Bu araştırma hibe NIH/NIAID AI112423 ve Benjamin K. Chen için NIH/NIGMS GM113885 ve NIH/NIAID K08-AI120806 için Talia H. Swartz tarafından desteklenmiştir. Icahn School of Medicine, Mount Sinai Dekan'ın akış sitometresi çekirdek teşekkür etmek istiyorum.

1. nesil hedef hücre hatları
Not: Bu isteğe bağlı bir adımdır; Varolan bir RG hedef hücre satırı kullanıyorsanız, vasıl adım 2 başlatın.
<ol><li>293T hücreleri11 ['Dulbecco ' nın değiştirilmiş kartal Orta (DMEM) ile % 10 fetal Sığır serum (FBS) 10 mL] pMSCV-loxp-dsRed-loxp-eGFP-Puro-WPRE10 ve pCL-10A112 (ambalaj plazmid) ile bir % 70 konfluent 10 cm tabak içinde cotransfect bir 1:1 oran (20 µg toplam) kalsiyum tabanlı transfection13kullanarak.</li>
	<li>Plaka medyadan 15 mL konik tüp içine pipetting ve Tüp 3000 x g 23 ° C'de herhangi bir hücre artıkları cips için 5 min için de centrifuging tarafından viral süpernatant 48 saat sonrası transfection 10 mL hasat.</li>
	<li>0,45 µm filtre için bir 10 mL şırınga iliştirin. Santrifüjü sonra tüm süpernatant al ve şırınga yük. Örnek bir temiz 15 mL tüp içine çalıştırın.</li>
	<li>Aliquot filtre uygulanmış viral süpernatant uygun ölçüde içine (genellikle, 0.5-1 mL aliquots). Bu hemen sonraki adımda kullanılan veya-80 ° C'de donmuş ve depolanan.</li>
	<li>50-100 µL viral süpernatant ile bir hücre kültürünü seçtiği bir 96-şey plaka bulaştırmak için kullanın. %5 CO237 ° C'de hücreler kültür. RFP sinyal sürede (40 X büyütme, 532 nm uyarma, 588 nm Emisyon) Floresan mikroskop altında 24 h olarak görünür ancak en fazla 72 saat sürebilir. Not: Jurkat hücreleri bu deneylerde kullanılan ancak diğer türleri de kullanılabilir.</li>
	<li>Select transduced hücreleri puromisindir 10 wells bir dizi kurarak ve en az 1 de bırakarak ekleyerek puromisindir her, kontrol (kullanım aralığı 0,5 µg/mL den konsantrasyonları 5 µg/ml a; hücre tipi değişir bu Mayıs) olarak tedavi edilmezse. Monitör hücre canlılığı (hücre lizis puromisindir direnç geçmeden hücrelerde ortaya çıkar) birkaç gün boyunca tedavi edilmezse denetim ve kullanım nerede yalnızca RFP ifade hücreleri hayatta puromisindir bir konsantrasyon ile karşılaştırıldığında. Not: transfected hücreleri hayatta iken nerede untransfected hücresi öldürdün konsantrasyon seçin.</li>
	<li>Tek hücreli akış sitometresi sıralama veya sınırlayıcı bir seyreltme kullanarak (bkz: adımlar 1.8-1,10), Kültür (bu büyümeye birkaç hafta sürebilir) bir klonal hücre kültürünü geliştirmek için tek hücreler1 den türetilmiş büyümek.</li>
	<li>Seyreltme yöntemiyle, bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak ve örnek yaklaşık 500 hücre/ml seyreltik.</li>
	<li>96-şey plaka medya [% 10 FBS ve %2 penisilin-Jurkat hücreleri kullanıyorsanız streptomisin, Roswell Park Memorial Enstitüsü (RPMI) Orta] hücre seyreltme 50 µL içine 50 µL pipet ve 1:1 seri dilutions 50 µL medya içeren 11 kuyu içine gerçekleştirin. En iyi sonuçlar için en az 10 çoğaltır gerçekleştirin.</li>
	<li>Doku kültürü kuluçka (37 ° C % 5 CO2ile) veya yaklaşık 4 hafta plaka mikroskobu (40 X) ile hücre büyümesini izlemek. En düşük puromisindir konsantrasyon klonal kültürler için (olarak görülen yolu ile mikroskop, 40 X) büyüme ile kültürler arasından seçim yapın.</li>
	<li>Vasıl 800 x g 23 ° C'de 5 min için 20 mL (500.000 hücreler/bir hemasitometre ile sayılır mL,) kültürünün centrifuging ve % 10 DMSO ile FBS 500 µL içinde resuspending tarafından aliquots dondur. -80 ° C hücre-donma kapsayıcı'ı kullanarak yerleştirin ve sonra sıvı azot içinde saklayın.</li>
</ol>2. hücre-için-hücre virüs iletim
<ol><li>
Hedef hücrelerin hazırlanması
	<ol>
<li>Tezcan bir 500 µL flakon Jurkat RG muhabiri hücre 37 ° C su banyosu yerleştirerek. RPMI tam orta 10 mL flakon hücrelerden pipette ve 800 x g 23 ° C'de 5 min için karisimin santrifüj kapasitesi Pelet RPMI tam orta T-75 şişesi 20 ml resuspend. Şişeye gecede (37 ° C ve % 5 CO2) kuluçkaya. Not: RPMI tam orta RPMI 1640, %10 FBS, 2 mM L-glutamin, 100 adet/mL penisilin ve 100 mg/mL streptomisin içerir.</li>
		<li>Ertesi gün, 0,5 µg/mL puromisindir (2 mg/mL stok medya 8 mL başına 1 µL) ekleyin. 200,000 – 800.000 hücre/mL ( via hemasitometre sayılır) yoğunluğu korumak hücreleri, kültür.</li>
		<li>Transfer tahlil ayarlamadan önce gün 200.000-400.000 hücre/mL aşağı hücreleri içeren 0,5 µg/mL puromisindir taze RPMI ortamda bölün.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Donör hücreleri hazırlanması
	<ol>
<li>Untransduced Jurkat hücreleri ve onları bir T-75 şişesi ile 20 mL RPMI (2.1 adımda anlatıldığı gibi) orta, 200.000 – 800.000 hücre/mL yoğunluğu tutmak tamamlamak kültür çözülme.</li>
		<li>7,500,000 hücreleri (800 x g 5 min için) santrifüj kapasitesi ve onları 120 µL V nucleofection çözümün ek olarak resuspend (bkz. Tablo malzeme). Hücreleri bir Elektroporasyon küvet aktarmak ve Gag-iCre1 DNA 4,5 µg ekleyin. Hücreleri transfect (Elektroporasyon tabanlı bir yaklaşım Malzemeler tablogörmek) uygun bir programı (Örneğin, S-18) kullanarak ve sonra hemen RPMI orta 3 mL aktarmak (% 10 ile FBS).</li>
		<li>Hücreleri onları gecede kuluçka tarafından 37 ° c % 5 CO2kurtarmak izin verir.</li>
		<li>Ertesi sabah, hücreleri vasıl 800 x g 23 ° C'de 5 dakika santrifüj kapasitesi ve onları onları tahlil kurulum işlemine devam etmeden önce 37 ° C'de (%5 CO2) kurtarmak 2 h izin RPMI tam orta 3 ml resuspend.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Ortak kültür
	<ol>
<li>Bir hemasitometre sonra spin aşağı 50.000 hücreleri (800 x g 23 ° C'de 5 min için) kullanarak hücreleri (donör ve hedef hücreleri) denetlesinler iyi saymak. 1 x 106 hücre/mL RPMI puromisindir tam olarak resuspending.</li>
		<li>Bir tabak içinde 25 µL donör hücre süspansiyon, her şey için ekleyin; başka bir tabak içinde hedef hücre 25 µL ekleyin.</li>
		<li>Her şey için uygun toplama, RPMI tam ortamda bileşik testinin 25 µL seyreltilmiş ekleyin. Bileşik 30 dk için donör ve hedef hücrelerle kuluçkaya. Not: İlaç konsantrasyonu değişir. Bilinen bir IC50varsa, bu yukarıda ve aşağıda titrating bir başlangıç noktası olarak kullanın. IC50 bilinmiyorsa, bir 200 µM hisse senedi 10 µM son bir konsantrasyon için hazır olun.</li>
		<li>Önarıtma sonra diğer içine bir tabak içeriğini pipetting tarafından hedef hücreleri ile donör hücreleri birleştirmek ve bir doku kültürü kuluçka %5 CO237 ° C'de 40 h için hücreleri kuluçkaya.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Akış Sitometresi
	<ol>
<li>Her şey son konsantrasyonu % 2 paraformaldehyde (PFA) ekleyin. Not: % 16 hisse senedi için bir, bu 100 µL başına 14 µL iyi çözümdür.</li>
		<li>Dikkat: PFA maruz kalan deri ve göz için zararlıdır. Önlük, eldiven ve koruyucu gözlük ve bir emanet hood hisse senedi çözümde kolu.</li>
		<li>Akış sitometresi ile mCherry ve FITC kanallarını hücrelerdeyse okuyun. Not: Yukarıda arka planda enfekte hücreleri vsGFP ifade hücre % 5 – 20 görmek mümkündür. kandan hücreler.</li>
		<li>GFP sinyal GFP özel kanallarda floresans mikroskobu (40 X) ile görselleştirmek (bir uyarma filtresi 400 nm ve 508 bir emisyon filtre nm).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. alternatif iletişim kuralı için bir boş hücre virüs enfeksiyonu
<ol><li>
Hedef hücrelerin hazırlanması
	<ol>
<li>Tezcan bir 500 µL flakon Jurkat RG muhabiri hücre 37 ° C su banyosu yerleştirerek. RPMI tam orta 10 mL flakon hücrelerden pipette ve RPMI tam orta vasıl 800 x g 23 ° C'de 5 dakika santrifüj kapasitesi Pelet RPMI tam orta T-75 şişesi 20 ml resuspend. Şişeye gecede (37 ° C ve % 5 CO2) kuluçkaya.</li>
		<li>Ertesi gün, 0,5 µg/mL puromisindir (2 mg/mL stok medya 8 mL başına 1 µL) ekleyin. 200,000 – 800.000 hücre/mL ( via hemasitometre sayılır) yoğunluğu korumak hücreleri, kültür.</li>
		<li>Transfer tahlil ayarlamadan önce gün 200.000-400.000 hücre/mL aşağı hücreleri içeren 0,5 µg/mL puromisindir taze RPMI ortamda bölün.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Bir boş hücre virüs imalatı
	<ol>
<li>293T hücreler11 bir % 70 konfluent 10 cm tabak transfect (DMEM 10 ml % 10 ile FBS) ile kalsiyum tabanlı transfection13kullanarak Gag-iCre1 plazmid 5 µg. Not: Bu ölçek 10 mL yaklaşık 2-4 96-şey kaplamalar, transfection verimliliğini bağlı olarak yeterli virüs üretecek.</li>
		<li>Tüm viral süpernatant 48 h plaka medyadan 15 mL konik tüp içine pipetting ve Tüp 3000 x g tüm hücre artıkları cips 5 min için de centrifuging hasat.</li>
		<li>0,45 µm filtre için bir 10 mL şırınga iliştirin. Santrifüjü sonra tüm süpernatant al ve şırınga yük. Örnek bir temiz 15 mL tüp içine çalıştırın.</li>
		<li>Virüsü hedef hücreleri hemen (adım 3.3) enfekte veya donma ve virüs-80 ° c (tezcan kullanmadan önce gerektiği gibi örnek) depolamak için kullanın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Enfeksiyon
	<ol>
<li>RG Jurkat hedef hücreleri (Kimden adım 3.1.3) saymak 800 x g kuyuda başına 50.000 hedef hücre aşağı bir hemasitometre ve spin için 5 dk kullanarak, orta puromisindir olmadan tamamlamak 1 x 106 hücre/mL RPMI, hücre resuspending.</li>
		<li>Bir tabak içinde her şey için 25 µL RG Jurkat hedef hücre ekle; ayrı bir tabak içinde 25 µL ekleyin (2 ng) virüs her şey için.</li>
		<li>Her şey için uygun toplama, medyada seyreltilmiş bileşik, testin 25 µL ekleyin. Hücreleri ve bileşik 30 dk için virüs kuluçkaya. Not: Test konsantrasyon uyuşturucu değişir. Bilinen bir IC50varsa, bu yukarıda ve aşağıda titrating bir başlangıç noktası olarak kullanın. Bilinmiyorsa, 200 µM hisse senedi orta 10 µM son bir konsantrasyon için hazır olun.</li>
		<li>Önarıtma sonra virüs/bileşik mix tüm içeriği (50 µL) kuyulardan hedef hücrelere ekleme ve her şey için bir doku kültürü kuluçka %5 CO237 ° C'de 40 h kuluçkaya.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Akış Sitometresi
	<ol>
<li>İngiltere'de yılın son konsantrasyonu % 2 için her şey ekleyin. Not: % 16 hisse senedi için bir, bu 100 µL başına 14 µL iyi çözümdür.</li>
		<li>Akış sitometresi ile mCherry ve FITC kanallarını hücrelerdeyse okuyun. GFP sinyal görüntülenmeyecektir üzerinden floresans mikroskobu GFP kanallarda da olabilir. Not: Bir kez GFP enfekte hücreleri vsarka planda yukarıda ifade hücrelerinin % 5 – 20 görmeyi bekleyebilirsiniz. kandan hücreler.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Esposito, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+throughput+Cre-lox+activated+viral+membrane+fusion+assay+identifies+pharmacological+inhibitors+of+HIV+entry.">A high throughput Cre-lox activated viral membrane fusion assay identifies pharmacological inhibitors of HIV entry.</a> Virology. 490, 6-16 (2016).</li><li>Cavrois, M., De Noronha, C., Greene, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+and+specific+enzyme-based+assay+detecting+HIV-1+virion+fusion+in+primary+T+lymphocytes.">A sensitive and specific enzyme-based assay detecting HIV-1 virion fusion in primary T lymphocytes.</a> Nature Biotechnology. 20, 1151-1154 (2002).</li><li>Huerta, L., Lamoyi, E., Baez-Saldana, A., Larralde, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+immunodeficiency+virus+envelope-dependent+cell-cell+fusion:+a+quantitative+fluorescence+cytometric+assay.">Human immunodeficiency virus envelope-dependent cell-cell fusion: a quantitative fluorescence cytometric assay.</a> Cytometry. 47, 100-106 (2002).</li><li>Sakamoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+an+HIV+cell-cell+fusion+assay+by+using+two+genetically+modified+HeLa+cell+lines+and+reporter+gene.">Establishment of an HIV cell-cell fusion assay by using two genetically modified HeLa cell lines and reporter gene.</a> Journal of Virological Methods. 114, 159-166 (2003).</li><li>Herschhorn, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+inducible+cell-cell+fusion+system+with+integrated+ability+to+measure+the+efficiency+and+specificity+of+HIV-1+entry+inhibitors.">An inducible cell-cell fusion system with integrated ability to measure the efficiency and specificity of HIV-1 entry inhibitors.</a> PLoS One. 6, e26731 (2011).</li><li>Swartz, T. H., Esposito, A. M., Durham, N. D., Hartmann, B. M., Chen, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P2X-selective+purinergic+antagonists+are+strong+inhibitors+of+HIV-1+fusion+during+both+cell-to-cell+and+cell-free+infection.">P2X-selective purinergic antagonists are strong inhibitors of HIV-1 fusion during both cell-to-cell and cell-free infection.</a> Journal of Virology. 88, 11504-11515 (2014).</li><li>Marin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+HIV-Cell+Fusion+Assay+for+Discovery+of+Virus+Entry+Inhibitors.">High-Throughput HIV-Cell Fusion Assay for Discovery of Virus Entry Inhibitors.</a> Assay and Drug Development Technologies. 13, 155-166 (2015).</li><li>Giroud, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+and+Functional+Profiling+of+Small-Molecule+HIV-1+Entry+and+Fusion+Inhibitors.">Screening and Functional Profiling of Small-Molecule HIV-1 Entry and Fusion Inhibitors.</a> Assay and Drug Development Technologies. 15, 53-63 (2017).</li><li>Hubner, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+(HIV-1)+Gag+localization+and+oligomerization+monitored+with+live+confocal+imaging+of+a+replication-competent,+fluorescently+tagged+HIV-1.">Sequence of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) Gag localization and oligomerization monitored with live confocal imaging of a replication-competent, fluorescently tagged HIV-1.</a> Journal of Virology. 81, 12596-12607 (2007).</li><li>Koo, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+gene+expression+in+primary+Lgr5+organoid+cultures.">Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures.</a> Nature Methods. 9, 81-83 (2011).</li><li>Pear, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+high-titer+helper-free+retroviruses+by+transient+transfection.">Production of high-titer helper-free retroviruses by transient transfection.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 90, 8392-8396 (1993).</li><li>Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pCL+vector+system:+Rapid+production+of+helper-free,+high+titer,+recombinant+retroviruses.">The pCL vector system: Rapid production of helper-free, high titer, recombinant retroviruses.</a> Journal of Virology. 70, 5701-5705 (1996).</li><li>Kingston, R. E., Chen, C. A., Okayama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+Phosphate+Transfection.">Calcium Phosphate Transfection.</a> Current Protocols in Immunology. 10, 10-13 (2001).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Gag-iCre tahlil viral çoğaltma füzyon adımında inhibe ilaç adaylarının eleme için çok yararlı olduğu kanıtlanmıştır. Bu tahlil yaparken en viral enfeksiyon deneyleri için iyi sinyal almak için en önemli adımları benzerdir. İlk kritik adım iyi kalite virüs yüksek titreleri üretiyor. Bu adımı 293T hücreleri olmasını gerektirir onlar overconfluent olmak ve birlikte yığın bu yüzden sık sık (en az 1 x her 48 h) pasajlı. Ayrıca, bazı araştırmacılar diğer lipid tabanlı reaktifler lehine iken o kalsiyum fosfat transfection daha iyi sonuçlar verir bulmak gibi farklı transfection yöntemleri ile denemeye değer olabilir. Durağan faz bulaşması için yeteneklerini indirgeyerek benzer şekilde, diğer kritik bu protokolü hücreleri sarmak hedef izin ama onları hemen önce enfeksiyon, üstel büyüme aşamasında tutmak için adımıdır.
Köklü BlaM Vpr tahlil2ile karşılaştırıldığında, Gag-iCre tahlil bir substrat-Alerjik tahlil gerek etiket hedef hücrelere ile sunmaktadır. Bu belirli yüksek üretilen iş uygulamaları1için uygun yapar. Ayrıca, hücre latent enfeksiyon çalışmaya bazı potansiyel sunan gizli olduğunda bile tahlil viral giriş için kalıcı bir kalem sağlar. Gecikme süresi için gelecekteki çalışmaları bu sistem farelerde nerede yeşil Gag-iCre maruz için açık, henüz verimli değildir RG hücreleri enfekte, hücre popülasyonlarının gizli virüs veya verimsiz enfeksiyon ile çalışmaya izole olabilir yararlanmak olabilir. Gecikme ek olarak, diğer potansiyel uygulamalar tahlil vardır. Ebola ve potansiyel virüsleri çeşitli füzyon inhibitörleri ile canlı bir çalışma daha güvenli bir şekilde tanımlamak bu tahlil için açılması VSV (yayınlanmamış veri), gibi diğer viral zarf proteinleri ile sözde yazmak için başarılı bir şekilde kullanılmıştır virüs.
Bir potansiyel Gag-iCre tahlil bu bam-Vpr için karşılaştırıldığında sinyal geliştirmek için ek bir gün sürer kısıtlamasıdır. Buna ek olarak, mevcut durumda Gag-iCre virüs sadece uyuşturucu taraması tarif var ama uzun vadeli çalışmalar veya büyüme eğrileri uygun olmaz koşullar altında çalışır tek bir döngüsü için çoğaltır. Gelecekte, testin yeni sürümleri gibi luciferase, daha geniş bir kullanım için izin farklı muhabir sinyalleri ile yapılacaktır. Daha fazla, daha büyük bileşik kitaplıkları tarama olası verim roman inhibitörleri viral çoğaltma füzyon adım belirli olacak.

Roman antiretroviral tedavi ihtiyacını yüksek üretilen iş ekranları inhibitörleri HIV-1 giriş için geliştirilmesi açtı. Gag-iCre muhabir tahlil inhibitörleri viral girişinin füzyon adımda bir hücre hücre enfeksiyon sisteminde özellikle viral membran füzyon konak hücre zarının1ile ölçerek tanımlamak için geliştirilmiştir. Bir tahlil geliştirilmiştir için özellikle HIV-1 enfeksiyonu viral membran erime noktasına kadar erken aşamalarında hareket roman inhibitörleri ekran. Yeni enfeksiyon ölçme giriş hücrelerden ayırt etmek zor bu yüzden ilk inoculum enfekte donör hücreleri ve ininfected hedef hücreleri, içerir hücre-hücre enfeksiyon ölçüm için bir meydan okuma olduğunu. İdeal sistem bir hedef hücre enfeksiyonu başlatma tarafından indüklenen Contegra gen işaret yer alacağı ve donör hücrede mevcut değil. Popüler bir viral içeriği bir viral protein-enzim fusion, bam-Vpr, dayalı tahlil karıştırma etkili, olabilir ama yüksek işlem hacmi, hücre-hücre tarama2için sınırlamalar vardır. Bu tahlil için HIV-1 Vpr erimiş, virions paketlenmiş ve hedef hücrelere viral membran fusion üzerine teslim bir beta-lactamase (BAM) muhabir gen içerir. CCF2-AM substrat hedef hücre sitoplazma yüklenir ve bir floresan değişimi bölünme üzerine geçer. CCF2-AM substrat pahalı ve yüksek üretilen iş ekranlar için engelleyici olabilir. Boya-etiket için gerekli donör ve hedef hücreleri ayırmak için hedef nüfus. Son olarak, protokol bileşikler çok sayıda test ederken ağır ve pahalı olabilir birkaç yıkama ve kuluçka adımları gerektirir.
Gag-iCre tahlil yüksek-den geçerek inhibitörleri füzyon hücre hücre iletim için eleme geliştirmek için bu sorunlara bir çözüm olarak geliştirilmiştir. Bu sistem substrat hücrelere yüklenecek gerektirmez. Tahlil boş hücre çalışmaları için de kullanılabilir ve sözde yazılı HIV-1 Gag-iCre virüs partikülleri kullanarak diğer viral füzyon çalışmalar için uyarlanabilir. HIV-1 Gag-iCre tahlil3,4,5gibi bunlar gerçek virüs parçacıkları kullanmayın ancak HIV Env aracılı hücre-hücre füzyon deneyleri virüs Env protein aracılı hücre füzyon, ölçebilirsiniz. Bu tahlil akış sitometresi veya floresan mikroskobu ile okunabilir. FDA kütüphane yanı sıra küçük bir kütüphane purinergic inhibitörleri1,6ekran için başarılı bir şekilde kullanılmıştır. Diğer Müfettişler ayrıca virüs kapsüllenmiş beta-lactamase transfer sitoplazma7,8 içine raporlar bir adapte ve optimize edilmiş yüksek üretilen iş füzyon tahlil kullanarak HIV-1 Fusion purinergic inhibitörleri belirledik .
Gag-iCre virüs Cre recombinase matris ve kapsid, HIV-1 proteaz siteleri9tarafından çevrili arasında ekleme Gag-iGFP virüse benzer bir yaklaşım ile tasarlanmıştır. Cre enzim HIV-1 proteaz doğmakta olan virüs parçacık içinde aktif hale getirildiğinde olgunlaşır Gag polyprotein içinde eklenen bir habercisi olarak yapılır. Cre teslim, böylece, bir proteaz aktif HIV-1 parçacık içeriğini teslim bir hedef hücre ile bir viral membran füzyon süreci içine üzerine bağlıdır. Protokol iki sürümleri burada verilmektedir. İlk hedef hücreleri doğrudan hücre hücre iletim HIV çalışmaya, enfekte HIV-1 enfekte nüfus kullanır. Boş hücre viral bir enfeksiyon çalışma için bir boş hücre virüs ikinci sürümü kullanır. Hücreleri zaten çözdürülen pasajlı ve hücre-hücre iletim tahlil hücreleri çözdürülen günden tamamlamak için 7 gün veya 5 gün alır. Hücreleri çözdürülen pasajlı varsa ve boş hücre enfeksiyon tahlil 5 hücreleri çözdürülen gerekiyorsa, gün ve 3 gün içinde gerçekleştirilir. Ayrıca hücreye Clevers laboratuvar10tarafından oluşturulan bir plazmid kullanarak (önceden varolan RG hedef hücre kültürünü değil kullanılıyorsa) istenen bir RG (kırmızı-yeşil) hedef hücre satırı oluşturmak için verilen talimatları. Bu virüs ve virüs ifade hücreleri bu tahlil ile uygun Biyogüvenlik önlemleri alınır tavsiye edilir. Biz bu tahlil BSL2 + doku kültürü tesiste bulaşıcı bölümü kuralları. Hücreleri sabit sonra onlar standart akış sitometresi ve mikroskopi tesislerinde analiz edilebilir.
Roman, maddeler ve birleşimler için bu testin uygulama ekrana burada tarif biz HIV-1 viral membran füzyon (Şekil 1) inhibe. Pro-inflamatuar aracılar Purinergic reseptörleri vardır. Bizim Laboratuvar purinergic reseptörlerinin non-selektif inhibitörü HIV-1 viral membran füzyon6inhibitörleri hareket göstermiştir. Biz yüksek üretilen iş bu tahlil kullanımı yeni HIV-1 viral membran füzyon inhibitörleri tanımlayabilirsiniz raporu. Biz bir inhibitörü reseptörlerinin purinergic sınıfının HIV-1 viral membran füzyon inhibitörleri roman bir sınıfın temsil ettiğini göstermek.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle&#039;s Medium (DMEM)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5546</td><td>Media for 293 Cells</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R0883</td><td>Media for Jurkats</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum Albumin</td><td>Gibco</td><td>16140-071</td><td>Serum for 293 Cells</td></tr><tr><td>Cosmic Calf Serum</td><td>Hyclone</td><td>SH30087.03</td><td>Serum for Jurkat Cells</td></tr><tr><td>Hyclone Pennecillin Streptomycin solution</td><td>GE Healthcare Life sciences</td><td>SV30010</td><td>Penn/Strep used in both media</td></tr><tr><td>T75 Flasks</td><td>Corning</td><td>3073</td><td>Used for Culture of Jurkat Cells</td></tr><tr><td>10 cm Tissue Culture Plates</td><td>Corning</td><td>430167</td><td>Used for Culture of 293 Cells</td></tr><tr><td>96 Well Plates (tissue culture Treated)</td><td>Corning</td><td>3595</td><td>Used for fusion assay</td></tr><tr><td>Polyjet Transfection Reagent</td><td>Signagen</td><td>SL100688</td><td>Used to transfect 293 Cells</td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Phosphate Buffered Saline</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8537-100ML</td><td>Used in wash steps</td></tr><tr><td>Hyclone Trypsin Protease</td><td>GE Healthcare Life sciences</td><td>SH30042.01</td><td>For Trypsinization of 293 cells</td></tr><tr><td>Amaxa Cell Line Nucleofector Kit V</td><td>Lonza</td><td>VACA-1003</td><td>For Nucleofection of Jurkats</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque plus</td><td>GE Healthcare Life sciences</td><td>17144002</td><td>For Nucleofection of Jurkats</td></tr><tr><td>Serological Pipettes</td><td>Fisher Brand</td><td>13-678-11E</td><td>For all tissue culture</td></tr><tr><td>Pipettor Tips</td><td>Denville Scientific</td><td>P3020-CPS</td><td>For all tissue culture and liquid handling steps</td></tr><tr><td>Millex Syringe Filter (0.45 &amp;mu;m)</td><td>Millipore</td><td>SLHA033</td><td>For filtration of virus</td></tr><tr><td>BD Slip Tip Sterile syringes</td><td>BD Diagnostics</td><td>309656</td><td>For filtration of virus</td></tr><tr><td>Amaxa Nucleofector</td><td>Lonza</td><td>2b</td><td>for Nucleofection of Jurkats (various models available)</td></tr><tr><td>BD Fortessa Flow Cytometer</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>for flow cytometry analyss of samples</td></tr><tr><td>Tissue Culture Hood</td><td>Various models</td><td>Fortessa 2</td><td></td></tr><tr><td>pMSCV-loxp-dsRed-loxp-eGFP-Puro-W PRE</td><td>Addgene</td><td>32702</td><td>&lt;strong&gt;Koo BK&lt;em&gt; et al.&lt;/em&gt;&lt;/strong&gt; Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures. Nature Methods &lt;strong&gt;9:&lt;/strong&gt;81-83 (2011).</td></tr><tr><td>pCL10a1</td><td>Novus Bio</td><td>NBP2-29542</td><td>&lt;strong&gt;Naviaux, RK, Costanzi, E, Haas, M and Verma, I&lt;/strong&gt;. The pCL vector system: Rapid production of helper-free, high titer, recombinant retroviruses. Journal of Virology &lt;strong&gt;70&lt;/strong&gt;: 5701-5705 (1996)</td></tr><tr><td>Gag-iCre</td><td>Benjamin Chen Lab</td><td></td><td>&lt;strong&gt;Esposito AM&lt;em&gt; et al.&lt;/em&gt; &lt;/strong&gt;A high throughput Cre-lox activated viral membrane fusion assay identifies pharmacological inhibitors of HIV entry. Virology &lt;strong&gt;490:&lt;/strong&gt;6-16 (2016).</td></tr></tbody></table>

a high-throughput cre-lox activated viral membrane fusion assay to identify inhibitors of hiv-1 viral membrane fusion

Bu tahlil akış sitometresi veya floresan mikroskopi tarafından özellikle HIV-1 füzyon yoluyla üzerinde yeşil flüoresan protein (GFP) tespit ifade bildirmek için tasarlanmıştır. HIV-1 muhabir virüsü (HIV-1 Gag-iCre) matrix ve Gag polyprotein kapsid protein arasındaki HIV-1 genom içine Cre recombinase ekleyerek oluşturulur. O zaman bir hedef hücreye piyasaya Cre recombinase virüs parçacıkları, içine bir ambalaj içinde bu sonuçlar stabil bir Cre recombinase aktif kırmızı floresan protein (RFP) GFP anahtarı kaset ifade satır. Bazal durumda, sadece RFP bu kaset ifade eder. Hedef hücre içine Cre recombinase teslimini loxP siteleri tarafından çevrili RFP, excises, GFP ifadede kaynaklanan. Bu tahlil herhangi bir inhibitörleri (füzyon aşamada özellikle) viral girdisinin boş hücre ve hücre-hücre enfeksiyonu sistemlerinde test etmek için kullanılan ve bir sınıf purinergic reseptör antagonistleri, HIV-1 viral membran füzyon roman inhibitörleri tanımlamak için kullanılan.

Bulaşmamış RG Jurkat hücrelerin arka plan GFP sinyal (% 0.3) düşük düzeyde çok güçlü bir RFP sinyal ile (Şekil 2A, hastalık bulaşmamış tek sütun) sergi. Gag-iCre ile enfeksiyon HIV-1 füzyon inhibitörü AMD3100 varlığı GFP sinyal (%24,9,) bir artış nedenleri (20 µM) bulaşmamış arka plan seviyelerine (%0.34) getiren bu sinyal gelişimini engeller. Ne zaman bir inhibitörü gibi ters transkripsiyon inhibitörü AZT sonrası füzyon bir olay (2 µM) kullanılır, başka bir sinyal değil (% 23,5), GFP sinyal tahlil tarafından üretilen gösteren önemli ölçüde HIV-1 füzyon için belirli. Şekil 2B Gag-iCre füzyon PPADS ile doz bağımlı inhibisyonu gösterir (100 µM), non-selektif purinergic inhibitörü.
Şekil 3 boş hücre karşılaştırmasını gösterir HIV-1 viral membran füzyon Gag-iCre tahlil (Şekil 3A) ve Kongre BlaM Vpr tahlil (3B rakam) kullanarak. Titrasyon Gag-iCre ve bam-Vpr virüs spinoculate için kullanıldı — 2 h uzun 1200 x g spin verimliliği arttırmak için enfeksiyon başında 96-şey enfeksiyon plaka — RG Jurkat hücreleri ile bam-Vpr virüs Gag-iCre ve Jurkat hücreleri ile daha önce açıklanan2. 3 ng virüs, her iki deneyleri sunulan %64.7 (Gag-iCre) ve %47.2 (BAM-Vpr) hücrelerin güçlü bir sinyal erimiş. 0.3, ng virüsü, sinyalleri %1.18 (Gag-iCre) ve %2 (BAM-Vpr) idi. Bu veriler Gag-iCre virüs konsantrasyonları bir mesafeden köklü BlaM Vpr tahlil için viral fusion için karşılaştırılabilir bir sinyal sunabilir düşündürmektedir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58074/58074fig1.jpg"> Şekil 1: Gag-iCre tahlil genel bakış. RG Jurkat hücreleri HIV Gag-iCre ile transfected donör Jurkat hücrelerle birlikte inkübe. Viral membran fusion, yeşil Floresanda hücrelerinde kaynaklanan dsRed gen EGFP ifade izin vermek için loxP site ayırmak, hedef hücrelere Cre yayımlanır. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58074/58074fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58074/58074fig2.jpg"> Şekil 2: temsilcisi sonuçları bir-boş hücre ve hücre-hücre Gag-iCre bulaşması. (A)-boş hücre Gag-iCre füzyon inhibe füzyon inhibitörü AMD3100, ancak ters transkripsiyon inhibitörü AZT tarafından değil. Bu paneller bulaşmamış RG Jurkat hücreleri, tedavi edilmemiş RG Jurkat hücreleri enfeksiyon sonra 48 h ve RG Jurkat hücreleri 48 saat sonra enfeksiyon göstermek ama AMD3100 veya AZT, belirtildiği gibi tedavi. Alt panelleri GFP olumlu olarak gösterilen örnek için (FACS) verilerde sıralama floresans aktif hücre temsil ederken orta panelleri RFP kanalında floresan filmler temsil eder, üst panelleri GFP kanalında floresan filmler temsil bir yüzde füzyonu göstergesi. Ölçek çubuğu 100 µm =. Esposito ve ark. izniyle bu panel değiştirildi 1. hücre hücre enfeksiyonu takip (B) HIV-1 viral membran füzyon PPADS tarafından inhibe. RG Jurkat hücreleri HIV-1 Gag-iCre ile transfected Jurkat hücreleri ile karıştırıldı ve AMD3100 ve PPADS inhibitörleri blok viral membran fusion 100 µM için yeteneklerini için temsilcisi floresans aktif hücre sıralayıcısı araziler içinde gösterildiği gibi test edildi. Bu rakam Swartz vd değiştirildi 6. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58074/58074fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58074/58074fig3.jpg"> Şekil 3: HIV Gag-iCre muhabir sinyal bam-Vpr için karşılaştırılabilir. Bu paneller(a)RG hücreleri spinoculated Gag-iCre virüs ve (B) Jurkat hücre spinoculated ile NL43 bam-Vpr, 16 h 6 h enfeksiyon virüs belirtilen konsantrasyon, sonra bir FACS analiz sonuçlarını göstermek. Esposito ve ark. izniyle bu panel değiştirildi 1. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58074/58074fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A High-throughput Cre-Lox Activated Viral Membrane Fusion Assay to Identify Inhibitors of HIV-1 Viral Membrane Fusion at JoVE.com

A High-throughput Cre-Lox Activated Viral Membrane Fusion Assay to Identify Inhibitors of HIV-1 Viral Membrane Fusion

HIV-1 füzyon yoluyla üzerinde akış sitometresi veya floresan mikroskopi tarafından algılanabilir yeşil flüoresan proteinin ifade bildirmek için bir hücre tabanlı tahlil açıklar. İnhibitörleri (füzyon aşamada özellikle) viral girdisinin boş hücre ve hücre-hücre enfeksiyonu sistemlerinde test etmek için kullanılabilir.

Bir yüksek-den geçerek Cre-Lox Viral membran Fusion tahlil inhibitörleri HIV-1 Viral membran füzyon tanımlamak için aktive

This assay is designed to specifically report on HIV-1 fusion via the expression of green fluorescent protein (GFP) detectable by flow cytometry or ...

a-high-throughput-cre-lox-activated-viral-membrane-fusion-assay-to

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

6.3K Görüntüleme.  Icahn School of Medicine at Mount Sinai, Immunology Institute. HIV-1 füzyon yoluyla üzerinde akış sitometresi veya floresan mikroskopi tarafından algılanabilir yeşil flüoresan proteinin ifade bildirmek için bir hücre tabanlı tahlil açıklar. İnhibitörleri (füzyon aşamada özellikle) viral girdisinin boş hücre ve hücre-hücre enfeksiyonu sistemlerinde test etmek için kullanılabilir.

Video: A High-throughput Cre-Lox Activated Viral Membrane Fusion Assay to Identify Inhibitors of HIV-1 Viral Membrane Fusion

Two Methods of Heterokaryon Formation to Discover HCV Restriction Factors

Hepatitis C virus (HCV) is a hepatotropic virus with a host-range restricted to humans and chimpanzees. Although HCV RNA replication has been observed in human non-hepatic and murine cell lines, the efficiency was very low and required long-term selection procedures using HCV replicon constructs expressing dominant antibiotic-selectable markers1-5. HCV in vitro research is therefore limited to human hepatoma cell lines permissive for virus entry and completion of the viral life cycle. Due to HCVs narrow species tropism, there is no immunocompetent small animal model available that sustains the complete HCV replication cycle 6-8. Inefficient replication of HCV in non-human cells e.g. of mouse origin is likely due to lack of genetic incompatibility of essential host dependency factors and/or expression of restriction factors.
We investigated whether HCV propagation is suppressed by dominant restriction factors in either human cell lines derived from non-hepatic tissues or in mouse liver cell lines. To this end, we developed two independent conditional trans-complementation methods relying on somatic cell fusion. In both cases, completion of the viral replication cycle is only possible in the heterokaryons. Consequently, successful trans-complementation, which is determined by measuring de novo production of infectious viral progeny, indicates absence of dominant restrictions.
Specifically, subgenomic HCV replicons carrying a luciferase transgene were transfected into highly permissive human hepatoma cells (Huh-7.5 cells). Subsequently, these cells were co-cultured and fused to various human and murine cells expressing HCV structural proteins core, envelope 1 and 2 (E1, E2) and accessory proteins p7 and NS2. Provided that cell fusion was initiated by treatment with polyethylene-glycol (PEG), the culture released infectious viral particles which infected na&iuml;ve cells in a receptor-dependent fashion.
To assess the influence of dominant restrictions on the complete viral life cycle including cell entry, RNA translation, replication and virus assembly, we took advantage of a human liver cell line (Huh-7 Lunet N cells 9) which lacks endogenous expression of CD81, an essential entry factor of HCV. In the absence of ectopically expressed CD81, these cells are essentially refractory to HCV infection 10 . Importantly, when co-cultured and fused with cells that express human CD81 but lack at least another crucial cell entry factor (i.e. SR-BI, CLDN1, OCLN), only the resulting heterokaryons display the complete set of HCV entry factors requisite for infection. Therefore, to analyze if dominant restriction factors suppress completion of the HCV replication cycle, we fused Lunet N cells with various cells from human and mouse origin which fulfill the above mentioned criteria. When co-cultured cells were transfected with a highly fusogenic viral envelope protein mutant of the prototype foamy virus (PFV11) and subsequently challenged with infectious HCV particles (HCVcc), de novo production of infectious virus was observed. This indicates that HCV successfully completed its replication cycle in heterokaryons thus ruling out expression of dominant restriction factors in these cell lines. These novel conditional trans-complementation methods will be useful to screen a large panel of cell lines and primary cells for expression of HCV-specific dominant restriction factors.

We describe two methods for conditional trans-complementation of hepatitis C virus (HCV) assembly and the completion of the full viral life cycle, which rely on heterokaryon formation. These techniques are suitable to screen for cell lines that express dominant restriction factors, which preclude production of infectious HCV progeny.

Heterokaryon Oluşumu İki Yöntemleri HCV Sınırlayıcı Etkenler Discover

Hepatitis C virus (HCV) is a hepatotropic virus with a host-range restricted to humans and chimpanzees. Although HCV RNA replication has been observed in ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation

Proteases are intensively studied enzymes due to their essential roles in several biological pathways of living organisms and in pathogenesis; therefore, they are important drug targets. We have developed a magnetic-agarose-bead-based assay platform for the investigation of proteolytic activity, which is based on the use of recombinant fusion protein substrates. In order to demonstrate the use of this assay system, a protocol is presented on the example of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) protease. The introduced assay platform can be utilized efficiently in the biochemical characterization of proteases, including enzyme activity measurements in mutagenesis, kinetic, inhibition, or specificity studies, and it may be suitable for high-throughput substrate screening or may be adapted to other proteolytic enzymes.
In this assay system, the applied substrates contain N-terminal hexahistidine (His6) and maltose-binding protein (MBP) tags, cleavage sites for tobacco etch virus (TEV) and HIV-1 proteases, and a C-terminal fluorescent protein. The substrates can be efficiently produced in Escherichia coli cells and easily purified using nickel (Ni)-chelate-coated beads. During the assay, the proteolytic cleavage of bead-attached substrates leads to the release of fluorescent cleavage fragments, which can be measured by fluorimetry. Additionally, cleavage reactions can be analyzed by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). A protocol for the in-gel renaturation of assay components is also described, as partial renaturation of fluorescent proteins enables their detection based on molecular weight and fluorescence.

Here, we present the detailed procedure of a recently developed protease assay platform utilizing N-terminal hexahistidine/maltose-binding protein and fluorescent protein-fused recombinant substrates attached to the surface of nickel-nitrilotriacetic acid magnetic agarose beads. A subsequent in-gel analysis of the assay samples separated by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis is also presented.

Rekombinant füzyon protein flüoresan proteaz tahlil Platform ve onların jel Renaturation kullanımı

Proteases are intensively studied enzymes due to their essential roles in several biological pathways of living organisms and in pathogenesis; therefore, ...

Biyokimya

Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify new compounds that can inhibit infection by the common drug resistant HIV-1 strains with minimal toxicity. Here we describe an efficient assay that can be used to rapidly determine the cellular cytotoxicity and efficacy of a compound against WT and mutant viral strains.
The desired target cell line is seeded in a 96-well plate and, after a 24 hr incubation, serially dilutions of the compounds to be tested are added. No further manipulations are necessary for cellular cytotoxicity assays; for anti HIV assays a predetermined amount of either a WT or drug resistant HIV-1 vector that expresses luciferase is added to the cells. Cytotoxicity is measured by using an ATP dependent luminescence assay and the impact of the compounds on infectivity is measured by determining the amount of luciferase in the presence or the absence of the putative inhibitors.
This screening assay takes 4 days to complete and multiple compounds can be screened in parallel. Compounds are screened in triplicate and the data are normalized to the infectivity/ATP levels in absence of target compounds. This technique provides a quick and accurate measurement of the efficacy and toxicity of potential anti HIV compounds.

Here we describe cellular cytotoxicity and single round infectivity assays that allow for the rapid and accurate screening of compounds to determine their cellular cytotoxicity (CC50) and IC50 values against WT and drug resistant HIV-1.

HIV ters transkriptaz ve integraz inhibitörleri hızlı taranması

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

A Restriction Enzyme Based Cloning Method to Assess the In vitro Replication Capacity of HIV-1 Subtype C Gag-MJ4 Chimeric Viruses

The protective effect of many HLA class I alleles on HIV-1 pathogenesis and disease progression is, in part, attributed to their ability to target conserved portions of the HIV-1 genome that escape with difficulty. Sequence changes attributed to cellular immune pressure arise across the genome during infection, and if found within conserved regions of the genome such as Gag, can affect the ability of the virus to replicate in vitro. Transmission of HLA-linked polymorphisms in Gag to HLA-mismatched recipients has been associated with reduced set point viral loads. We hypothesized this may be due to a reduced replication capacity of the virus. Here we present a novel method for assessing the in vitro replication of HIV-1 as influenced by the gag gene isolated from acute time points from subtype C infected Zambians. This method uses restriction enzyme based cloning to insert the gag gene into a common subtype C HIV-1 proviral backbone, MJ4. This makes it more appropriate to the study of subtype C sequences than previous recombination based methods that have assessed the in vitro replication of chronically derived gag-pro sequences. Nevertheless, the protocol could be readily modified for studies of viruses from other subtypes. Moreover, this protocol details a robust and reproducible method for assessing the replication capacity of the Gag-MJ4 chimeric viruses on a CEM-based T cell line. This method was utilized for the study of Gag-MJ4 chimeric viruses derived from 149 subtype C acutely infected Zambians, and has allowed for the identification of residues in Gag that affect replication. More importantly, the implementation of this technique has facilitated a deeper understanding of how viral replication defines parameters of early HIV-1 pathogenesis such as set point viral load and longitudinal CD4+ T cell decline.

A Restriction Enzyme Based Cloning Method to Assess the In vitro Replication Capacity of HIV-1 Subtype C Gag-MJ4 Chimeric Viruses

HIV-1 pathogenesis is defined by both viral characteristics and host genetic factors. Here we describe a robust method that allows for reproducible measurements to assess the impact of the gag gene sequence variation on the in vitro replication capacity of the virus.

Bir Kısıtlama Enzim Temelli Klonlama Yöntemi değerlendirin<em&gt; In vitro</em&gt; HIV-1 Tipi C Gag-MJ4 Kimerik Virüslerin Çoğaltma Kapasitesi

The protective effect of many HLA class I alleles on HIV-1 pathogenesis and disease progression is, in part, attributed to their ability to target ...

Method for Measurement of Viral Fusion Kinetics at the Single Particle Level

Membrane fusion is an essential step during entry of enveloped viruses into cells. Conventional fusion assays typically report on a large number of fusion events, making it difficult to quantitatively analyze the sequence of the molecular steps involved. We have developed an in vitro, two-color fluorescence assay to monitor kinetics of single virus particles fusing with a target bilayer on an essentially fluid support.
Influenza viral particles are incubated with a green lipophilic fluorophore to stain the membrane and a red hydrophilic fluorophore to stain the viral interior. We deposit a ganglioside-containing lipid bilayer on the dextran-functionilized glass surface of a flow cell, incubate the viral particles on the planar bilayer and image the fluorescence of a 100 x 100 &mu;m2 area, containing several hundreds of particles, on a CCD camera. By imaging both the red and green fluorescence, we can simultaneously monitor the behavior of the membrane dye (green) and the aqueous content (red) of the particles.
Upon lowering the pH to a value below the fusion pH, the particles will fuse with the membrane. Hemifusion, the merging of the outer leaflet of the viral membrane with the outer leaflet of the target membrane, will be visible as a sudden change in the green fluorescence of a particle. Upon the subsequent fusion of the two remaining distal leaflets a pore will be formed and the red-emitting fluorophore in the viral particle will be released under the target membrane. This event will give rise to a decrease of the red fluorescence of individual particles. Finally, the integrated fluorescence from a pH-sensitive fluorophore that is embedded in the target membrane reports on the exact time of the pH drop.
From the three fluorescence-time traces, all the important events (pH drop, lipid mixing upon hemifusion, content mixing upon pore formation) can now be extracted in a straightforward manner and for every particle individually. By collecting the elapsed times for the various transitions for many individual particles in histograms, we can determine the lifetimes of the corresponding intermediates. Even hidden intermediates that do not have a direct fluorescent observable can be visualized directly from these histograms.

We present an in vitro, two-color fluorescence assay to visualize the fusion of single virus particles with a fluid target bilayer. By labeling viral particles with fluorophores that differentially stain the viral membrane and its interior, we are able to monitor the kinetics of hemifusion and pore formation.

Tek Parçacık Düzeyinde Viral Fusion Kinetik Ölçüm yöntemi

Membrane fusion is an essential step during entry of enveloped viruses into cells. Conventional fusion assays typically report on a large number of fusion ...

Biyoloji

Conformational Evaluation of HIV-1 Trimeric Envelope Glycoproteins Using a Cell-based ELISA Assay

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins are able to fuel the fusion process through their conformational changes could lead to the design of better, more effective immunogens for vaccine strategies. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows studying the recognition of trimeric HIV-1 Env by monoclonal antibodies. Following expression of HIV-1 trimeric Env at the surface of transfected cells, conformation specific anti-Env antibodies are incubated with the cells. A horseradish peroxidase-conjugated secondary antibody and a simple chemiluminescence reaction are then used to detect bound antibodies. This system is highly flexible and can detect Env conformational changes induced by soluble CD4 or cellular proteins. It requires minimal amount of material and no highly-specialized equipment or know-how. Thus, this technique can be established for medium to high throughput screening of antigens and antibodies, such as newly-isolated antibodies.

Understanding viral surface antigens conformations is required to evaluate antibody neutralization and guide the design of effective vaccine immunogens. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows the study of the recognition of trimeric HIV-1 Env expressed at the surface of transfected cells by specific anti-Env antibodies.

Bir Hücre temelli bir ELISA testi kullanarak, HIV-1 zarf trimerik Glikoproteinler konformasyonel Değerlendirilmesi

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins ...

Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic approach to identify and evaluate antiviral agents that target specific steps of the viral entry. In this report, the methods of examining viral inactivation, viral attachment, and viral entry/fusion as antiviral assays for such purposes are described, using hepatitis C virus as a model. These assays should be useful for discovering novel antagonists/inhibitors to early viral entry and help expand the scope of candidate antiviral agents for further drug development.

Here, we present a protocol that examines specific steps of the viral entry to identify and evaluate novel antiviral agents.

Erken Viral Giriş Tespiti için Tahliller ve Antiviral Bileşiklerin Değerlendirilmesi

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic ...

High Throughput In Vitro Assessment of Latency Reversing Agents on HIV Transcription and Splicing

HIV remains incurable due to the existence of a reservoir of cells that harbors stable and latent form of the virus, which stays invisible to the immune system and is not targeted by the current antiretroviral therapy (cART). Transcription and splicing have been shown to reinforce HIV-1 latency in resting CD4+ T cells. Reversal of latency by the use of latency reversal agents (LRAs) in the &#34;shock and kill&#34; approach has been studied extensively in an attempt to purge this reservoir but has thus far not shown any success in clinical trials due to the lack of development of adequate small molecules that can efficiently perturb this reservoir. The protocol presented here provides a method for reliably and efficiently assessing latency reversal agents (LRAs) on HIV transcription and splicing. This approach is based on the use of an LTR-driven dual color reporter that can simultaneously measure the effect of an LRA on transcription and splicing by flow cytometry. The protocol described here is adequate for adherent cells as well as the cells in suspension. It is useful for testing a large number of drugs in a high throughput system. The method is technically simple to implement and cost-effective. In addition, the use of flow cytometry allows the assessment of cell viability and thus drug toxicity at the same time.

A high throughput protocol for functional assessment of HIV efficient reactivation and clearance of latent proviruses is described and applied by testing the impact of interventions on HIV transcription and splicing. Representative results of the effect of latency reversing agents on LTR-driven transcription and splicing are provided.

Vitro değerlendirme HIV transkripsiyon ve yapıştırma ajanları geri gecikme süresi yüksek işlem hacmi

HIV remains incurable due to the existence of a reservoir of cells that harbors stable and latent form of the virus, which stays invisible to the immune ...

Single-Cell Characterization of Calcium Influx and HIV-1 Infection using a Multiparameter Optofluidic Platform

HIV-1 causes a chronic infection that affects more than 37 million people worldwide. People living with human immunodeficiency virus (HIV) experience comorbidity related to chronic inflammation despite antiretroviral therapy. However, these inflammatory signaling has not been fully characterized. The role of early entry events on the activation of cellular signaling events and downstream gene expression has not been captured at the single-cell level. Here the authors describe a method that applies principles of live-cell fluorescence microscopy to an automated single-cell platform that cultures and images cells over user-customized time courses, allowing for high-throughput analysis of dynamic cellular processes. This assay can track single-cell live fluorescence microscopy of early events that immediately follow HIV-1 infection, notably the influx of calcium that accompanies exposure to the virus and the development of productive infection using a fluorescent reporter virus. MT-4 cells are loaded with a calcium-sensitive dye and cultured in isolated pens on a nanofluidic device. The cultured cells are infected with an HIV-1 reporter virus (HIV-1 NLCI). A fluorescence microscope positioned above the nanofluidic device measures calcium influx over an 8-min time course following acute HIV-1 exposure. HIV-1 productive infection is measured in those same cells over a 4-day interval. Imaging data from these time courses are analyzed to define virus-host receptor interactions and signaling pathway dynamics. The authors present an integrated, scalable alternative to traditional imaging methods using a novel optofluidic platform capable of single-cell sorting, culturing, imaging, and software automation. This assay can measure the kinetics of events under various conditions, including cell type, agonist, or antagonist effect, while measuring an array of parameters. This is the first established method for nanofluidic high-throughput longitudinal single-cell culture and imaging: This technique can be broadly adapted to study cellular signaling kinetics and dynamic molecular interactions.

Here, we present a protocol in which single cells are monitored for acute events and productive HIV-1 infection on a nanofluidic device. Imaging data define virus-host receptor interactions and signaling pathway dynamics. This is the first method for nanofluidic high-throughput longitudinal single-cell culture and imaging to study signaling kinetics and molecular interactions.

Multiparametre Optofluidik Platform Kullanılarak Kalsiyum Akını ve HIV-1 Enfeksiyonunun Tek Hücreli Karakterizasyonu

HIV-1 causes a chronic infection that affects more than 37 million people worldwide. People living with human immunodeficiency virus (HIV) experience ...

Open Source High Content Analysis Utilizing Automated Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) based readouts of fixed or live cells in multiwell plates. This provides a means to screen for cell signaling processes read out using intramolecular FRET biosensors or intermolecular FRET of protein interactions such as oligomerization or heterodimerization, which can be used to identify binding partners. We describe here the functionality of this automated multiwell plate FLIM instrumentation and present exemplar data from our studies of HIV Gag protein oligomerization and a time course of a FRET biosensor in live cells. A detailed description of the practical implementation is then provided with reference to a list of hardware components and a description of the open source data acquisition software written in &#181;Manager. The application of FLIMfit, an open source MATLAB-based client for the OMERO platform, to analyze arrays of multiwell plate FLIM data is also presented. The protocols for imaging fixed and live cells are outlined and a demonstration of an automated multiwell plate FLIM experiment using cells expressing fluorescent protein-based FRET constructs is presented. This is complemented by a walk-through of the data analysis for this specific FLIM FRET data set.

We present an open source high content analysis (HCA) instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) based readouts. Data acquisition for this openFLIM-HCA instrument is controlled by software written in &#181;Manager and data analysis is undertaken in FLIMfit.

Otomatik Flüoresans Ömrü Görüntüleme Mikroskopi kullanmak Open Source Yüksek İçerik Analizi

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions ...