Min s. Kim ikinci John W. Kirklin Araştırma Bursu, torasik cerrahi, Graham Araştırma Vakfı, Houston Methodist özel Hekim Group Grant ve Michael M. ve Joann H. koni Araştırma Ödülü Amerikan Derneği hibe destek aldı. Ann Saikin dil yazması düzenleme için teşekkür ediyoruz.

Hayvan deneyleri protokollerde kurumsal hayvan bakım ve Houston Methodist Araştırma Enstitüsü'nde kullanım Komitesi tarafından onaylanmış ve bütün mevzuatı, yasalara, kurallara ve politikaları uygun olarak yürütülmektedir.
1. fare akciğer hasat
<ol><li>4 - için 6-hafta-yaşlı erkek Sprague-Dawley rat ketamin (100 mg/kg) ve xylazine (10 mg/kg) onun kanadını içinde bir mayi (IP) enjeksiyonla anestezi. Anestezi ne zaman hind bacak ayak forseps ile boğumlu bir devamsızlık hareketi için kontrol ederek emin olun.</li>
	<li>10 dk sonra göğüs ve karın tıraş ve deri bir klorheksidin bez ile silin.</li>
	<li>Cilt o forseps ile tespit ve tek kullanımlık neşterle incising kaldırın. Neşter ile incising tarafından göğüs boşluğuna açtıktan sonra ikili torakotomi sol göğüs kafesinin ön tarafında ve diyafram sağ tarafına makasla keserek gerçekleştirin. Not: Bu bir hayatta kalma sigara cerrahidir.</li>
	<li>Göğüs kafesi tutun ve 2 mL heparin (1000 adet/mL) 27 G iğne kullanarak kalbi sağ ventrikül enjekte. Not: Bu herhangi bir akciğer kan pıhtı oluşumunu engeller.</li>
	<li>Tamamen göğüs kafesi makasla çıkarın ve kan çıkana kadar bir 18 G iğne sol ventrikül bir havalandırma yerleştirin. Sonra heparinized fosfat tamponlu tuz (12.5 adet/mL; heparinized PBS) 15 mL 25 G iğne kullanılarak sağ ventrikül enjekte.</li>
	<li>İnferior ve superior vena kava, kalbin sağ tarafta iki büyük damarları keser ve akciğerler ile 27 G iğne kullanılarak sağ ventrikül heparinized PBS ek bir 10 mL sifonu. Not: İnferior vena kava kalbimle büyük bir gemi olarak altında görüntülenir kırmızı kan ile dolu. Benzer şekilde, üstün vena cava kalp üst kısmında büyük bir beden olarak görüntülenir.</li>
	<li>Trakea tiroid tabanında kesti. Hemiazygos ven ve dalları Aort kemer düzeyinde azalan aort dikkatli bir şekilde çıkarın.</li>
	<li>Göğüs boşluğuna ve vücudun kalan kısmına sıçan kalp-akciğer bloğundan çıkar.</li>
	<li>Sağ ve sol ventriküllerin yarısı keserek ventriculotomy gerçekleştirmek ve özel yapım bir doldurulmuş 18 G paslanmaz çelik iğne kanül ile sağ ventrikül ana pulmoner arter (PA) yerleştirin.</li>
	<li>Kanül ile 2-0 ipek kravat güvenli ve dikkatlice sağ ventrikül ve atrium bulaşmasına neden.</li>
	<li>Bir kadın radarı bölme içinde sol ventrikül yerleştirin ve 2-0 ipek kravat ile sabitleyin.</li>
	<li>PA kanül aracılığıyla heparinized PBS kalp-akciğer bloğu ile 20 mL sifonu ve kültür ortamı veya heparinized PBS içeren bir 50 mL tüp içinde yerleştirin. Not: adım biyoreaktör ayarlamak için 3.1 hücresel bir modeli için gidin. Bir acellular modeli için adım 2.1 decellularization için devam edin.</li>
</ol>2. akciğer Decellularization
<ol><li>
Decellularization birim hazırlanması
	<ol>
<li>Her decellularization odası/şişe şişe kapağı iki delik delme ve delik (Şekil 1A ve 1B) bir kadın radarı yakalamaya hazırlayın. Diğer tarafta bir siyah naylon halka ile güvenli. Benzer şekilde, başka bir şişe kapağı intravenöz set eki (Şekil 1 c) için tek bir delik matkap. Not: İki farklı taraf aynı şişe kapağıyla Şekil 1A ve 1B vardır. 2.1.1. adımda yukarıda belirtildiği gibi tek bir delik ile farklı bir kap Şekil 1 c olduğunu.</li>
		<li>Şişe kapakları (Şekil 1A ve 1B) içinde kadın bir radarı (at pulmoner arter veya PA bitiş) 0.5-inç tüp ve 6 inçlik tüpler (Şekil 1J) ekleyin ve bir erkek radarı kilit biter takın. 500 mL şişe ile kilit decellularization odası/şişe ayarlayın.</li>
		<li>Pompa baş (1E rakam ve 1F) bir kadın radarı bir kartuşla (Şekil 1G) tarafından bağlı olduğu pompa tüp (Şekil 1 H), her iki ucunun (hangi erkek radarı kilit ile bağlı) 2 2 ft tüp bir ucunu takın kilit (Şekil 1I).</li>
		<li>2 ft tüpler (2.1.3. adımdaki) her kadın radarı kilit kafasına decellularization odası/şişe kapağı (Şekil 1 L) için diğer ucunu bağlayın.</li>
		<li>Ters bir şişe şişe kapağı ve decellularization c bağlı 2 ft tüp yerine distal son eklenen bir intravenöz set (Şekil 1 d) proksimal ucu olan bir stand üzerinde asılı tarafından PBS şişeyle (PBS 200 mL) 250 mL kurmak heparinized hamber/şişe PA sonunda (Şekil 1B). Bu 2 ft tüp atma biberondan bağlayın. Not: resim 1 Kiçinde gösterildiği gibi karton, şişeleri ayarlanır. İntravenöz tüpler reaktifler akciğer iskele içinde dağıtmak için asılı şişe çıkması.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Akciğer decellularization işlemi
	<ol>
<li>Decellularization odası/şişe içinde serbestçe akar kadar 30 mm Hg (Şekil 1 K) bir fizyolojik perfüzyon basıncı heparinized PBS'yi çalıştırmak ve sonra kalp-akciğer bloğu PA kanül PA sonuna ekleyin.</li>
		<li>Herhangi bir aşırı arabellek/çözüm decellularization odası/şişe içinde atılan böylece pompa sürekli olarak çalışır durumda tutun.</li>
		<li>PA, perfüzyon basıncı 30 mm Hg (Şekil 1 K) ilk yıkama için 15 dakika ile heparinized PBS'yi çalıştırmak.</li>
		<li>Deiyonize su % 0,1 Sodyum Lauryl Sülfat (SDS) heparinized PBS şişe yerine ve decellularization için 2 h için akciğer sıvı.</li>
		<li>Decellularization sonra 15 dk akciğer iskele deiyonize suyla autoclaved su sıvı.</li>
		<li>Sonra %1 non-iyonik deterjan 10 dk deiyonize su sıvı.</li>
		<li>Decellularization odası/şişe 500 mL autoclaved PBS 1 x antibiyotik (penisilin-streptomisin amfoterisin) ile desteklenmiş asılı akciğer içinde şişe kapağı ile olduğu gibi tutmak yerine.</li>
		<li>Ayarlama, decellularization odası pulmoner arter sonuna geri atarak kapsayıcıya bağlı 2 ft tüpü yerleştirmek ve 6 mL/dk (Şekil 1 L) pompa çalıştırmak Intravenous atmak.</li>
		<li>Akciğerler için 72 h sıvı ve antibiyotik her 12 h PBS değişen tutmak. Not: Acellular akciğer hemen kullanıma hazırdır. İhtiyaç kadar-80 ˚C depolanabilir. Akciğer lobları pembe lekeler veya kan pıhtıları açıkça görüntülenmeyecektir Eğer akciğer atmak. Rastgele DNA ve histopatoloji için test etmek mümkündür. Tam bir acellular akciğer hücreleri ve DNA'ın % 99.9 yıkanması göstermez. Not: bir hücresel akciğer modeli ile çalışırken, decellularization atlayın. Hasat akciğer (adım 1) doğrudan biyoreaktör ayarlayabilirsiniz.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. biyoreaktör Set-up
<ol><li>Biyoreaktör şişe ve kurulum için gereken maddeleri hazır olun.<ol>
<li>Bir 500 mL şişe kapağı eşit uzaklıkta, üç delik ve bir kadın radarı siyah naylon halkalar (Şekil 2A ve 2B) kullanarak tüm üç delik olarak düzeltin. Not: bir ucunu şişenin iç yüzleri ise iki delik radarı kilit yüz dışı sona erer.</li>
		<li>6 pompa Tüp, 2 tüp, Tüp, 1,5 ft Tüp, 2 ft tüp ve 10 ft oxygenator tüp 6 biyoreaktör kesilmiş.</li>
		<li>18 G paslanmaz çelik iğne kesin ve tekrar, trakeal kanül biyouyumlu boruları ile biter takın.</li>
		<li>Oxygenator tüp radarı kilit konektörler otoklav bantlar (Şekil 2C) kullanarak bir solenoid hasır üstünde belgili tanımlık etraf ile sarın.</li>
		<li>Otoklav yukarıda bahsedilen öğeleri ve UV 10 dakikadır ışık tutun.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Normal hücre kültür inkübatör (37 ° C, % 5 CO2) içinde pompa ile kolayca 500 mL şişe sığdırmak için tepsiler arasındaki uygun aralığı ayarlayın.</li>
	<li>% 70 etanol pompası çıkarma, sprey ve pompa boru dişi radarı kilit konektörler pompa her iki ucundaki ile bağlayın.</li>
	<li>Pompa tüp ve biyoreaktör 1,5 ft tüp ile diğer ucunu bir ucunu (çıkış) oxygenator bağlanarak solenoid tel örgü hücre kültür inkübatör içinde sarılı oxygenator ayarlayın.</li>
	<li>Bir Biyogüvenlik biyoreaktör şişede aseptik koşullar ile kabine ayarlayın.<ol>
<li>PA üzerinden akışını denetlemek için kadın yapma biri kafasına bir 3-yönlü stopcock (sarı) eklemek</li>
		<li>Tek yönlü stopcock (mavi) başka bir kadın radarı kilit bölme trakea (Şekil 2F) tohum hücre için bağlayın.</li>
		<li>2. Boru dış bağlanmak (beyaz) ve medya dışarı dolaşmaya şişe içine tüp 6. Erkek radarı kilit 2 ft tüp için uygun ve bir kadın radarı lug stil eklemek veya bir şey kaldırmak için erişilebilirlik sağlamak için Tee ekleyebilirsiniz.</li>
		<li>Tek yönlü bir stopcock üç yönlü konnektör (kadın radarı lug tarzı Tee) açıklıklar birine iliştirin.</li>
		<li>Erkek radarı kilit ve kadın radarı kilit 2 ft tüpler için ekleyin.</li>
		<li>RPMI1640 200 mL % 10 FBS ve % 1 antibiyotik hücre kültür (hücre şartının değişir) orta ile ekleyin ve biyoreaktör kuluçka makinesi için transfer. Oxygenator tüp iki açık ucu için (tek yönlü stopcock ve Tee bağlayıcı) kapalı çevrim biyoreaktör sağlamak üzere bağlayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>O hiçbir hava kabarcıkları boru içinde pompa 6 mL/dk içinde hücre kültür kuluçka hücre kültür oxygenator ve tüpler, doldurmak için medya ile önceden çalıştırın.</li>
	<li>Tüpler ile dolu bir kez medya, stopcock kapatın ve biyoreaktör şişe biyoreaktör şişe her iki ucunda Oksijenatörler keserek kuluçka makinesi kaldırın.</li>
	<li>Biyoreaktör şişe içinde Biyogüvenlik kabini koymak, Kültür medya stopcock yoluyla geçmek ve akciğer iskele (acellular veya hücresel) PA kanül stopcock erkek radarı Bağlayıcısı aracılığıyla ekleyin. Not: Burada (decellularization süreç sonrasında) acellular modeli veya taze hasat kalp-akciğer bloğu kullanmak mümkün (yani, hücresel modeli, o kadar yerli fare hücreleri korur).</li>
	<li>Kültür medya yoluyla herhangi bir hava kaldırmak ve trakea ipek iplik tarafından trakeal kanül kravat tek yönlü bir stopcock geçmek.</li>
	<li>Herhangi bir PA ve trakea büküm önlemek emin olun. Yakın biyoreaktör şişe kapağı ile akciğer içinde İskele yapısı ve, tekrar, aseptik biyoreaktör kuluçka makinesi için aktarmak ve 6 mL/dk hızında pompa başlatın.</li>
	<li>Kültür medya tüm lob şişirilmiş ve iyi durumda (Şekil 2 g) akciğer görünüyor emin olmak 10-15 dk için çalıştırın.</li>
</ol>4. metastaz modeli ve hücre tohumlama
Not: Yukarıdaki akciğer modeli için bir birincil tümör büyüme çalışma ile tohum hücre geçin. Akciğer İskele yapısı-İskele (acellular veya hücresel) metastatik modeli için aşağıdaki gibi değiştirin.
<ol><li>Biyoreaktör ile akciğer iskele kuluçka makinesi üzerinden çıkar ve biyogüvenlik kabine koymuştum.</li>
	<li>Nefes borusu yoluyla kültür ortamının 5 mL geçmek ve biyoreaktör kap asarak da açmak için bir radarı kilit şırınga kullanın akciğer İskele yapısı-İskele (Şekil 2F).</li>
	<li>Bu adımda, bir kişi daha akciğer değişiklik metastatik manken için yardımcı olmak için gereklidir.</li>
	<li>İpek 2-0 açısal forseps trakea geçmekle çatallanma noktada yapmak için kullanın ve hazır olsun.</li>
	<li>Sağ akciğer çatallanma noktada olacak trakea kravat ve kültür ortamı geçirerek medya Sol akciğer için nefes borusu yoluyla serbest akışını kontrol edin. Not: trakea çatallanma noktada bağlı sonra nefes borusu seribaşı hücreleri otomatik olarak tohum sol lob için yönlendirilirsiniz. Bu hücreleri tohum önce nefes borusu yoluyla bastırıyor Kültür medya tarafından test edilebilir. Metastatik modelinde, medya sadece, şişirmek, sol lob ve sağ lob10hareket edecek.</li>
	<li>20 mL radarı kilit şırınga trakeal kanül üstüne ayarlayın ve RPMI1640 komple Kültür Medya (Şekil 2F) 50 mL ATCC akciğer kanseri hücreleri (A549, H1299) ekleyin.</li>
	<li>Biyogüvenlik kabini tohum hücre gerçekleştirin. Hücre 15 mL şırıngada ekleyin ve yerçekimi tarafından akciğer loblar geçmek. Herhangi bir hava kabarcıkları ile geçirmeden hücreleri geri kalanını ekleyin.</li>
	<li>Acellular akciğer tohum, biyoreaktör şişede damlama perfused medya toplamak ve nefes borusu tekrar 3 x geçmek izin. Not: Perfused medya bazen numaralı seribaşı kanser hücreleri vardır. Bu nedenle, verimli tohum için medya tekrar borusunda şırınga yerine koy.</li>
	<li>Seribaşı sonra şırınga kaldırmak için 15 dakika bekleyin, taze medya eklemek ve biyoreaktör kuluçka geri dönmek. Herhangi bir hava kabarcıkları boru içinde kaldırın.</li>
	<li>6 mL/dk medya sıvı pompa başlatın.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+Statistics,+2017.">Cancer Statistics, 2017.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 67 (1), 7-30 (2017).</li><li>Torre, L. A., Siegel, R. L., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+Cancer+Statistics.">Lung Cancer Statistics.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 893, 1-19 (2016).</li><li>Lallo, A., Schenk, M. W., Frese, K. K., Blackhall, F., Dive, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+cells+and+CDX+models+as+a+tool+for+preclinical+drug+development.">Circulating tumor cells and CDX models as a tool for preclinical drug development.</a> Translational Lung Cancer Research. 6 (4), 397-408 (2017).</li><li>Yang, S., Zhang, J. J., Huang, X. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+for+tumor+metastasis.">Mouse models for tumor metastasis.</a> Methods in Molecular Biology. 928, 221-228 (2012).</li><li>Bissell, M. J., Hines, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+don't+we+get+more+cancer?+A+proposed+role+of+the+microenvironment+in+restraining+cancer+progression.">Why don't we get more cancer? A proposed role of the microenvironment in restraining cancer progression.</a> Nature Medicine. 17 (3), 320-329 (2011).</li><li>Francia, G., Cruz-Munoz, W., Man, S., Xu, P., Kerbel, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+advanced+spontaneous+metastasis+for+experimental+therapeutics.">Mouse models of advanced spontaneous metastasis for experimental therapeutics.</a> Nature Reviews Cancer. 11 (2), 135-141 (2011).</li><li>Mishra, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+lung+cancer+cells+grown+in+an+ex+vivo+3D+lung+model+produce+matrix+metalloproteinases+not+produced+in+2D+culture.">Human lung cancer cells grown in an ex vivo 3D lung model produce matrix metalloproteinases not produced in 2D culture.</a> PloS One. 7 (9), e45308 (2012).</li><li>Vishnoi, M., Mishra, D. K., Thrall, M. J., Kurie, J. M., Kim, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+cells+from+a+4-dimensional+lung+cancer+model+are+resistant+to+cisplatin.">Circulating tumor cells from a 4-dimensional lung cancer model are resistant to cisplatin.</a> The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 148 (3), 1056-1063 (2014).</li><li>Mishra, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+profile+of+A549+cells+from+tissue+of+4D+model+predicts+poor+prognosis+in+lung+cancer+patients.">Gene expression profile of A549 cells from tissue of 4D model predicts poor prognosis in lung cancer patients.</a> International Journal of Cancer. Journal International du Cancer. , (2013).</li><li>Mishra, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+four-dimensional+lung+cancer+model+mimics+metastasis.">Ex vivo four-dimensional lung cancer model mimics metastasis.</a> The Annals of Thoracic Surgery. 99 (4), 1149-1156 (2015).</li><li>Mishra, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+lung+cancer+cells+grown+on+acellular+rat+lung+matrix+create+perfusable+tumor+nodules.">Human lung cancer cells grown on acellular rat lung matrix create perfusable tumor nodules.</a> The Annals of Thoracic Surgery. 93 (4), 1075-1081 (2012).</li><li>Pence, K. A., Mishra, D. K., Thrall, M., Dave, B., Kim, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+cancer+cells+form+primary+tumors+on+ex+vivo+four-dimensional+lung+model.">Breast cancer cells form primary tumors on ex vivo four-dimensional lung model.</a> Journal of Surgical Research. 210, 181-187 (2017).</li><li>Mishra, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Lung+Fibroblasts+Inhibit+Non-Small+Cell+Lung+Cancer+Metastasis+in+Ex+Vivo+4D+Model.">Human Lung Fibroblasts Inhibit Non-Small Cell Lung Cancer Metastasis in Ex Vivo 4D Model.</a> The Annals of Thoracic Surgery. 100 (4), 1167-1174 (2015).</li><li>Mishra, D. K., Miller, R. A., Pence, K. A., Kim, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+cell+and+non+small+cell+lung+cancer+form+metastasis+on+cellular+4D+lung+model.">Small cell and non small cell lung cancer form metastasis on cellular 4D lung model.</a> BMC Cancer. 18 (1), 441 (2018).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Ex vivo 4-D akciğer tümör büyüme ve metastaz bir laboratuvar tuzak içinde çalışma olanağı sağlar. Bir yerel akciğer matris normal doku için destek sağlar ve hücre-hücre etkileşimleri, hücre-matris etkileşimleri, hücresel başkalaşım ve doku organizasyon korur karmaşık bir sistemdir. Tümör büyüme üzerindeki etkileri ve diğer hücreleri ile etkileşim çalışmaya herhangi bir tümör microenvironment bileşenleri eklemek için bir fırsat sağlar.
Akciğer hasat ex vivo 4-D akciğer modeli için kritik bir adımdır. Heparin enjeksiyon torasik açtıktan sonra yönetiminde bir gecikme reaktifleri serbest akışını decellularization sırasında etkileyebilir akciğerlerde kan pıhtısı neden olabilir. Renksiz bir sıvı havalandırma gelene bir doğru ile heparinized PBS kızarma özellikle hücresel modeliyle önemlidir. Üstün vena cava dikkatli kesme PA herhangi bir zarar önlemek önemlidir Decellularization işlemi sırasında akciğer iskele hareketli hava kabarcıklarını önlemek çok önemlidir. Hava kabarcıkları varlığı yavaşlatmak veya reaktifler akışını durdurmak ve katkıda bulunmak için uygun olmayan bir decellularization. Kabarcıklar 10-20 mL şırınga kullanarak kabarcıklar emerek kaldırılabilir. PA kanül değil bükülmüş emin olmak çok önemlidir. Biyoreaktör kurulumu sırasında herhangi bir boru içinde büküm bir pop-up konektörler, neden ve olabilir kuluçka makinesi içinde tam bir karmaşa neden. Kanül büküm önlemek için kanül/iğne kesilebilir ve bağlantıları bozmadan kanül döndürmek için gerekli esneklik sağlar biyouyumlu boru kullanarak yeniden bağlandı. Herhangi bir sızıntı kuluçka makinesi içinde kültür ortamının daha fazla bir profesyonel temizlik gereken. Metastaz modeli oluşturulurken, dikkatli dikiş trakea çatallanma sitesinde gereklidir. Herhangi bir delik akciğer veya soluk borusu hücreleri ve tutarsız sonuçlar sızıntı neden olabilir.
Onlar bir ek ile metastaz önemli biyolojik adımda çalışmaya fırsat sağlar gibi geleneksel 3D hücre kültürleri kanser ilerlemesi, daha iyi anlamak için çeşitli avantajlar acellular ve hücresel ex vivo 4-D akciğer modelleri var Akış boyutu. Her ikisi misal biyoloji tümör büyüme ve metastazı taklit ve farklı gen imzalar, tedavilere yanıt ve ilaç direnci gelişimi daha iyi anlamak için kanser büyüme aşamalarında tümör hücreleri toplamak için bir fırsat sağlar. Bir akciğer matris olmasına rağmen çeşitli kurulan hücre satırları ve primer hücre büyümeye potansiyele sahiptir. Ex vivo 4-D modeli > 10 milyon hücrelerinin metastaz çalışmaya tohum gereksinimi kısıtlamasıdır. Hücreleri düşük bir proliferatif potansiyeli olan metastatik lezyon göstermek için daha uzun sürebilir. Ayrıca, hücreleri seribaşı bir kez bu model daha aseptik koşullar gerektirir.

Kanser metastaz çoğu kanser ölümler arkasında suçlu olduğunu ve son meydan kanser mücadele çalışmalarında teşkil etmektedir. Bu yöntem genel amacı yanı sıra üç boyutlu (3-b) hücre büyüme akışının bir boyut olan bir dört boyutlu (4 D) hücre kültürü için bir protokol tasarlamaktır. Metastaz işlemi [yani, tümör hücreleri (CTCs) ve metastatik lezyonlar dolaşan birincil tümörün] üç farklı aşamalarında temsil eder.
Son üç yılda dünya çapında bilim geliştirilmiş bir tedavi mi, yoksa ilerleme-Alerjik yaşam beklentisi farklı kanser metastatik ilerlemesinde temel mekanizmaları anlamak için bilgi benzersiz bir zenginlik vermiştir. Meme kanseri gibi bazı kanser türleri klinik yönetiminin1önemli ölçüde geliştirilmiş; Ancak, akciğer kanseri gibi bazı kanser türleri hala zavallı hayatta kalma2var. Vitro ve in vivo hayvan modelleri yeni görüşler hastalık gelişimi destekleyecek mekanizmalar oluşturmak için vesile olmuştur. Son birkaç yıl içinde xenografts (CDX) satır elde edilen hücre ve hasta elde edilen xenografts (PDX) birincil insan tümör3, büyüme kinetik gibi birçok ilgili özellikleri histolojik özellikleri, davranış korumak gibi daha fazla ilgi olmuştur özellikleri ve tedaviye yanıt. Ancak, her model CTC oluşumu ve metastaz uzak organ4,5,6mekanizmasını anlamak için kendi sınırlamaları vardır.
Son zamanlarda, organ yeniden yapılanma ve perfüzyon tabanlı hücre kültürü kavramı kullanarak bir 4-D ex vivo akciğer kanseri modeli geliştirdik. Zaman içinde kanser salgılanan benzer bir insanla büyümek perfusable tümör nodüller oluşturarak insan akciğer kanser büyüme taklit eden protein üretim7. Kanserli hastalarda zavallı hayatta kalma öngörür ve ayrıca sisplatin tedavisi8,9üzerine tümör regresyon tarafından tedavi edici bir yanıt gösteren gen ifade imza temsil eder. Metastatik lezyonlar oluşturabilir böylece akciğer modeli daha da güncellenmiştir. CTCs birincil tümör ve intravasate damarlara geliştirmek ve metastatik lezyonlar10kurmaya kontralateral akciğer extravasate. Gen ifadesi çalışmaları birincil tümör, CTCs ve metastatik lezyonlar farklı ifade profil ve fenotip10için gerekli genler alt kümesini upregulation öneririm. Kanserli hastalarda görülen biyolojik koşulların varlığı nedeniyle metastatik bu işlem gerçekleşir. Bu modelin avantajı, doğal bir matris ve mimari varlığı ve tümör nodüller oluşumuna yol açar bir perfüzyon besin olduğunu. Buna ek olarak, aynı zamanda farklı bileşenleri tümör microenvironment veya uyuşturucu etkileri, tümör gelişimi zaman içinde çalışma olanağı sağlar. Bu model bir Aralık kanser hücrelerinin (akciğer kanseri, meme kanseri, sarkom vb) bir laboratuvar kurulumu büyümeye kullanılabilir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sprague Dowley rat</td>
			<td>Harlan</td>
			<td>206M</td>
			<td>Male</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorhexidine swab</td>
			<td>Prevantics, NY, USA</td>
			<td>NDC 10819-1080-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sagent Pharmaceuticals, Schaumburg, IL, USA</td>
			<td>NDC 25021-400-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18-gauge needle</td>
			<td>McMaster Carr, USA</td>
			<td>75165A249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-0 silk tie</td>
			<td>Ethicon, San Angelo, TX, USA</td>
			<td>A305H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S pump</td>
			<td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td>
			<td>EW-07554-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S pump head</td>
			<td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td>
			<td>EW-07519-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S pump cartridge</td>
			<td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td>
			<td>EW-07519-70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon Tube</td>
			<td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td>
			<td>14171211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MasterFlex Pump tube</td>
			<td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td>
			<td>06598-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female luer lock connectors</td>
			<td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td>
			<td>45508-34</td>
			<td>75165A249</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Male luer lock connectors</td>
			<td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td>
			<td>45513-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>black nylon ring</td>
			<td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td>
			<td>EW-45509-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intravenous set</td>
			<td>CareFusion</td>
			<td>41134E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>CAS151-21-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotics</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone oxygenator</td>
			<td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td>
			<td>ABW00011</td>
			<td>Saint-GoBain-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wire mesh</td>
			<td>1164610105</td>
			<td>Lowes</td>
			<td>New York Wire</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female luer Lug Style TEE</td>
			<td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td>
			<td>45508-56</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Male luer integral lock ring to 200series Barb</td>
			<td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td>
			<td>45518-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female luer thread style coupler</td>
			<td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td>
			<td>45508-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clave connector</td>
			<td>ICU Medical</td>
			<td>11956</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hi-Flo &#8482;4-way Stopcock w/swivel male luer lock</td>
			<td>smith Medical</td>
			<td>MX9341L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MasterFlex Pump tube</td>
			<td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td>
			<td>06598-13</td>
			<td>for cannula</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

acellular and cellular lung model to study tumor metastasis

Tümör hücrelerinin tümör progresyon farklı noktalarda ayırmak zordur. Biz tümör hücreleri doğal bir matris ile etkileşim ve besin sürekli akışı gösterebilir bir ex vivo akciğer modeli, hem de tümör hücreleri normal hücresel bileşenleri ile etkileşim ve doğal bir matris gösterir bir model oluşturdu. Acellular ex vivo akciğer modeli bir sıçan kalp-akciğer bloğu izole edip decellularization işlemini kullanarak tüm hücreleri çıkarmadan oluşturulur. Sağ ana bronş kapalı bağladılar ve tümör hücreleri borusunda bir şırınga tarafından yerleştirilir. Hücreleri taşımak ve sol akciğer doldurmak. Akciğer sonra nerede bir kapalı devre içinde sürekli bir akış medya, pulmoner arter alır bir biyoreaktör yerleştirilir. Sol akciğer yetiştirilen birincil tümör tümördür. Dolaşımdaki medyada izole tümör hücrelerinin tümör hücreleri dolaşan vardır ve sağ akciğer tümör hücrelerinde metastatik lezyonlar vardır. Hücresel ex vivo akciğer modeli decellularization işleminin atlayarak oluşturulur. Her model farklı araştırma soruları cevaplamak için kullanabilirsiniz.

Sıçan gelen hasat akciğer sağlam damarlara ve alveoller11 (Şekil 3A ve 3B) tutar. Decellularization, kolajen, fibronektin ve elastin, gibi bir acellular akciğer hücre dışı matriks bileşenlerinin11 (Şekil 3 c, 3D, 3Eve 3F) korunur. Decellularization yerli fare hücreleri mevcut Hematoksilen ve eozin (H & E) tarafından gözlenen akciğerlerde tümüyle kaldırılmasını yol açar devamsızlık hücre ve DNA tutarı ( bir azalma gösterilen DNA analizi11 tarafından gösterilen boyama Şekil 3D ve 3 G). Ex vivo 4-D akciğer modeli yapışık hücreleri12her türlü büyümek için kullanılabilir. Akciğer kanseri, akciğer fibroblast, meme kanseri ve sarkoma hücreleri trakea11,12,13-tohum tarafından yetiştirilmiştir. Metastaz modeli lobektomi10tarafından birincil tümör dokusu, CTCs ve metastatik lezyonlar koleksiyonu farklı zaman aralıklarında olanak sağlar. Dokuları H & E boyama sağlam damarlara ve alveoller hem hücresel ve acellular modelde (Şekil 3 H ve 3I) gösterdi. Microenvironment farklı bileşenleri arasındaki etkileşimi incelemek için bir eklenti modeli acellular 4-D akciğer modelidir. Hücresel 4-D akciğer modeli yok bağışıklık hücreleri14ile bir bozulmamış akciğer microenvironment sağlar. Bağışıklık hücreleri bu modeli tümör büyüme üzerindeki etkileri ve tümör hücreleri ile etkileşim çalışmaya damarlara aracılığıyla eklenebilir. Tekrarlanabilirlik ve kalite modelinin model içinde yinelenen çalıştırıp doku/hücre H & E ve hücrenin özgü işaretleri kullanarak immünhistokimya analiz tespit edilebilir. Şekil 4 ex vivo akciğer 4-D model oluşturmada önemli adımları temsil eden bir Şematik diyagramı gösterilmektedir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58145/58145fig1.jpg"> Şekil 1: akciğer iskele decellularization birimi için gerekli öğeler. (A ve B) 500 mL şişe kapakları delinir ve dişi radarı konektörler kombinasyonunun ayarlandığı boru ile decellularization şişe oluşturmak için. (C), (D) akciğer iskele pulmoner arter akıyor reaktif için ayarla Intravenous ayarlamak için tek bir delik için başka bir şişe kapağı ihtiyacı var. Pompa (File) bir pompa, (E) bir pompa baş ve (G) bir kartuş kurmak. (H) pompa her son, bağlayıcılar (ı) ve (J) adlı kadın radarı bağlayıcısıyla bağlayıcı her iki ucunda (Kkadar) decellularization birim ayarlamak için gerekli olan erkek radarı ile tüplerin boru. (L) akciğer iskele kapalı döngü sistemi 1 x antibiyotik antimycotic PBS ile 3-5 d için yıkanır. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58145/58145fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58145/58145fig2.jpg"> Resim 2: Biyoreaktör set-up bir ex vivo akciğer 4-D hücre kültürü için. (A ve B) biyoreaktör (500 mL) şişe kapakları delinir ve üç kadın radarı kilit bağlayıcı eklenir ve bir siyah naylon yüzükle sabit. (C) 10 ft oxygenator tüp erkek radarı ayrılmaz kilit halkaları her iki ucundaki çelik hasır solenoid etrafında sarılır. (D) A pulmoner arter kanül ve (E) trakeal kanül 18 G iğne ve pompa tüp kullanılarak hazırlanır. (F) A 20 mL şırınga tek yönlü trakea bağlayıcı hücreleri epitelyal alanda akciğer iskele, temel için ayarlanır. (G) kapalı çevrim biyoreaktör perfüzyon ve tümör büyümesi için hücre kültür inkübatör içinde ayarlanır. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58145/58145fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58145/58145fig3.jpg"> Şekil 3: Temsilcisi görüntüleri metastaz için ex vivo 4-D akciğer modelinin. (A) bir olduğu gibi kalp-akciğer bloğu 4 - için 6-hafta-yaşlı sıçan gelen hasat. (B) histopatoloji alveoller ve pneumocytes gösterir. (C) Decellularization akciğer hücreleri tamamen kaldırılması için yol açar. (D) histopatoloji acellular ciğerli sağlam bir membran gösterir. (E ve F) Movat'ın pentachrome ve elastin leke kollajen, fibrin ve elastin sağlam damarlara ve bronş ile varlığını ortaya koymaktadır. (G) DNA analizi fazla % 99 DNA içeriğinde azalma gösterir. (H) hücresel akciğer biyoreaktör doğrudan hücre kültürü için kullanılabilir ve (ben) bir histolojik analiz tümör büyüme varlığını gösterir. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58145/58145fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58145/58145fig4.jpg"> Şekil 4: Şematik diyagramı Binbaşı gösterilen adımları ex vivo 4-D akciğer modelinin oluşturulmasında. 1. adımda bir sıçan gelen bir kalp-akciğer bloğu hasat edilir. Çalışma şartının, adım 2, akciğerleri de doğrudan hücresel model olarak kullanılabilir veya herhangi bir yerel hücreleri kaldırmak için decellularized. Bir sonraki adım biyoreaktör ve hücre tohum akciğer model kurma içerir. Son olarak, Biyoreaktörler kuluçka hücre kültürü için hazırdır. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58145/58145fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Acellular and Cellular Lung Model to Study Tumor Metastasis at JoVE.com

Acellular and Cellular Lung Model to Study Tumor Metastasis

Tümör metastazı çalışmaya acellular ve hücresel akciğer modeli

Burada, tümör hücreleri ve metastatik lezyonlar dolaşan bir protokol tümör progresyon adımları taklit eder ve birincil tümörün izole etmek için yardımcı olan bir ex vivo akciğer kanseri modeli için mevcut.

It is difficult to isolate tumor cells at different points of tumor progression. We created an ex vivo lung model that can show the interaction of tumor ...

acellular-and-cellular-lung-model-to-study-tumor-metastasis

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Cancer Research

7.5K Görüntüleme.  Houston Methodist Hospital Research Institute. Burada, tümör hücreleri ve metastatik lezyonlar dolaşan bir protokol tümör progresyon adımları taklit eder ve birincil tümörün izole etmek için yardımcı olan bir ex vivo akciğer kanseri modeli için mevcut.

Video: Acellular and Cellular Lung Model to Study Tumor Metastasis

Lung Tumor Cell Recruitment Assay

To investigate the molecular mechanisms governing tumor metastasis, various assays using the mouse as a model animal have been proposed. Here, we demonstrate a simple assay to evaluate tumor cell extravasation or micrometastasis. In this assay, tumor cells were injected through the tail vein, and after a short period, the lungs were dissected and digested to count the accumulated labeled tumor cells. This assay skips the initial step of primary tumor invasion into the blood vessel and facilitates the study of events in the distant organ where tumor metastasis occurs. The number of cells injected into the blood vessel can be optimized to observe a limited number of metastases. It has been reported that stromal cells in the distant organ contribute to metastasis. Thus, this assay could be a useful tool to explore potential therapeutic drugs or devices for prevention of tumor metastasis.

This manuscript describes a method to quantify tumor cell accumulation in the lungs in an animal model of tumor metastasis.

Akciğer tümör hücre işe alım tahlil

To investigate the molecular mechanisms governing tumor metastasis, various assays using the mouse as a model animal have been proposed. Here, we ...

Kanser Araştırmaları

In Vivo Model for Testing Effect of Hypoxia on Tumor Metastasis

Hypoxia has been implicated in the metastasis of Ewing sarcoma (ES) by clinical observations and in vitro data, yet direct evidence for its pro-metastatic effect is lacking and the exact mechanisms of its action are unclear. Here, we report an animal model that allows for direct testing of the effects of tumor hypoxia on ES dissemination and investigation into the underlying pathways involved. This approach combines two well-established experimental strategies, orthotopic xenografting of ES cells and femoral artery ligation (FAL), which induces hindlimb ischemia. Human ES cells were injected into the gastrocnemius muscles of SCID/beige mice and the primary tumors were allowed to grow to a size of 250 mm3. At this stage either the tumors were excised (control group) or the animals were subjected to FAL to create tumor hypoxia, followed by tumor excision 3 days later. The efficiency of FAL was confirmed by a significant increase in binding of hypoxyprobe-1 in the tumor tissue, severe tumor necrosis and complete inhibition of primary tumor growth. Importantly, despite these direct effects of ischemia, an enhanced dissemination of tumor cells from the hypoxic tumors was observed. This experimental strategy enables comparative analysis of the metastatic properties of primary tumors of the same size, yet significantly different levels of hypoxia. It also provides a new platform to further assess the mechanistic basis for the hypoxia-induced alterations that occur during metastatic tumor progression in vivo. In addition, while this model was established using ES cells, we anticipate that this experimental strategy can be used to test the effect of hypoxia in other sarcomas, as well as tumors orthotopically implanted in sites with a well-defined blood supply route.

In Vivo Model for Testing Effect of Hypoxia on Tumor Metastasis

This manuscript describes the development of an animal model that allows for the direct testing of the effects of tumor hypoxia on metastasis and the deciphering the mechanisms of its action. Although the experiments described here focus on Ewing sarcoma, a similar approach can be applied to other tumor types.

Tümör metastaz üzerinde Hipoksi Test Etkisinin Vivo Modeli

Hypoxia has been implicated in the metastasis of Ewing sarcoma (ES) by clinical observations and in vitro data, yet direct evidence for its pro-metastatic ...

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the context of a whole organism. Sophisticated techniques to generate genetic mosaics facilitate induction of visually marked, genetically defined clones surrounded by normal tissue. The clones can be analyzed through diverse molecular, cellular and omics approaches. This study describes how to generate fluorescently labeled clonal tumors of varying malignancy in the eye/antennal imaginal discs (EAD) of Drosophila larvae using the Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. It describes procedures how to recover the mosaic EAD and brain from the larvae and how to process them for simultaneous imaging of fluorescent transgenic reporters and antibody staining. To facilitate molecular characterization of the mosaic tissue, we describe a protocol for isolation of total RNA from the EAD. The dissection procedure is suitable to recover EAD and brains from any larval stage. The fixation and staining protocol for imaginal discs works with a number of transgenic reporters and antibodies that recognize Drosophila proteins. The protocol for RNA isolation can be applied to various larval organs, whole larvae, and adult flies. Total RNA can be used for profiling of gene expression changes using candidate or genome-wide approaches. Finally, we detail a method for quantifying invasiveness of the clonal tumors. Although this method has limited use, its underlying concept is broadly applicable to other quantitative studies where cognitive bias must be avoided.

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

This protocol demonstrates how to generate fluorescently marked, genetically defined clonal tumors in the Drosophila eye/antennal imaginal discs (EAD). It describes how to dissect the EAD and brain from the third instar larvae and how to process them to visualize and quantify gene expression changes and tumor invasiveness.

<em&gt; Drosophila</em&gt; Hayali Disk Tümör Modeli: Genetik Mozaikler kullanma Gen İfade ve Tümör invazivliğinin Görselleştirme ve

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Advanced Animal Model of Colorectal Metastasis in Liver: Imaging Techniques and Properties of Metastatic Clones

Patients with a limited number of hepatic metastases and slow rates of progression can be successfully treated with local treatment approaches1,2. However, little is known about the heterogeneity of liver metastases, and animal models capable of evaluating the development of individual metastatic colonies are needed. Here, we present an advanced model of hepatic metastases that provides the ability to quantitatively visualize the development of individual tumor clones in the liver and estimate their growth kinetics and colonization efficiency. We generated a panel of monoclonal derivatives of HCT116 human colorectal cancer cells stably labeled with luciferase and tdTomato and possessing different growth properties. With a splenic injection followed by a splenectomy, the majority of these clones are able to generate hepatic metastases, but with different frequencies of colonization and varying growth rates. Using the In Vivo&#160;Imaging System (IVIS), it is possible to visualize and quantify metastasis development with in vivo luminescent and ex vivo fluorescent imaging. In addition, Diffuse Luminescent Imaging Tomography (DLIT) provides a 3D distribution of liver metastases in vivo. Ex vivo fluorescent imaging of harvested livers provides quantitative measurements of individual hepatic metastatic colonies, allowing for the evaluation of the frequency of liver colonization and the growth kinetics of metastases. Since the model is similar to clinically observed liver metastases, it can serve as a modality for detecting genes associated with liver metastasis and for testing potential ablative or adjuvant treatments for liver metastatic disease.

The ability of metastatic clones to colonize distant sites depends on their proliferation capacity and/or their ability to survive in the host microenvironment without significant proliferation. Here, we present an animal model that allows quantitative visualization of both types of liver colonization by metastatic clones.

İleri Hayvan Karaciğer Kolorektal Metastaz Model: Görüntüleme Teknikleri ve Metastatik Klonların Özellikleri

Patients with a limited number of hepatic metastases and slow rates of progression can be successfully treated with local treatment approaches1,2. ...

A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast cancer metastasis, and results in poor outcomes with median survival rates of only 4.8 - 15 months. Current rodent models of breast cancer metastasis, including primary tumor cell xenograft and spontaneous tumor models, rarely metastasize to the liver. Intracardiac and intrasplenic injection models do result in liver metastases, however these models can be confounded by concomitant secondary-site metastasis, or by compromised immunity due to removal of the spleen to avoid tumor growth at the injection site. To address the need for improved liver metastasis models, a murine portal vein injection method that delivers tumor cells firstly and directly to the liver was developed. This model delivers tumor cells to the liver without complications of concurrent metastases in other organs or removal of the spleen. The optimized portal vein protocol employs small injection volumes of 5 - 10 &#956;l, &#8805; 32 gauge needles, and hemostatic gauze at the injection site to control for blood loss. The portal vein injection approach in Balb/c female mice using three syngeneic mammary tumor lines of varying metastatic potential was tested; high-metastatic 4T1 cells, moderate-metastatic D2A1 cells, and low-metastatic D2.OR cells. Concentrations of &#8804; 10,000 cells/injection results in a latency of ~ 20 - 40 days for development of liver metastases with the higher metastatic 4T1 and D2A1 lines, and &#62; 55 days for the less aggressive D2.OR line. This model represents an important tool to study breast cancer metastasis to the liver, and may be applicable to other cancers that frequently metastasize to the liver including colorectal and pancreatic adenocarcinomas.

A surgical procedure was developed to deliver mammary tumor cells to the murine liver via portal vein injection. This model permits investigation of late stages of liver metastasis in a fully immune competent host, including tumor cell extravasation, seeding, survival, and metastatic outgrowth in the liver.

Bir Portal Ven Enjeksiyon Modeli Karaciğer Metastazı Meme Kanseri Eğitim için

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast ...

Intracarotid Cancer Cell Injection to Produce Mouse Models of Brain Metastasis

Metastasis, the spread and growth of malignant cells at secondary sites within a patient&#39;s body, accounts for &#62; 90% of cancer-related mortality. Recently, impressive advances in novel therapies have dramatically prolonged survival and improved quality of life for many cancer patients. Sadly, incidence of brain metastatic recurrences is fast rising, and all current therapies are merely palliative. Hence, good experimental animal models are urgently needed to facilitate in-depth studies of the disease biology and to assess novel therapeutic regimens for preclinical evaluation. However, the standard in vivo metastasis assay via tail vein injection of cancer cells produces predominantly lung metastatic lesions; animals usually succumb to the lung tumor burden before any meaningful outgrowth of brain metastasis. Intracardiac injection of tumor cells produces metastatic lesions to multiple organ sites including the brain; however, the variability of tumor growth produced with this model is large, dampening its utility in evaluating therapeutic efficacy. To generate reliable and consistent animal models for brain metastasis study, here we describe a procedure for producing experimental brain metastasis in the house mouse (Mus musculus) via intracarotid injection of tumor cells. This approach allows one to produce large number of brain metastasis-bearing mice with similar growth and mortality characteristics, thus facilitating research efforts to study basic biological mechanisms and to assess novel therapeutic agents.

Brain metastasis has become an urgent unmet medical need as its incidence has increased while therapeutic options have remained palliative. Creating experimental animal models of brain metastasis via intracarotid arterial injection of cancer cells facilitates mechanistic studies of the disease biology and evaluation of novel intervention regimens.

Intracarotid Kanser Hücre Enjeksiyon Beyin metastaz Fare modelleri üretmek için

Metastasis, the spread and growth of malignant cells at secondary sites within a patient&#39;s body, accounts for &#62; 90% of cancer-related mortality. ...

Micromanipulation of Circulating Tumor Cells for Downstream Molecular Analysis and Metastatic Potential Assessment

Blood-borne metastasis accounts for&#160;most cancer-related deaths and involves circulating tumor cells (CTCs) that are successful in establishing new tumors at distant sites. CTCs are found in the bloodstream of patients as single cells (single CTCs) or as multicellular aggregates (CTC clusters and CTC-white blood cell clusters), with the latter displaying a higher metastatic ability. Beyond enumeration, phenotypic and molecular analysis is extraordinarily important to dissect CTC biology and to identify actionable vulnerabilities. Here, we provide a detailed description of a workflow that includes CTC immunostaining and micromanipulation, ex vivo culture to assess&#160;proliferative and survival capabilities of individual cells, and in vivo metastasis-formation assays. Additionally, we provide a protocol to achieve the dissociation of CTC clusters into individual cells and the investigation of intra-cluster heterogeneity. With these approaches, for instance, we precisely quantify survival and proliferative potential of single CTCs and individual cells within CTC clusters, leading us to the observation that cells within clusters display better survival and proliferation in ex vivo cultures compared to single CTCs. Overall, our workflow offers a platform to dissect the characteristics of CTCs at the single cell level, aiming towards the identification of metastasis-relevant pathways and a better understanding of CTC biology.

Here, we present an integrated workflow to identify phenotypic and molecular features that characterize circulating tumor cells (CTCs). We combine live immunostaining and robotic micromanipulation of single and clustered CTCs with single cell-based techniques for downstream analysis and assessment of metastasis-seeding ability.

Akım moleküler Analizi ve metastatik potansiyel değerlendirme için sirkülasyon tümör hücrelerinin mikromanipülasyon

Blood-borne metastasis accounts for&#160;most cancer-related deaths and involves circulating tumor cells (CTCs) that are successful in establishing new ...

Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous metastasis models are available. Thus, the experimental metastasis model involving tail-vein injection of suitable cell lines is a mainstay of metastasis research. When cancer cells are injected into the lateral tail-vein, the lung is their preferred site of colonization. A potential limitation of this technique is the accurate quantification of the metastatic lung tumor burden. While some investigators count macrometastases of a pre-defined size and/or include micrometastases following sectioning of tissue, others determine the area of metastatic lesions relative to normal tissue area. Both of these quantification methods can be exceedingly difficult when the metastatic burden is high. Herein, we demonstrate an intravenous injection model of lung metastasis followed by an advanced method for quantifying metastatic tumor burden using image analysis software. This process allows for investigation of multiple end-point parameters, including average metastasis size, total number of metastases, and total metastasis area, to provide a comprehensive analysis. Furthermore, this method has been reviewed by a veterinary pathologist board-certified by the American College of Veterinary Pathologists (SEK) to ensure accuracy.

Intravenous injection of cancer cells is often used in metastasis research, but the metastatic tumor burden can be difficult to analyze. Herein, we demonstrate a tail-vein injection model of metastasis and include a novel approach to analyze the resulting metastatic lung tumor burden.

Tümör Hücrelerinin Lateral Kuyruk-Damar Enjeksiyonu Sonrasında Akciğer Metastazının Patolojik Analizi

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous ...

Using Computer-based Image Analysis to Improve Quantification of Lung Metastasis in the 4T1 Breast Cancer Model

Breast cancer is a devastating malignancy, accounting for 40,000 female deaths and 30% of new female cancer diagnoses in the United States in 2019 alone. The leading cause of breast cancer related deaths is the metastatic burden. Therefore, preclinical models for breast cancer need to analyze metastatic burden to be clinically relevant. The 4T1 breast cancer model provides a spontaneously-metastasizing, quantifiable mouse model for stage IV human breast cancer. However, most 4T1 protocols quantify the metastatic burden by manually counting stained colonies on tissue culture plates. While this is sufficient for tissues with lower metastatic burden, human error in manual counting causes inconsistent and variable results when plates are confluent and difficult to count. This method offers a computer-based solution to human counting error. Here, we evaluate the protocol using the lung, a highly metastatic tissue in the 4T1 model. Images of methylene blue-stained plates are acquired and uploaded for analysis in Fiji-ImageJ. Fiji-ImageJ then determines the percentage of the selected area of the image that is blue, representing the percentage of the plate with metastatic burden. This computer-based approach offers more consistent and expeditious results than manual counting or histopathological evaluation for highly metastatic tissues. The consistency of Fiji-ImageJ results depends on the quality of the image. Slight variations in results between images can occur, thus it is recommended that multiple images are taken and results averaged. Despite its minimal limitations, this method is an improvement to quantifying metastatic burden in the lung by offering consistent and rapid results.

We describe a more consistent and expeditious method to quantify lung metastasis in the 4T1 breast cancer model by using Fiji-ImageJ.

4T1 Meme Kanseri Modelinde Akciğer Metastazının Nicelleştirilmesini Geliştirmek Için Bilgisayar Tabanlı Görüntü Analizinin Kullanılması

Breast cancer is a devastating malignancy, accounting for 40,000 female deaths and 30% of new female cancer diagnoses in the United States in 2019 alone. ...

Zebrafish Model of Neuroblastoma Metastasis

Zebrafish has emerged as an important animal model to study human diseases, especially cancer. Along with the robust transgenic and genome editing technologies applied in zebrafish modeling, the ease of maintenance, high-yield productivity, and powerful live imaging altogether make the zebrafish a valuable model system to study metastasis and cellular and molecular bases underlying this process in vivo. The first zebrafish neuroblastoma (NB) model of metastasis was developed by overexpressing two oncogenes, MYCN and LMO1, under control of the dopamine-beta-hydroxylase (d&#946;h) promoter. Co-overexpressed MYCN and LMO1 led to the reduced latency and increased penetrance of neuroblastomagenesis, as well as accelerated distant metastasis of tumor cells. This new model reliably reiterates many key features of human metastatic NB, including involvement of clinically relevant and metastasis-associated genetic alterations; natural and spontaneous development of metastasis in vivo; and conserved sites of metastases. Therefore, the zebrafish model possesses unique advantages to dissect the complex process of tumor metastasis in vivo.

This paper introduces the method of developing, characterizing, and tracking in real-time the tumor metastasis in zebrafish model of neuroblastoma, specifically in the transgenic zebrafish line with overexpression of MYCN and LMO1, which develops metastasis spontaneously.