podocin with Expansion Microscopy

Disruption of the glomerular filter composed of the glomerular endothelium, glomerular basement membrane and podocytes, results in albuminuria. Podocyte foot processes contain actin bundles that bind to cytoskeletal adaptor proteins such as podocin. Those adaptor proteins, such as podocin, link the backbone of the glomerular slit diaphragm, such as nephrin, to the actin cytoskeleton. Studying the localization and function of these and other podocytic proteins is essential for the understanding of the glomerular filter&#39;s role in health and disease. The presented protocol enables the user to visualize actin, podocin, and nephrin in cells with super resolution imaging on a conventional microscope. First, cells are stained with a conventional immunofluorescence technique. All proteins within the sample are then covalently anchored to a swellable hydrogel. Through digestion with proteinase K, structural proteins are cleaved allowing isotropical swelling of the gel in the last step. Dialysis of the sample in water results in a 4-4.5-fold expansion of the sample and the sample can be imaged via a conventional fluorescence microscope, rendering a potential resolution of 70 nm.

The presented method enables visualization of fluorescently labeled cellular proteins with expansion microscopy leading to a resolution of 70 nm on a conventional microscope.

Podosit Proteinleri Nephrin, Actin ve Podocin'in Genleşme Mikroskopisi ile Görüntülenmesi

Disruption of the glomerular filter composed of the glomerular endothelium, glomerular basement membrane and podocytes, results in albuminuria. Podocyte ...

Biyokimya

Immunohistochemical and Calcium Imaging Methods in Wholemount Rat Retina

In this paper we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of wholemount retinas for immunohistochemistry and, 2) calcium imaging for the study of voltage gated calcium channel (VGCC) mediated calcium signaling in retinal ganglion cells. The calcium imaging method we describe circumvents issues concerning non-specific loading of displaced amacrine cells in the ganglion cell layer.

Immunohistochemistry protocols are used to study the localization of a specific protein in the retina. Calcium imaging techniques are employed to study calcium dynamics in retinal ganglion cells and their axons.

Wholemount Sıçan Retina Immunohistochemical ve Kalsiyum Görüntüleme Yöntemleri

In this paper we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of wholemount retinas for ...

Nörobilim

An Efficient Sieving Method to Isolate Intact Glomeruli from Adult Rat Kidney

Preservation of glomerular structure and function is pivotal in the prevention of glomerulonephritis, a category of kidney disease characterized by proteinuria which can eventually lead to chronic and end-stage renal disease. The glomerulus is a complex apparatus responsible for the filtration of plasma from the body. In disease, structural integrity is lost and allows for the abnormal leakage of plasma contents into the urine. A method to isolate and examine glomeruli in culture is critical for the study of these diseases. In this protocol, an efficient method of retrieving intact glomeruli from adult rat kidneys while conserving structural and morphological characteristics is described. This process is capable of generating high yields of glomeruli per kidney with minimal contamination from other nephron segments. With these glomeruli, injury conditions can be mimicked by incubating them with a variety of chemical toxins, including protamine sulfate, which causes foot process effacement and proteinuria in animal models. Degree of injury can be assessed using transmission electron microscopy, immunofluorescence staining, and western blotting. Nephrin and Wilms Tumor 1 (WT1) levels can also be assessed from these cultures. Due to the ease and flexibility of this protocol, the isolated glomeruli can be utilized as described or in a way that best suits the needs of the researcher to help better study glomerular health and structure in diseased states.

The main focus of this protocol is to efficiently isolate viable primary glomeruli cultures with minimal contaminants for use in a variety of downstream applications. The isolated glomeruli retain structural relationships between component cell types and can be cultured ex vivo for a short time.

Yetişkin sıçan böbrek üzerinden olduğu gibi Glomeruli yalıtmak için verimli bir eleme yöntemi

Preservation of glomerular structure and function is pivotal in the prevention of glomerulonephritis, a category of kidney disease characterized by ...

Tıp

One-channel Cell-attached Patch-clamp Recording

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate depends on properties intrinsic to each channel protein as well as the mechanism by which it is generated and controlled and represents an important area of current research. Information about the operational dynamics of ion channel proteins can be obtained by observing long stretches of current produced by a single molecule. Described here is a protocol for obtaining one-channel cell-attached patch-clamp current recordings for a ligand gated ion channel, the NMDA receptor, expressed heterologously in HEK293 cells or natively in cortical neurons. Also provided are instructions on how to adapt the method to other ion channels of interest by presenting the example of the mechano-sensitive channel PIEZO1. This method can provide data regarding the channel&#8217;s conductance properties and the temporal sequence of open-closed conformations that make up the channel&#8217;s activation mechanism, thus helping to understand their functions in health and disease.

Described here is a procedure for obtaining long stretches of current recording from one ion channel with the cell-attached patch-clamp technique. This method allows for observing, in real time, the pattern of open-close channel conformations that underlie the biological signal. These data inform about channel properties in undisturbed biological membranes.

Tek kanallı bir hücre-bağlı Patch-clamp kayıt

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate ...

Biyoloji

Cytosolic Calcium Measurements in Renal Epithelial Cells by Flow Cytometry

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial function, cell death, cell metabolism and cell migration to name but a few. Cytosolic calcium is normally maintained at low nanomolar concentrations; rather it is found in high micromolar to millimolar concentrations in the endoplasmic reticulum, mitochondrial matrix and the extracellular compartment. Upon stimulation, a transient increase in cytosolic calcium serves to signal downstream events. Detecting changes in cytosolic calcium is normally performed using a live cell imaging set up with calcium binding dyes that exhibit either an increase in fluorescence intensity or a shift in the emission wavelength upon calcium binding. However, a live cell imaging set up is not freely accessible to all researchers. Alternative detection methods have been optimized for immunological cells with flow cytometry and for non-immunological adherent cells with a fluorescence microplate reader. Here, we describe an optimized, simple method for detecting changes in epithelial cells with flow cytometry using a single wavelength calcium binding dye. Adherent renal proximal tubule epithelial cells, which are normally difficult to load with dyes, were loaded with a fluorescent cell permeable calcium binding dye in the presence of probenecid, brought into suspension and calcium signals were monitored before and after addition of thapsigargin, tunicamycin and ionomycin.

Calcium is involved in numerous physiological and pathophysiological signaling pathways. Live cell imaging requires specialized equipment and can be time consuming. A quick, simple method using a flow cytometer to determine relative changes in cytosolic calcium in adherent epithelial cells brought into suspension was optimized.

Sitometrisi ile Böbrek Hücrelerine sitozolik kalsiyum Ölçümleri

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial ...

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, electrical excitability and cell proliferation. The diversity and specificity of Ca2+ signaling derives from mechanisms by which Ca2+ signals are generated to act over different time and spatial scales, ranging from cell-wide oscillations and waves occurring over the periods of minutes to local transient Ca2+ microdomains (Ca2+ puffs) lasting milliseconds. Recent advances in electron multiplied CCD (EMCCD) cameras now allow for imaging of local Ca2+ signals with a 128 x 128 pixel spatial resolution at rates of &#62;500 frames sec-1 (fps). This approach is highly parallel and enables the simultaneous monitoring of hundreds of channels or puff sites in a single experiment. However, the vast amounts of data generated (ca. 1 Gb per min) render visual identification and analysis of local Ca2+ events impracticable. Here we describe and demonstrate the procedures for the acquisition, detection, and analysis of local IP3-mediated Ca2+ signals in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators using both wide-field epi-fluorescence (WF) and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Furthermore, we describe an algorithm developed within the open-source software environment Python that automates the identification and analysis of these local Ca2+ signals. The algorithm localizes sites of Ca2+ release with sub-pixel resolution; allows user review of data; and outputs time sequences of fluorescence ratio signals together with amplitude and kinetic data in an Excel-compatible table.

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Here we present techniques for imaging local IP3-mediated Ca2+ events using fluorescence microscopy in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators together with an algorithm that automates identification and analysis of these events.

Görüntüleme Yerel Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Kültürlenmiş memeli hücrelerinde sinyaller

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, ...

Implementing Patch Clamp and Live Fluorescence Microscopy to Monitor Functional Properties of Freshly Isolated PKD Epithelium

Cyst initiation and expansion during polycystic kidney disease is a complex process characterized by abnormalities in tubular cell proliferation, luminal fluid accumulation and extracellular matrix formation. Activity of ion channels and intracellular calcium signaling are key physiologic parameters which determine functions of tubular epithelium. We developed a method suitable for real-time observation of ion channels activity with patch-clamp technique and registration of intracellular Ca2+ level in epithelial monolayers freshly isolated from renal cysts. PCK rats, a genetic model of autosomal recessive polycystic kidney disease (ARPKD), were used here for ex vivo analysis of ion channels and calcium flux. Described here is a detailed step-by-step procedure designed to isolate cystic monolayers and non-dilated tubules from PCK or normal Sprague Dawley (SD) rats, and monitor single channel activity and intracellular Ca2+ dynamics. This method does not require enzymatic processing and allows analysis in a native setting of freshly isolated epithelial monolayer. Moreover, this technique is very sensitive to intracellular calcium changes and generates high resolution images for precise measurements. Finally, isolated cystic epithelium can be further used for staining with antibodies or dyes, preparation of primary cultures and purification for various biochemical assays.

Ion channels expressed in renal tubular epithelium play a significant role in the pathology of polycystic kidney disease. Here we describe experimental protocols used to perform patch-clamp analysis and intracellular calcium level measurements in cystic epithelium freshly isolated from rodent kidneys.

Patch Kelepçe ve Canlı Floresan Mikroskobu uygulanması Taze İzole PKD Epitelinin Fonksiyonel Properties Monitör

Cyst initiation and expansion during polycystic kidney disease is a complex process characterized by abnormalities in tubular cell proliferation, luminal ...

In Vivo Calcium Imaging of Neuronal Ensembles in Networks of Primary Sensory Neurons in Intact Dorsal Root Ganglia

Ca2+ imaging can be used as a proxy for cellular activity, including action potentials and various signaling mechanisms involving Ca2+ entry into the cytoplasm or the release of intracellular Ca2+ stores. Pirt-GCaMP3-based Ca2+ imaging of primary sensory neurons of the dorsal root ganglion (DRG) in mice offers the advantage of simultaneous measurement of a large number of cells. Up to 1,800 neurons can be monitored, allowing neuronal networks and somatosensory processes to be studied as an ensemble in their normal physiological context at a populational level in vivo. The large number of neurons monitored allows the detection of activity patterns that would be challenging to detect using other methods. Stimuli can be applied to the mouse hindpaw, allowing the direct effects of stimuli on the DRG neuron ensemble to be studied. The number of neurons producing Ca2+ transients as well as the amplitude of Ca2+ transients indicates sensitivity to specific sensory modalities. The diameter of neurons provides evidence of activated fiber types (non-noxious mechano vs. noxious pain fibers, A&#946;, A&#948;, and C fibers). Neurons expressing specific receptors can be genetically labeled with td-Tomato and specific Cre recombinases together with Pirt-GCaMP. Therefore, Pirt-GCaMP3 Ca2+ imaging of DRG provides a powerful tool and model for the analysis of specific sensory modalities and neuron subtypes acting as an ensemble at the populational level to study pain, itch, touch, and other somatosensory signals.

In Vivo Calcium Imaging of Neuronal Ensembles in Networks of Primary Sensory Neurons in Intact Dorsal Root Ganglia

This protocol describes the surgical exposure of the dorsal root ganglion (DRG) followed by GCaMP3 (genetically-encoded Ca2+ indicator; Green Fluorescent Protein-Calmodulin-M13 Protein 3) Ca2+ imaging of the neuronal ensembles using Pirt-GCaMP3 mice while applying a variety of stimuli to the ipsilateral hind paw.

İn Vivo Bozulmamış Dorsal Kök Ganglialarında Primer Duyusal Nöronların Ağlarında Nöronal Toplulukların Kalsiyum Görüntülenmesi

Ca2+ imaging can be used as a proxy for cellular activity, including action potentials and various signaling mechanisms involving Ca2+ entry into the ...

Imaging Calcium Dynamics in Subpopulations of Mouse Pancreatic Islet Cells

Pancreatic islet hormones regulate blood glucose homeostasis. Changes in blood glucose induce oscillations of cytosolic calcium in pancreatic islet cells that trigger secretion of three main hormones: insulin (from &#946;-cells), glucagon (&#945;-cells) and somatostatin (&#948;-cells). &#946;-Cells, which make up the majority of islet cells and are electrically coupled to each other, respond to the glucose stimulus as one single entity. The excitability of the minor subpopulations, &#945;-cells and &#948;-cells (making up around 20% (30%) and 4% (10%) of the total rodent1 (human2) islet cell numbers, respectively) is less predictable and is therefore of special interest.
Calcium sensors are delivered into the peripheral layer of cells within the isolated islet. The islet or a group of islets is then immobilized and imaged using a fluorescence microscope. The choice of the imaging mode is between higher throughput (wide-field) and better spatial resolution (confocal). Conventionally, laser scanning confocal microscopy is used for imaging tissue, as it provides the best separation of the signal between the neighboring cells. A wide-field system can be utilized too, if the contaminating signal from the dominating population of &#946;-cells is minimized.
Once calcium dynamics in response to specific stimuli have been recorded, data are expressed in numerical form as fluorescence intensity vs. time, normalized to the initial fluorescence and baseline-corrected, to remove the effects linked to bleaching of the fluorophore. Changes in the spike frequency or partial area under the curve (pAUC) are computed vs. time, to quantify the observed effects. pAUC is more sensitive and quite robust whereas spiking frequency provides more information on the mechanism of calcium increase.
Minor cell subpopulations can be identified using functional responses to marker compounds, such as adrenaline and ghrelin, that induce changes in cytosolic calcium in a specific populations of islet cells.

Here, we present a protocol for imaging and quantifying calcium dynamics in heterogeneous cell populations, such as pancreatic islet cells. Fluorescent reporters are delivered into the peripheral layer of cells within the islet, which is then immobilized and imaged, and per-cell analysis of the dynamics of fluorescence intensity is performed.

Fare Pankreas Adacık Hücrelerinin Alt Popülasyonlarında Görüntüleme Kalsiyum Dinamiği

Pancreatic islet hormones regulate blood glucose homeostasis. Changes in blood glucose induce oscillations of cytosolic calcium in pancreatic islet cells ...

<meta charset="utf8"></head><body>Kanal Aktivasyon Çalışmaları için Tek Hücreli Kalsiyum Görüntüleme

Single-Cell Calcium Imaging for Studying the Activation of Calcium Ion Channels

Single cell Ca2+ imaging is essential for the study of Ca2+ channels activated by various stimulations like temperature, voltage, native compound and chemicals et al. It primarily relies on microscopy imaging technology and the related Ca2+ indicator Fura-2/AM (AM is the abbreviation for Acetoxymethyl ester). Inside the cells, Fura-2/AM is hydrolyzed by esterases into Fura-2, which can reversibly bind with free cytoplasmic Ca2+. The maximum excitation wavelength shifts from 380nm to 340nm (when saturated with Ca2+) upon binding. The emitted fluorescence intensity is quantitatively related to the concentration of bound Ca2+. By measuring the 340/380 ratio, the Ca2+ concentration in the cytoplasm can be determined, eliminating errors caused by variations in the loading efficiency of the fluorescent probe among different samples. This technology allows for real-time, quantitative, and simultaneous monitoring of Ca2+ changes in multiple cells. The results are stored in &#8220;.XLSX&#8221; format for subsequent analysis, which is fast and generates intuitive change curves, greatly improving the detection efficiency. From different experimental perspectives, this article lists the use of this technology to detect Ca2+ signals in cells with endogenous or overexpressed channel proteins. Meantime, different methods for activating cells were also showed and compared. The aim is to provide readers with a clearer understanding of the usage and applications of single cell Ca2+ imaging.

<meta charset="utf8"></head><body>Kalsiyum iyon kanallarının aktivasyonunu incelemek için tek hücreli kalsiyum görüntüleme

This article presents a method for real-time, quantitative monitoring of calcium ion (Ca2+) concentrations in cells using single-cell Ca2+ imaging with the Fura-2/AM dye. This technique enables efficient dye loading and accurate calculation of Ca2+ levels through fluorescence intensity ratios, making it a simple and rapid approach for research applications.

Kalsiyum iyon kanallarının aktivasyonunu incelemek için tek hücreli kalsiyum görüntüleme

Single cell Ca2+ imaging is essential for the study of Ca2+ channels activated by various stimulations like temperature, voltage, native compound and ...