Yazarlar Ming-Min Chang ve Bayan Ya-Hsin Cheng ve teknik destek için teşekkür etmek istiyorum. Bu eser Tayvan'ın Bakanlığı Bilim ve teknoloji tarafından desteklenmiştir (en-103-2325-B-006-009, en-104-2325-B-006-001, en-105-2325-B-006-001 ve MOST-106-2320-B-006-068-MY3) ve Sağlık Bakanlığı ve refah (MOHW106-TDU-B-211-144004). Biz de onların çok foton confocal mikroskop için destek için minnettar College of Medicine, Ulusal Cheng Kung Üniversitesi, temel araştırma laboratuardan vardır.

Bizim Enstitüsü (bakım ve kullanım Laboratuvar hayvanlarının, NCKU Tıp Fakültesi Kılavuzu) esaslarına göre fareler üzerinde tüm deneyler yapıldı.
1. hazırlanması aletleri, Kültür Medya ve yemekleri
<ol><li>Steril Cerrahi dikişler, 1 mL şırınga ile 26 G/0.5 cm iğne (için kuyruk ven enjeksiyon), deneysel protokoller başlamadan önce elde etmek 3 mL batar (için akciğer perfüzyon), 24G/3 cm iğne ile Dulbecco'nın modifiye kartal medya (DMEM), tripsin-EDTA çözüm (5 g/M tripsin ve 0,53 mM), fetal Sığır serum (FBS), 1 x PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2PHO4ve 1.8 mM KH2PO4) ve 6 cm kültür yemekleri.</li>
</ol>2. hazırlık ve kurtarma süspansiyon tümör hücrelerinin
<ol><li>Steril Dulbecco'nın modifiye kartal medya (% 10 veya % 20 içeren DMEM) hazırlamak FBS ve taze eklemek 2 mM L-glutamin, 1 x PBS ve % 0.05 tripsin-EDTA.</li>
	<li>DMEM % 10 ile desteklenmiş hücrelerde kültür FBS 37 ° C'de ve kültür tabak içinde % 70-80 izdiham kadar onları büyümek.</li>
	<li>Kültür Medya (DMEM) 2 mL steril 1 x PBS ile iki yıkama ardından yemekleri kaldırın.</li>
	<li>1 mL % 0.05 ekleyin tripsin-EDTA bulaşıkları içine iyice hücrelerin tümünü kapsayacak şekilde. Çözüm 800 μL kaldırmak ve sadece 200 μL yemekleri bırakılır. Yemekler için 30 37 ° C'de kuluçkaya s 1 dk (türüne bağlı olarak hücre) ve beklemek-e kadar askıya alınmış durumda hücrelerin çoğu için.</li>
	<li>Taze DMEM 1 mL ekleyin % 10 içeren FBS doğrudan içine yemekler tripsin ve şiddetle enzimatik faaliyetleri durdurmak için hücre süspansiyon yukarı ve aşağı bir tek hücre süspansiyon hazırlamak için 1000 µL pipet ile pipette.</li>
	<li>Hücreleri yemek 1.5 mL microcentrifuge tüp aktarmak ve spin 162 x g 3 dk de oda sıcaklığında hücreleri aşağı.</li>
	<li>Süpernatant Aspire edin ve 1,5 mL %20 FBS ve bitti sıra içeren DMEM tümör hücreleri resuspend süspansiyon için 2 h 37 ° C'de hücrelerde döndürün. Not: taze orta % 20 içeren ile eski orta orta kurtarma sırasında sarı dönüşürse, Döviz FBS.</li>
</ol>3. floresans boyama ve tümör hücreleri Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester (CFSE) ile süspansiyon Analizi
<ol><li>Hücre kurtarma süspansiyon sonra Trypan mavi bir Neubauer odası dozlarda boyama floresan titrating için sayma ile uygun uygun hücre sayıları saymak ve kuyruk için enjeksiyon damar.</li>
	<li>162 x g 3 dk ve resuspend pelleted hücreleri 1 ml 1 x 162 x g 3 dk de oda sıcaklığında Santrifüjü ardından PBS, steril oda sıcaklığında, hücreleri aşağı spin.</li>
	<li>1 X PBS 10 içeren 500 µL pelleted hücrelerde resuspend % FBS ve 0, 5, 10, 20 veya 40 µM CFSE için doz titrasyon ve hücre süspansiyon 37 oC 10 dk içinde belgili tanımlık karanlık, kuluçkaya.</li>
	<li>162 x g 3 dakika oda sıcaklığında, hücreleri aşağı spin ve 4 mL % 1'i içeren DMEM pelleted hücrelerle resuspend FBS. Bu çamaşır üç kez daha tekrarlayın. DMEM için son yıkama yalnız 4 mL pelleted hücrelerle resuspend.</li>
	<li>CFSE etiketli hücreleri tek bir hücre floresans yoğunluğunu ölçmek için (FACS) analizi sıralama floresans aktif hücreye konu veya damar enjeksiyon kuyruk. Not: hücreler FACS analiz veya kuyruk ven enjeksiyonları gerçekleştirmeden önce buz üzerinde tutmak.</li>
</ol>4. akciğer kolonizasyon tahlil
<ol><li>20 µM CFSE etiketli hücreleri hazırlayın (3,4 adımları 3.1'e bakınız). Not: CFSE çalışma doz tümör hücreleri, FACS analiz titrasyon sonuçlara dayanarak etiketleme için karar (adım 3.3 için bakınız).</li>
	<li>4-6 hafta kuyruk ısınmak-eski erkek C57BL/6 (6 fareler) 5-10 dk fare fare olarak fare kuyruğu damarlar dilate için halide lambalı fareler.</li>
	<li>İyice karıştırın ve CFSE etiketli tümör hücreleri hücre süspansiyon (5 x 106 hücre/mL son hücre yoğunluğu ile) herhangi bir kabarcıkları kaçınarak bir 1 mL (26Gx1/2) şırınga ile Aspire edin.</li>
	<li>Dikkatli bir şekilde enjekte 1 x106 CFSE etiketli tümör hücreleri DMEM 200 µL bir fare restrainer saplanmış fare kuyruğu ven içine. Not: iğne kuyruğu ven lümen içinde doğrudan yerleştirilmişse enjeksiyon sırasında tümör hücreleri kolayca dolaşıma şırıngayı zor itmek gerek kalmadan teslim edilmelidir. İle tümör hücreleri itmek zor olsa da, onlar büyük olasılıkla kuyruk ven dışında subkutan uzaya enjekte edilmiş.</li>
	<li>İntravenöz CFSE etiketli tümör hücreleri iki gruba alınan fareler bölün: bir grup tarafından confocal mikroskobu takip akciğer perfüzyon tabi ve ImageJ miktar akciğer kolonizasyon tahlil ve diğeri sol tek başına 4-5 için hafta içinde uzun vadeli akciğer kolonizasyon tahlil.</li>
	<li>20, 38 veya 45 h ve intravenöz enjekte bir saat ders ve doz bağımlı titrasyon sırasında 1 x 106 tümör hücreleri ile tümörü taşıyan fareler ile iyi kabul edilen ve uygun anesthetizer2350-75 mg/kg zoletil 50, anestezi. Not: Kullanım veteriner merhem kuruluk anestezi iken altında önlemek için fareler'ın gözleri.</li>
	<li>Boyuna deri ve subkutan doku karın üzerinden göğüs bölgesine cerrahi makasla kesme. Plevral boşluğu cerrahi makas ve tam olarak kalp ve akciğerler duyurmak forseps ile açın. Not: kan damarları keserek önlemek dikkatli olun.</li>
	<li>Üstün vena kava (SVC) ve inferior vena kava (IVC) geri tepme perfüzyon çözüm akciğer perfüzyon sırasında önlemek için steril cerrahi sütür ile kravat.</li>
	<li>Sol ventrikül duvar akciğer perfüzyon çözümden boşaltmak için bir çatlak (yaklaşık 2-4 mm) açmak için cerrahi makas ile kesme.</li>
	<li>1 x PBS 3 mL şırınga ile sağ ventrikül enjekte ve akciğerleri kırmızımsı bir renk için tamamen solgun çevirmek kadar süzülmüş çözüm sürekli emme sırasında akciğer perfüzyon kaldırın.</li>
</ol>5. confocal mikroskobik görüntüleme ve çözümleme-in akciğer kolonize tümör hücreleri
<ol><li>Şimdi-soluk akciğerler plevral boşluğundan kaldır ve beş loblar uzakta nefes borusu ve bağ dokusu bağ cerrahi makas ve forseps24ile keserek ayırın.</li>
	<li>Retiküle doku Akciğer lobları yerleşim için iki çubuklar arasında bir boşluk ile üretmek için Şekil 3B ' naylon dikiş sarma tarafından yaklaşık iki metal çubuklar gösterildiği gibi bir sedye gibi akciğer tutucu hazırlayın. Akciğer tutucu bir 6 cm tabak içinde ayarlayın. Not: Akciğer tutucu Akciğer lobları objektif lens confocal mikroskop altında stabilize etmek için kullanılır.</li>
	<li>Lodge ve Akciğer lobları akciğer tutucu retiküle dokusu üzerinde düzeltin. Kapak ve Akciğer lobları 1 x PBS ile nemlendirin.</li>
	<li>Konu Akciğer lobları akciğer kolonileşmesi tümör hücreleri kayıt floresans çekim confocal mikroskobu akciğer sahibine üzerinde barındıran 6 cm kültür çanak.</li>
	<li>Görüntüleme için objektif lens kullanımı (5 X, MPLN, NA: 0.1, WD: 20, hava).</li>
	<li>NIBA (uyarma/emisyon; 470-495 nm/510-550 nm) için filtre tekerleği döndürün ve CFSE açıkça Akciğer lobları floresans nokta görüntülerini görselleştirmek için heyecanlandırmak için 488 nm lazer kullanın.</li>
	<li>(İçin MaiTai HP DeepSee lazer) R690 için filtre tekerleği döndürün 2.0 ile taramak için µs/piksel scanning hız ve HV, kazanç ve ofset iyimserlik düzeyleri.</li>
	<li>Floresan (512 x 512 piksel) bir 10 ile belgili tanımlık mikroskop bilgisayar yazılımı kullanarak çekim µs/piksel tarama hızı.</li>
	<li>Ölçmek ve istatistiksel analiz mikroskobik görüntüleri önceden açıklanan21ImageJ ve GraphPad yazılım kullanarak.</li>
</ol>6. uzun vadeli akciğer kolonizasyon deneyleri
Not: 4.1 4.5 aracılığıyla adımları yineleyin.
<ol><li>Tümör hücre aşılama için 4-5 hafta sonra farelerin kurban ve onların akciğer Bouin'ın sıvı25 ile 1-2 gün için tamir.</li>
	<li>Ölçmek ve istatistiksel analiz üzerinden yazılım21ile fareler akciğer tümörü nodüller.</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Uzun vadeli akciğer kolonizasyon deneyleri, burada in vivo akciğer kolonizasyonu CTCs tarafından uzak organlarda değerlendirmek için istihdam metodoloji açıkça örtüsünü açmak ve kolonileşmesi içinde CTCs üzerinde monte polyFN belirli rol Ayrıştırılan kısa vadeli ile birlikte akciğer, ekstravazasyonu ve metastatik işlemleri18,19,20,21yol açtı. Her ne kadar uzun ...

Metastaz kanser ölüm1,2önemli nedenidir. Birincil dokulardan türetilmiş tümör hücreleri kan dolaşımı süspansiyon girin ve önce onlar are çeşitli Hematojen zorluklar, Örneğin, anoikis, bağışıklık saldırı ve zararlar tansiyon ya da geometrik kısıtları, yamultma stres nedeniyle hayatta uzak organ metastazı3,4,5,6başarı dikte önemli bir adım kolonize etmek mümkün. Bu nedenle, dinç çabaları şu anda dolaşımdaki tümör hücreleri (CTCs) karakterize ve bu özellikleri tümör habis, metastaz ve sağkalım oranları kanser hastaları7,8 ile korele yapılmıştır , 9. kanser metastaz işlemini özellikle vivo içinde olay gösterir, hayvan modelleri metastaz10,11,12 tam sistemik süreci yakalar tek yaklaşım vardır .
CTCs metastatik tümör doku uzak organlara1,2kolonizasyon dahil olmak üzere birden çok hücresel olaylar aracılığıyla olur. Ancak, en yaygın kullanılan metastaz deneyleri13,14,15 değil uzak organlara kolonizasyon CTC gözlemlemek için bir yol sağlar. Bu nedenle, bir CTC kolonizasyon görselleştirme için in vivo tahlil tasarım acilen ihtiyacım vardı. Her ne kadar birkaç vivo içinde ve ex vivo kısa dönem akciğer kolonizasyon deneyleri tasarlanmış, sorunları ve dezavantajları kalır. Örneğin, yeşil floresans protein (GFP) iken-overexpressing tümör hücreleri bu kullanılmıştır deneyleri22,23, stabil transfect ve yeterli GFP floresan yoğunluğu altında ile tümör hücreleri clone için sürüyor mikroskop. Her ne kadar uzun vadeli hücre izleyici CFSE ile tümör hücrelerinin geçici boyama GFP ifade tümör hücreleri değiştirmek için istihdam edilmiş, benzer şekilde, bu zor CFSE etiketli tümör hücreleri bağlı olup olmadığını yargılamak ya da sadece mevcut içinde kalır damarlara eksize uzak organlara16,17.
Polimer fibronektin (polyFN) CTCs yüzeylerde monte eleştirel metastatik tümör doku18,19,20,21,22 son kurulması için katkıda bulundu . Burada, kısa vadeli askıya alınmış Lewis Akciğer Karsinomu (LLCs) hücreleri stabil FN-shRNA (shFN) veya scramble-shRNA (shScr) ifade ve CFSE ile önceden etiketli akciğer kolonizasyon deneyleri intravenöz C57BL/6 fareler aşısını gerçekleştirilen. 2-3 gün sonra fare akciğerler ilk fosfat tamponlu tuz (tabi önce bekâr CTCs damarlara içinde tamamen kaldırmak için PBS) ile confocal mikroskobu ve akciğer kolonileşmesi LLCs miktar periosteum. Biz açıkça akciğer kolonileşmesi shFN LLCs sayıda ve tümör nodüller önemli ölçüde shScr önemli ölçüde CTCs polyFN derlemede rolü kolonizasyon ve CTCs içinde gelişimini kolaylaştıran corroborating LLCs ile karşılaştırıldığında azalma olduğunu göstermiştir Akciğerler. Bizim çalışma daha fazla rol için incelenmesi kanser metastaz polyFN garanti eder.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin&#160;(BSA)</td>
			<td>Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan)</td>
			<td>101-9048-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bouin&#39;s Fluid</td>
			<td>MCC(medical chemical corporation)/POISON</td>
			<td>456-A-1GL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFSE Proliferation Dye</td>
			<td>ebiosciences</td>
			<td>65-0850-85</td>
			<td>Full name: Carboxyfluorescein succinimidyl ester</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Media (DMEM)&#160;</td>
			<td>(Gibco)ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12100-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan)</td>
			<td>101-6381-92-6</td>
			<td>For prepared trypsin-EDTA solution( Final concentration: 0.53mM )&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>(Gibco)ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10437-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lewis lung carcinoma (LLC)</td>
			<td>ATCC, Manassas, VA, USA</td>
			<td>CRL-1642</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine, USP&#160;</td>
			<td>(Gibco)ThermoFisher Scientific</td>
			<td>21051-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan)</td>
			<td>101-7447-40-7</td>
			<td>For prepared 1X PBS ( Final concentration: 2.7mM )</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic (KH2PO4)</td>
			<td>Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan)</td>
			<td>101-7778-77-0</td>
			<td>For prepared 1X PBS ( Final concentration: 1.8mM )</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan)</td>
			<td>101-7647-14-5</td>
			<td>For prepared 1X PBS ( Final concentration: 137mM )</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4)</td>
			<td>Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan)</td>
			<td>101-10039-32-4</td>
			<td>For prepared 1X PBS ( Final concentration: 10mM )</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T6146</td>
			<td>0.5 g mix with 100 mL 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T4799</td>
			<td>For prepared trypsin-EDTA solution ( Final concentration: 5g/L )</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zoletil 50</td>
			<td>Virbac</td>
			<td></td>
			<td>To dilute with 1X PBS&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact Tabletop Centrifuge 2420</td>
			<td>KUBOTA Co.</td>
			<td>2420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture dish (6cm)</td>
			<td>Wuxi NEST Biotechnology Co.</td>
			<td>705001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable syringe (with needle)</td>
			<td>Perfect Medical Industry Co.</td>
			<td></td>
			<td>24G/3 cm;3 ml &#38; 26G/0.5 cm;1 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>End over end mixer</td>
			<td>C.T.I YOUNG CHENN</td>
			<td>TS-20</td>
			<td>For suspended cells recovery&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSCalibur (FACS)</td>
			<td>BD biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Dimeda</td>
			<td>10.102.14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forma Direct Heat CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td>HEPA CLASS 100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse restrainer (Cylindrical Restrainer 15-30 gm)</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>51338</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiphoton Confocal Microscope BX61WI</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV1000MPE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer counting chamber</td>
			<td>Marienfeld-Superior</td>
			<td>640010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissor</td>
			<td>Dimeda</td>
			<td>08.370.11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical sutures&#160;</td>
			<td>UNIK SURGICAL SUTURES MFG. CO.</td>
			<td>NO. 0034</td>
			<td>Black Braided silk; non-absorbable (25YD; U.S.P. 4/0)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>Wuxi NEST Biotechnology Co.</td>
			<td>615001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Greiner tube</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>188271</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the establishment of a lung colonization assay for circulating tumor cell visualization in lung tissues

Metastaz kanser ölüm başlıca nedenidir. Tümör hücreleri (CTCs) kanseri metastaz, içinde akciğer kolonizasyonu CTCs tarafından katkıda eleştirel için erken akciğer metastatik oluşum, teşvik dolaşan rolü şiddetle araştırmış. Bu nedenle, hayvan modelleri metastaz tam sistemik süreci yakalar tek yaklaşım vardır. Verilen bu CTCs katkılar kan damarı ekstravazasyonu incelenmesi için önceki Deneysel tasarımlar sorun oluşursa, biz hangi bir in vivo akciğer kolonizasyon tahlil kurulan bir uzun vadeli floresans hücre-izleyici, carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE), askıya alınan tümör hücreleri etiketlemek için kullanılan ve akciğer perfüzyon akciğer Temizleme, confocal görüntüleme ve miktar önce özellikle kapana CTCs temizlemek için gerçekleştirildi. Polimer fibronektin (polyFN) CTC yüzeylerde monte akciğer kolonizasyon metastatik tümör doku son kurulmasında aracılık tespit edilmiştir. Burada, özellikle CTCs polyFN derlemede akciğer kolonizasyon ve ekstravazasyonu için gereksinim test etmek için biz kısa vadeli gerçekleştirilen akciğer kolonizasyon deneyleri hangi askıya stabil FN-shRNA (shFN) ifade Lewis Akciğer Karsinomu Hücre (LLCs) veya Scramble-shRNA (shScr) ve önceden etiketli 20 mikron CFSE intravenöz C57BL/6 fareler aşılanmış. Biz başarıyla fare akciğerlerde kolonize etmek shFN LLC hücreleri yeteneklerini shScr LLC hücreleri ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde azalmış gösterdi. Bu nedenle, özellikle CTCs yeteneğini akciğerlerde kolonize dolaşım içinde göstermek için kısa vadeli bu yöntemi yaygın olarak uygulanabilir.

Vivo akciğer kolonizasyon tahlil gerçekleştirmeden önce akciğer kolonizasyon ve/veya metastaz, kolaylaştırma ekstravazasyonu polyFN askıya alınmış tümör hücreleri üzerinde aracılık olup olmadığını sınamak için Şekil 1A gösterildiği gibi biz ilk farklı titre CFSE, hücre geçirgen ve kovalent hücre içi Amin içeren moleküller26,27 ' askıya alınan tümör hücrel...

Watch this Scientific Journal Video about The Establishment of a Lung Colonization Assay for Circulating Tumor Cell Visualization in Lung Tissues at JoVE.com

The Establishment of a Lung Colonization Assay for Circulating Tumor Cell Visualization in Lung Tissues

Bir hayvan modeli tümör hücreleri (CTCs) kanseri metastaz sırasında akciğer kolonizasyon teşvik dolaşan rolü deşifre için gereklidir. Burada kurduk ve başarıyla gerçekleştirilen bir vivo içinde tahlil özel olarak test etmek için gereksinimin akciğer kolonizasyon için CTCs polimer fibronektin (polyFN) Meclisi.

Tümör hücre görselleştirme akciğer dokusu içinde dolaşan bir akciğer kolonizasyon tahlil kurulması

Metastasis is the major cause of cancer death. The role of circulating tumor cells (CTCs) in promoting cancer metastasis, in which lung colonization by ...

the-establishment-lung-colonization-assay-for-circulating-tumor-cell

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Cancer Research

9.2K Görüntüleme.  National Cheng Kung University. Bir hayvan modeli tümör hücreleri (CTCs) kanseri metastaz sırasında akciğer kolonizasyon teşvik dolaşan rolü deşifre için gereklidir. Burada kurduk ve başarıyla gerçekleştirilen bir vivo içinde tahlil özel olarak test etmek için gereksinimin akciğer kolonizasyon için CTCs polimer fibronektin (polyFN) Meclisi.

Video: The Establishment of a Lung Colonization Assay for Circulating Tumor Cell Visualization in Lung Tissues

Lung Tumor Cell Recruitment Assay

To investigate the molecular mechanisms governing tumor metastasis, various assays using the mouse as a model animal have been proposed. Here, we demonstrate a simple assay to evaluate tumor cell extravasation or micrometastasis. In this assay, tumor cells were injected through the tail vein, and after a short period, the lungs were dissected and digested to count the accumulated labeled tumor cells. This assay skips the initial step of primary tumor invasion into the blood vessel and facilitates the study of events in the distant organ where tumor metastasis occurs. The number of cells injected into the blood vessel can be optimized to observe a limited number of metastases. It has been reported that stromal cells in the distant organ contribute to metastasis. Thus, this assay could be a useful tool to explore potential therapeutic drugs or devices for prevention of tumor metastasis.

This manuscript describes a method to quantify tumor cell accumulation in the lungs in an animal model of tumor metastasis.

Akciğer tümör hücre işe alım tahlil

To investigate the molecular mechanisms governing tumor metastasis, various assays using the mouse as a model animal have been proposed. Here, we ...

Kanser Araştırmaları

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the context of a whole organism. Sophisticated techniques to generate genetic mosaics facilitate induction of visually marked, genetically defined clones surrounded by normal tissue. The clones can be analyzed through diverse molecular, cellular and omics approaches. This study describes how to generate fluorescently labeled clonal tumors of varying malignancy in the eye/antennal imaginal discs (EAD) of Drosophila larvae using the Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. It describes procedures how to recover the mosaic EAD and brain from the larvae and how to process them for simultaneous imaging of fluorescent transgenic reporters and antibody staining. To facilitate molecular characterization of the mosaic tissue, we describe a protocol for isolation of total RNA from the EAD. The dissection procedure is suitable to recover EAD and brains from any larval stage. The fixation and staining protocol for imaginal discs works with a number of transgenic reporters and antibodies that recognize Drosophila proteins. The protocol for RNA isolation can be applied to various larval organs, whole larvae, and adult flies. Total RNA can be used for profiling of gene expression changes using candidate or genome-wide approaches. Finally, we detail a method for quantifying invasiveness of the clonal tumors. Although this method has limited use, its underlying concept is broadly applicable to other quantitative studies where cognitive bias must be avoided.

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

This protocol demonstrates how to generate fluorescently marked, genetically defined clonal tumors in the Drosophila eye/antennal imaginal discs (EAD). It describes how to dissect the EAD and brain from the third instar larvae and how to process them to visualize and quantify gene expression changes and tumor invasiveness.

<em&gt; Drosophila</em&gt; Hayali Disk Tümör Modeli: Genetik Mozaikler kullanma Gen İfade ve Tümör invazivliğinin Görselleştirme ve

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Practical Considerations in Studying Metastatic Lung Colonization in Osteosarcoma Using the Pulmonary Metastasis Assay

The pulmonary metastasis assay (PuMA) is an ex vivo lung explant and closed cell culture system that permits researchers to study the biology of lung colonization in osteosarcoma (OS) by fluorescence microscopy. This article provides a detailed description of the protocol, and discusses examples of obtaining image data on metastatic growth using widefield or confocal fluorescence microscopy platforms. The flexibility of the PuMA model permits researchers to study not only the growth of OS cells in the lung microenvironment, but also to assess the effects of anti-metastatic therapeutics over time. Confocal microscopy allows for unprecedented, high-resolution imaging of OS cell interactions with the lung parenchyma. Moreover, when the PuMA model is combined with fluorescent dyes or fluorescent protein genetic reporters, researchers can study the lung microenvironment, cellular and subcellular structures, gene function, and promoter activity in metastatic OS cells. The PuMA model provides a new tool for osteosarcoma researchers to discover new metastasis biology and assess the activity of novel anti-metastatic, targeted therapies.

The goal of this article is to provide a detailed description of the protocol for the pulmonary metastasis assay (PuMA). This model permits researchers to study metastatic osteosarcoma (OS) cell growth in lung tissue using a widefield fluorescence or confocal laser-scanning microscope.

Metastatik akciğer kolonizasyon pulmoner metastaz tahlil kullanarak osteosarkom içinde eğitim pratik düşünceler

The pulmonary metastasis assay (PuMA) is an ex vivo lung explant and closed cell culture system that permits researchers to study the biology of lung ...

Utilization of Ultrasound Guided Tissue-directed Cellular Implantation for the Establishment of Biologically Relevant Metastatic Tumor Xenografts

Preclinical testing of anticancer therapies relies on relevant xenograft models that mimic the innate tendencies of cancer. Advantages of standard subcutaneous flank models include procedural ease and the ability to monitor tumor progression and response without invasive imaging. Such models are often inconsistent in translational clinical trials and have limited biologically relevant characteristics with low proclivity to produce metastasis, as there is a lack of a native microenvironment. In comparison, orthotopic xenograft models at native tumor sites have been shown to mimic the tumor microenvironment and replicate important disease characteristics such as distant metastatic spread. These models often require tedious surgical procedures with prolonged anesthetic time and recovery periods. To address this, cancer researchers have recently utilized ultrasound-guided injection techniques to establish cancer xenograft models for preclinical experiments, which allows for rapid and reliable establishment of tissue-directed murine models. Ultrasound visualization also provides a noninvasive method for longitudinal assessment of tumor engraftment and growth. Here, we describe the method for ultrasound-guided injection of cancer cells, utilizing the adrenal gland for NB and renal sub capsule for ES. This minimally invasive approach overcomes tedious open surgery implantation of cancer cells in tissue-specific locations for growth and metastasis, and abates morbid recovery periods. We describe the utilization of both established cell lines and patient derived cell lines for orthotopic injection. Pre-made commercial kits are available for tumor dissociation and luciferase tagging of cells. Injection of cell suspension using image-guidance provides a minimally invasive and reproducible platform for the creation of preclinical models. This method is utilized to create reliable preclinical models for other cancers such as bladder, liver and pancreas exemplifying its untapped potential for numerous cancer models.

Here, we present a protocol to utilize ultrasound-guided injection of neuroblastoma (NB) and Ewing's sarcoma (ES) cells (established cell lines and patient-derived tumor cells) at biologically relevant sites to create reliable preclinical models for cancer research.

Ultrason kullanımı doku Yönetmen: hücresel implantasyon biyolojik ilgili metastatik tümör Xenografts kurulması için güdümlü

Preclinical testing of anticancer therapies relies on relevant xenograft models that mimic the innate tendencies of cancer. Advantages of standard ...

Acellular and Cellular Lung Model to Study Tumor Metastasis

It is difficult to isolate tumor cells at different points of tumor progression. We created an ex vivo lung model that can show the interaction of tumor cells with a natural matrix and continual flow of nutrients, as well as a model that shows the interaction of tumor cells with normal cellular components and a natural matrix. The acellular ex vivo lung model is created by isolating a rat heart-lung block and removing all the cells using the decellularization process. The right main bronchus is tied off and tumor cells are placed in the trachea by a syringe. The cells move and populate the left lung. The lung is then placed in a bioreactor where the pulmonary artery receives a continual flow of media in a closed circuit. The tumor grown on the left lung is the primary tumor. The tumor cells that are isolated in the circulating media are circulating tumor cells and the tumor cells in the right lung are metastatic lesions. The cellular ex vivo lung model is created by skipping the decellularization process. Each model can be used to answer different research questions.

Here, we present a protocol for an ex vivo lung cancer model that mimics the steps of tumor progression and helps to isolate a primary tumor, circulating tumor cells, and metastatic lesions.

Tümör metastazı çalışmaya acellular ve hücresel akciğer modeli

It is difficult to isolate tumor cells at different points of tumor progression. We created an ex vivo lung model that can show the interaction of tumor ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as tumors. Because digital polymerase chain reactions (PCR) enable the precise quantification of DNA copy number variants, they are becoming an essential tool for detecting rare genetic variations, such as drug-resistant mutations. It is expected that molecular diagnoses using digital PCR (dPCR) will be available in clinical practice in the near future; thus, how to efficiently conduct dPCR with human genetic material is a hot topic. Here, we introduce a method to detect Adenomatous polyposis coli (APC) somatic mosaicism using dPCR with the chip-in-a-tube format, which allows eight dPCR reactions to be simultaneously conducted. Care should be taken when filling and sealing the reaction mixture on the chips. This article demonstrates how to avoid the over- and underestimation of positive partitions. Furthermore, we present a simple procedure for collecting the dPCR product from the partitions on the chips, which can then be used to confirm the specific amplification. We hope that this methods report will help promote the dPCR with the chip-in-a-tube method in genetic research.

Digital polymerase chain reaction (PCR) is a useful tool for the high-sensitivity detection of single nucleotide variants and DNA copy number variants. Here, we demonstrate key considerations for measuring rare variants in the human genome using digital PCR with the chip-in-a-tube format.

Dijital polimeraz zincir reaksiyonu tahlil için tüp içinde çip biçimini kullanarak bir sporadik ailesel Adenomatous poliposis hastada genetik varyasyon

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

Digital Analysis of Immunostaining of ZW10 Interacting Protein in Human Lung Tissues

The purpose of this study is to introduce a methodology of the immunostaining of human lung tissues, followed by whole-slide digital scanning and image analysis. Digital scanning is a fast way to scan a stack of slides and produce digital images with high quality. It can produce concordant results with conventional light microscopy (CLM) by pathologists. Furthermore, the availability of digital images makes it possible that the same slide can be concurrently observed by multiple people. Moreover, digital images of slides can be stored in a database, which means the long-term deterioration of glass slides is avoided. The limitations of this technique are as follows. First, it needs high-quality prepared tissue and the original immunohistochemistry (IHC) slides without any damage or excess sealant residue. Second, tumor or nontumor areas should be specified by experienced pathologists before the analysis using software, in order to avoid any confusion about the tumor or nontumor areas during scoring. Third, the operator needs to control the color reproduction throughout the digitization process in whole-slide imaging.

ZW10 interacting protein (ZWINT) participates in the mitotic spindle checkpoint and the pathogenesis of carcinoma. Here, we introduce a methodology of the immunostaining of ZWINT in human lung cancer tissues, followed by the digital scanning of whole slides and image analysis. This methodology can provide high-quality digital images and reliable results.

Insan akciğer dokularında ZW10 etkileşim protein Immünoster dijital Analizi

The purpose of this study is to introduce a methodology of the immunostaining of human lung tissues, followed by whole-slide digital scanning and image ...

Detection and Monitoring of Tumor Associated Circulating DNA in Patient Biofluids

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular sub-classification and temporal monitoring of tumor response to therapy. Here, we describe our dPCR-based method for the detection of tumor somatic mutations in cell free DNA (cfDNA), readily available in&#160;patient biofluids. Although limited in the number of mutations that can be tested for in each assay, this method provides a high level of sensitivity and specificity. Monitoring of mutation abundance, as calculated by MAF, allows for the evaluation of tumor response to therapy, thereby providing a much-needed supplement to radiographic imaging.

Here, we present a protocol to detect tumor somatic mutations in circulating DNA present in patient biological fluids (biofluids). Our droplet digital polymerase chain reaction (dPCR)-based method enables quantification of the tumor mutation allelic frequency (MAF), facilitating a minimally invasive complement to diagnosis and temporal monitoring of tumor response.

Hasta Biofluidinde tümör Ilişkili sirkülasyon DNA 'Sı tespiti ve Izlenmesi

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular ...

Semi-automatic PD-L1 Characterization and Enumeration of Circulating Tumor Cells from Non-small Cell Lung Cancer Patients by Immunofluorescence

Circulating tumor cells (CTCs) derived from the primary tumor are shed into the bloodstream or lymphatic system. These rare cells (1&#8722;10 cells per mL of blood) warrant a poor prognosis and are correlated with shorter overall survival in several cancers (e.g., breast, prostate and colorectal). Currently, the anti-EpCAM-coated magnetic bead-based CTC capturing system is the gold standard test approved by the U.S. Food and Drug Administration (FDA) for enumerating CTCs in the bloodstream. This test is based on the use of magnetic beads coated with anti-EpCAM markers, which specifically target epithelial cancer cells. Many studies have illustrated that EpCAM is not the optimal marker for CTC detection. Indeed, CTCs are a heterogeneous subpopulation of cancer cells and are able to undergo an epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) associated with metastatic proliferation and invasion. These CTCs are able to reduce the expression of cell surface epithelial marker EpCAM, while increasing mesenchymal markers such as vimentin. To address this technical hurdle, other isolation methods based on physical properties of CTCs have been developed. Microfluidic technologies enable a label-free approach to CTC enrichment from whole blood samples. The spiral microfluidic technology uses the inertial and Dean drag forces with continuous flow in curved channels generated within a spiral microfluidic chip. The cells are separated based on the differences in size and plasticity between normal blood cells and tumoral cells. This protocol details the different steps to characterize the programmed death-ligand 1 (PD-L1) expression of CTCs, combining a spiral microfluidic device with customizable immunofluorescence (IF) marker set.

The characterization of circulating tumor cells (CTCs) is a popular topic in translational research. This protocol describes a semi-automatic immunofluorescence (IF) assay for PD-L1 characterization and enumeration of CTCs in non-small cell lung cancer (NSCLC) patient samples.

İmmünfluoresans Ile Küçük Hücreli Olmayan Akciğer Kanseri Hastalarından Dolaşımdaki Tümör Hücrelerinin Yarı Otomatik PD-L1 Karakterizasyonu ve Numaralandırılması

Circulating tumor cells (CTCs) derived from the primary tumor are shed into the bloodstream or lymphatic system. These rare cells (1&#8722;10 cells per mL ...

Detection of Lung Tumor Progression in Mice by Ultrasound Imaging

With ~1.6 million victims per year, lung cancer contributes tremendously to the worldwide burden of cancer. Lung cancer is partly driven by genetic alterations in oncogenes such as the KRAS oncogene, which constitutes ~25% of lung cancer cases. The difficulty in therapeutically targeting KRAS-driven lung cancer partly stems from having poor models that can mimic the progression of the disease in the lab. We describe a method that permits the relative quantification of primary KRAS lung tumors in a Cre-inducible LSL-KRAS G12D mouse model via ultrasound imaging. This method relies on brightness (B)-mode acquisition of the lung parenchyma. Tumors that are initially formed in this model are visualized as B-lines and can be quantified by counting the number of B-lines present in the acquired images. These would represent the relative tumor number formed on the surface of the mouse lung. As the formed tumors develop with time, they are perceived as deep clefts within the lung parenchyma. Since the circumference of the formed tumor is well-defined, calculating the relative tumor volume is achieved by measuring the length and width of the tumor and applying them in the formula used for tumor caliper measurements. Ultrasound imaging is a non-invasive, fast and user-friendly technique that is often used for tumor quantifications in mice. Although artifacts may appear when obtaining ultrasound images, it has been shown that this imaging technique is more advantageous for tumor quantifications in mice compared to other imaging techniques such as computed tomography (CT) imaging and bioluminescence imaging (BLI). Researchers can investigate novel therapeutic targets using this technique by comparing lung tumor initiation and progression between different groups of mice.

This protocol describes the steps taken to induce KRAS lung tumors in mice as well as the quantification of formed tumors by ultrasound imaging. Small tumors are visualized in early timepoints as B-lines. At later timepoints, relative tumor volume measurements are achieved by the measurement tool in the ultrasound software.

Ultrason Görüntüleme ile Farelerde Akciğer Tümörü İlerlemesinin Saptanması

With ~1.6 million victims per year, lung cancer contributes tremendously to the worldwide burden of cancer. Lung cancer is partly driven by genetic ...