Diese Forschung wurde unterstützt durch Zuschüsse des NIH/NIAID AI112423 und NIH/NIGMS GM113885, Benjamin K. Chen und NIH/NIAID K08-AI120806, Talia H. Swartz. Wir möchten der Icahn School of Medicine am Mount Sinai Dean Flow Cytometry Kern zu danken.

1. Generation der Ziel-Zell-Linien
Hinweis: Dieser Schritt ist optional; Wenn Sie eine bestehenden RG-Ziel-Zelllinie zu verwenden, beginnen Sie mit Schritt 2.
<ol><li>Cotransfect einen 70 % konfluierende 10 cm Teller mit 293T Zellen11 [in 10 mL Dulbeccos modifizierten Eagle Medium (DMEM) mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS)] mit pMSCV-loxp-dsRed-loxp-eGFP-Puro-WPRE10 und pCL-10A112 (Verpackung Plasmid) in einem Verhältnis 1:1 (insgesamt 20 µg) mittels Calcium-basierte Transfektion13.</li>
	<li>10 mL virale überstand 48 h nach Transfektion durch die Medien von der Platte in ein 15 mL konische Röhrchen pipettieren und Zentrifugieren der Röhre bei 3.000 X g für 5 min bei 23 ° C zu jeder zellenrückstand Pellets zu ernten.</li>
	<li>Legen Sie einen 0,45 µm-Filter auf eine 10 mL Spritze. Nach Zentrifugation die gesamte überstand und laden Sie die Spritze. Führen Sie das Beispiel durch in eine saubere 15 mL-Tube.</li>
	<li>Aliquot der gefilterten virale überstand in entsprechender Größe (in der Regel 0,5-1 mL-aliquoten). Diese können im nächsten Schritt sofort verwendet werden oder können bei-80 ° C eingefroren und gespeichert.</li>
	<li>Verwenden Sie 50-100 µL virale überstand auf um eine Zelllinie der Wahl in eine 96-Well-Platte zu infizieren. Kultur der Zellen bei 37 ° C mit 5 % CO2. Das RFP-Signal sollte so bald wie 24 h unter dem Fluoreszenzmikroskop (40 X Vergrößerung, 532 nm Anregung, 588 nm Emission) erscheinen aber kann bis zu 72 Stunden dauern. Hinweis: In diesen Experimenten Jurkat-Zellen wurden verwendet, aber auch andere Arten verwendet werden.</li>
	<li>Wählen Sie ausgestrahlt Zellen mit Puromycin durch Einrichtung einer Reihe von 10 Bohrungen und Hinzufügen von Puromycin zu jedem, mindestens 1 gut verlassen unbehandelt als Steuerelement (Einsatz eine Vielzahl von Konzentrationen von 0,5 µg/mL bis 5 µg/mL; Dies kann je nach Zelltyp variieren). Monitor der Zellviabilität (Zelle Lysis tritt in Zellen ohne Puromycin Widerstand) im Laufe von mehreren Tagen im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle und Nutzung einer Konzentration von Puromycin wo nur RFP exprimierenden Zellen überleben. Hinweis: Wählen Sie die Konzentration, wo untransfected Zellen abgetötet werden, während transfizierte Zellen überleben.</li>
	<li>Mit einzelligen Flow Cytometry sortieren oder eine begrenzende Verdünnung (siehe Schritte 1,8 – 1.10), wachsen Kulturen abgeleitet von Einzelzellen1 eine klonale Zelllinie zu entwickeln (Dies dauert mehrere Wochen, um zu wachsen).</li>
	<li>Wenn die Verdünnungsmethode verwenden, zählen Sie die Zellen unter Verwendung einer Hemocytometer und verdünnen Sie die Probe bis ca. 500 Zellen/mL.</li>
	<li>In einer 96-Well-Platte pipette 50 µL der Zelle Verdünnung in 50 µL der Medien [Roswell Park Memorial Institute (RPMI) Medium mit 10 % FBS und 2 % Penicillin-Streptomycin, wenn Jurkat Zellen verwenden], und führen Sie 1:1 serielle Verdünnungen in 11 Brunnen mit 50 µL der Medien. Die besten Ergebnisse zu erzielen führen Sie mindestens 10 Wiederholungen.</li>
	<li>Überwachen Sie das Zellwachstum über Mikroskopie (40 X) der Platte in einer Gewebekultur Inkubator (37 ° C mit 5 % CO2) oder ca. 4 Wochen. Wählen Sie die niedrigste Konzentration von Puromycin mit Wachstum (als gesehen per Mikroskop, 40 X) für die klonalen Kulturen Kulturen.</li>
	<li>Frieren Sie die aliquoten durch Zentrifugieren 20 mL der Kultur (500.000 Zellen/mL, mit einem Hemocytometer gezählt) bei 800 X g für 5 min bei 23 ° C und in 500 µL der FBS mit 10 % DMSO resuspending. Legen sie bei-80 ° C mit einer Zelle-Einfrieren-Container und speichern Sie es dann in flüssigem Stickstoff.</li>
</ol>(2) Zell-Zell-Virusübertragung
<ol><li>
Vorbereitung der Zielzellen
	<ol>
<li>Tauwetter ein 500 µL Fläschchen Jurkat RG Reporter Zellen indem man sie in ein Wasserbad von 37 ° C. Die Zellen aus der Durchstechflasche in 10 mL RPMI komplette Medium Pipette und Zentrifugieren Sie die Mischung bei 800 X g für 5 min bei 23 ° C. Das Pellet in 20 mL RPMI komplette Medium in eine T-75 Flasche aufzuwirbeln. Inkubieren Sie die Flasche über Nacht (37 ° C und 5 % CO2). Hinweis: Vollständige RPMI Medium enthält RPMI 1640, 10 % FBS, 2 mM L-Glutamin, 100 Einheiten/mL Penicillin und 100 mg/mL Streptomycin.</li>
		<li>Fügen Sie am nächsten Tag 0,5 µg/mL von Puromycin (1 µL einer 2 mg/mL-Aktie je 8 mL der Medien hinzu). Kulturzellen Sie die Aufrechterhaltung einer Dichte von 200.000 – 800.000 Zellen/mL ( über Hemocytometer gezählt).</li>
		<li>Am Tag vor dem Einrichten der Transfer-Assay, löste sich die Zellen bis zu 200.000 – 400.000 Zellen/mL frisches RPMI Medium mit 0,5 µg/mL von Puromycin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Vorbereitung der Spenderzellen
	<ol>
<li>Tauen Sie untransduced Jurkat Zellen und Kultur, die sie in eine T-75 Flasche mit 20 mL RPMI Medium (wie in Schritt 2.1 beschrieben), halten eine Dichte von 200.000 – 800.000 Zellen/mL abzuschließen.</li>
		<li>Zentrifugieren 7.500.000 Zellen (800 X g für 5 min) und Aufschwemmen sie in 120 µL Nucleofection Lösung V mit Zuschlag (siehe Tabelle der Materialien). Übertragen Sie die Zellen auf eine Elektroporation Küvette und fügen Sie 4,5 µg Gag-iCre1 DNA. Die Zellen zu transfizieren (über eine Elektroporation basierenden Ansatz, siehe die Tabelle der Materialien) mit einem geeigneten Programm (z.B.S-18) und dann sofort auf 3 mL RPMI Medium übertragen (mit 10 % FBS).</li>
		<li>Lassen Sie die Zellen wiederherstellen, indem sie über Nacht bei 37 ° C mit 5 % CO2Inkubation.</li>
		<li>Am nächsten Morgen Zentrifugieren der Zellen bei 800 X g für 5 min bei 23 ° C und sie in 3 mL RPMI komplette Medium, so dass sie 2 h bei 37 ° C (5 % CO2) wiederherstellen, bevor Sie fortfahren mit dem Assay-Setup erneut.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Kokultur
	<ol>
<li>Zählen Sie die Zellen unter Verwendung einer Hemocytometer dann Spin down 50.000 Zellen (800 X g für 5 min bei 23 ° C) pro Bohrloch zu (der Spender und Ziel-Zellen) untersucht werden. Resuspending 1 x 106 Zellen/mL in RPMI komplett ohne Puromycin.</li>
		<li>Fügen Sie in einer Platte 25 µL Zellsuspension Spender in jede Vertiefung hinzu; Fügen Sie in einer anderen Platte 25 µL der Zielzellen.</li>
		<li>Fügen Sie in jede Vertiefung 25 µL der Testverbindung in RPMI komplette Medium bei der entsprechenden Konzentration verdünnt hinzu. Inkubieren Sie die Spender und Ziel Zellen mit der Verbindung für 30 min. Hinweis: Die Konzentration variiert pro Medikament. Wenn es eine bekannte IC50verfügt, verwenden Sie diese als Ausgangspunkt, titrieren, oben und unten. Wenn IC50 unbekannt ist, bereiten Sie eine 200 µM-Lager für eine Endkonzentration von 10 µM.</li>
		<li>Kombinieren Sie nach der Vorbehandlung die Spenderzellen mit den Zielzellen durch pipettieren der Inhalt einer Platte in den anderen und inkubieren Sie die Zellen für 40 h in einer Gewebekultur Inkubator bei 37 ° C mit 5 % CO2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Durchflusszytometrie
	<ol>
<li>Jede Vertiefung, eine Endkonzentration von 2 % Paraformaldehyd (PFA) hinzufügen. Hinweis: Für eine Stammlösung 16 % ist dies 14 µL pro 100 µL.</li>
		<li>Achtung: PFA ist schädlich für Haut und Augen. Tragen Sie ein Kittel, Handschuhe und Schutzbrille zu und verarbeiten Sie der Stammlösung in eine Schutzhaube.</li>
		<li>Lesen Sie die Zellen auf einem Durchflusszytometer mit mCherry und FITC-Kanäle. Hinweis: Es ist möglich, 5 – 20 % der Zellen GFP über Hintergrund in den infizierten Zellen VsAusdruck zu sehen. nicht infizierte Zellen.</li>
		<li>Visualisieren Sie das GFP-Signal per Fluoreszenz-Mikroskopie (40 X) auf GLP-spezifische Kanäle (mit Erregung Filter von 400 nm und eine Emission Filter von 508 nm).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. alternative Protokoll für eine zellfreie Virus-Infektion
<ol><li>
Vorbereitung der Zielzellen
	<ol>
<li>Tauwetter ein 500 µL Fläschchen Jurkat RG Reporter Zellen indem man in einem 37 ° C-Wasserbad. Die Zellen aus der Durchstechflasche in 10 mL RPMI komplette Medium Pipette und Zentrifugieren Sie komplette RPMI Medium bei 800 X g für 5 min bei 23 ° C. Das Pellet in 20 mL RPMI komplette Medium in eine T-75 Flasche aufzuwirbeln. Inkubieren Sie die Flasche über Nacht (37 ° C und 5 % CO2).</li>
		<li>Fügen Sie am nächsten Tag 0,5 µg/mL von Puromycin (1 µL einer 2 mg/mL-Aktie je 8 mL der Medien hinzu). Kulturzellen Sie die Aufrechterhaltung einer Dichte von 200.000 – 800.000 Zellen/mL ( über Hemocytometer gezählt).</li>
		<li>Am Tag vor dem Einrichten der Transfer-Assay, löste sich die Zellen bis zu 200.000 – 400.000 Zellen/mL frisches RPMI Medium mit 0,5 µg/mL von Puromycin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Produktion eines zellfreien Virus
	<ol>
<li>Transfizieren einen 70 % konfluierende 10 cm Teller mit 293T Zellen11 (in 10 mL DMEM mit 10 % FBS) mit 5 µg Gag-iCre1 Plasmids mit Calcium-basierte Transfektion13. Hinweis: Diese Skala erzeugt 10 mL des Virus, das reicht für ca. zwei bis vier 96-Well Platten, abhängig von der Effizienz der Transfektion.</li>
		<li>Ernten Sie die gesamte virale Überstand bei 48 h durch die Medien von der Platte in ein 15 mL konische Röhrchen pipettieren und Zentrifugieren der Röhre bei 3.000 X g für 5 min zu allen zellenrückstand Pellets.</li>
		<li>Legen Sie einen 0,45 µm-Filter auf eine 10 mL Spritze. Nach Zentrifugation die gesamte überstand und laden Sie die Spritze. Führen Sie das Beispiel durch in eine saubere 15 mL-Tube.</li>
		<li>Verwenden Sie das Virus infizieren Zielzellen sofort (Schritt 3.3) oder Einfrieren und speichern das Virus bei-80 ° C (Tauwetter der Probe bei Bedarf vor der Verwendung).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Infektion
	<ol>
<li>Zählen die RG Jurkat Zielzellen (aus Schritt 3.1.3) unter Verwendung eines Hemocytometer und Spin down 50.000 Zielzellen pro Bohrloch bei 800 X g für 5 min, resuspending der Zellen bei 1 x 106 Zellen/mL in RPMI Medium ohne Puromycin abzuschließen.</li>
		<li>Fügen Sie in einer Platte 25 µL RG Jurkat Zielzellen in jede Vertiefung hinzu; in einer separaten Platte hinzufügen 25 µL (2 ng) Virus in jede Vertiefung.</li>
		<li>Fügen Sie in jede Vertiefung 25 µL der Testverbindung in Medien bei der entsprechenden Konzentration verdünnt hinzu. Inkubieren Sie die Zellen und das Virus mit der Verbindung für 30 min. Hinweis: Die Testkonzentration variiert pro Medikament. Wenn es eine bekannte IC50verfügt, verwenden Sie diese als Ausgangspunkt, titrieren, oben und unten. Falls unbekannt, bereiten Sie ein 200 µM Lager Medium für eine Endkonzentration von 10 µM.</li>
		<li>Fügen Sie nach der Vorbehandlung den gesamten Inhalt (50 µL) des Virus/Verbund-Mix aus den Vertiefungen zu den Zielzellen und inkubieren Sie alles für 40 h in einer Gewebekultur Inkubator bei 37 ° C mit 5 % CO2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Durchflusszytometrie
	<ol>
<li>Fügen Sie PFA in jede Vertiefung, eine Endkonzentration von 2 %. Hinweis: Für eine Stammlösung 16 % ist dies 14 µL pro 100 µL.</li>
		<li>Lesen Sie die Zellen auf einem Durchflusszytometer mit mCherry und FITC-Kanäle. Das GFP-Signal kann auch visualisiert über Fluoreszenz-Mikroskopie auf GLP-Kanälen. Hinweis: Einmal erwarten 5 – 20 % der Zellen GFP über Hintergrund in den infizierten Zellen Vszum Ausdruck zu bringen. die nicht infizierten Zellen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Esposito, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+throughput+Cre-lox+activated+viral+membrane+fusion+assay+identifies+pharmacological+inhibitors+of+HIV+entry.">A high throughput Cre-lox activated viral membrane fusion assay identifies pharmacological inhibitors of HIV entry.</a> Virology. 490, 6-16 (2016).</li><li>Cavrois, M., De Noronha, C., Greene, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+and+specific+enzyme-based+assay+detecting+HIV-1+virion+fusion+in+primary+T+lymphocytes.">A sensitive and specific enzyme-based assay detecting HIV-1 virion fusion in primary T lymphocytes.</a> Nature Biotechnology. 20, 1151-1154 (2002).</li><li>Huerta, L., Lamoyi, E., Baez-Saldana, A., Larralde, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+immunodeficiency+virus+envelope-dependent+cell-cell+fusion:+a+quantitative+fluorescence+cytometric+assay.">Human immunodeficiency virus envelope-dependent cell-cell fusion: a quantitative fluorescence cytometric assay.</a> Cytometry. 47, 100-106 (2002).</li><li>Sakamoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+an+HIV+cell-cell+fusion+assay+by+using+two+genetically+modified+HeLa+cell+lines+and+reporter+gene.">Establishment of an HIV cell-cell fusion assay by using two genetically modified HeLa cell lines and reporter gene.</a> Journal of Virological Methods. 114, 159-166 (2003).</li><li>Herschhorn, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+inducible+cell-cell+fusion+system+with+integrated+ability+to+measure+the+efficiency+and+specificity+of+HIV-1+entry+inhibitors.">An inducible cell-cell fusion system with integrated ability to measure the efficiency and specificity of HIV-1 entry inhibitors.</a> PLoS One. 6, e26731 (2011).</li><li>Swartz, T. H., Esposito, A. M., Durham, N. D., Hartmann, B. M., Chen, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P2X-selective+purinergic+antagonists+are+strong+inhibitors+of+HIV-1+fusion+during+both+cell-to-cell+and+cell-free+infection.">P2X-selective purinergic antagonists are strong inhibitors of HIV-1 fusion during both cell-to-cell and cell-free infection.</a> Journal of Virology. 88, 11504-11515 (2014).</li><li>Marin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+HIV-Cell+Fusion+Assay+for+Discovery+of+Virus+Entry+Inhibitors.">High-Throughput HIV-Cell Fusion Assay for Discovery of Virus Entry Inhibitors.</a> Assay and Drug Development Technologies. 13, 155-166 (2015).</li><li>Giroud, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+and+Functional+Profiling+of+Small-Molecule+HIV-1+Entry+and+Fusion+Inhibitors.">Screening and Functional Profiling of Small-Molecule HIV-1 Entry and Fusion Inhibitors.</a> Assay and Drug Development Technologies. 15, 53-63 (2017).</li><li>Hubner, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+(HIV-1)+Gag+localization+and+oligomerization+monitored+with+live+confocal+imaging+of+a+replication-competent,+fluorescently+tagged+HIV-1.">Sequence of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) Gag localization and oligomerization monitored with live confocal imaging of a replication-competent, fluorescently tagged HIV-1.</a> Journal of Virology. 81, 12596-12607 (2007).</li><li>Koo, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+gene+expression+in+primary+Lgr5+organoid+cultures.">Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures.</a> Nature Methods. 9, 81-83 (2011).</li><li>Pear, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+high-titer+helper-free+retroviruses+by+transient+transfection.">Production of high-titer helper-free retroviruses by transient transfection.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 90, 8392-8396 (1993).</li><li>Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pCL+vector+system:+Rapid+production+of+helper-free,+high+titer,+recombinant+retroviruses.">The pCL vector system: Rapid production of helper-free, high titer, recombinant retroviruses.</a> Journal of Virology. 70, 5701-5705 (1996).</li><li>Kingston, R. E., Chen, C. A., Okayama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+Phosphate+Transfection.">Calcium Phosphate Transfection.</a> Current Protocols in Immunology. 10, 10-13 (2001).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Die Gag-iCre Assay erweist sich als sehr nützlich für das screening von Medikamenten-Kandidaten, die die Fusion Schritt der Virusreplikation hemmen können. Wenn Sie diesen Test durchführen, sind die wichtigsten Schritte, um ein gutes Signal ähnlich wie die meisten viralen Infektion Assays. Der erste wichtige Schritt ist hohe Titer von guter Qualität Virus produziert. Dieser Schritt erfordert, dass die 293T Zellen passagiert häufig (mindestens 1 x alle 48 Std.), so dass sie nicht Overconfluent zu werden und verklumpen. Darüber hinaus kann es sich lohnen experimentieren mit verschiedenen Transfektion Methoden, wie einige Forscher, dass die Transfektion Kalziumphosphat bessere Ergebnisse erzielt feststellen, während anderen Lipid-basierte Reagenzien zu begünstigen. Auch ist der anderen kritischen Schritt in diesem Protokoll nicht zulassen, das Ziel, die Zellen überwuchern aber in der exponentiellen Wachstumsphase direkt vor der Infektion zu halten als die stationäre Phase reduziert ihre Fähigkeit, infiziert werden.
Im Vergleich zu den etablierten BlaM-Vpr Assay2, bietet die Gag-iCre Assay einen Substrat-freie Assay ohne Label Zielzellen. Dies macht es für bestimmte Anwendungen mit hohem Durchsatz1gut geeignet. Darüber hinaus bietet der Assay einen permanenten-Marker für virale Eintrag, selbst wenn die Zelle latent, bietet einige Möglichkeiten, latenten Infektion zu studieren wird. Zukunftsforschung für Latenz können dieses System bei Mäusen nutzen, wo RG-Zellen, die auf grün aufgrund der Gag-iCre Exposition vertauscht worden, aber nicht produktiv infiziert, isoliert, die Zell-Populationen mit einem latenten Virus oder unproduktiven Infektion zu studieren werden konnte. Neben der Latenz hat der Test Andere Anwendungsmöglichkeiten. Es ist erfolgreich verwendet worden für Pseudo-Eingabe mit anderen Proteinen der Virushülle wie Ebola und VSV (unveröffentlichte Daten), eröffnet das Potenzial dieser Assay, Fusion Inhibitoren für eine Vielzahl von Viren in sicherer Weise als das Arbeiten mit einer live zu identifizieren Virus.
Eine mögliche Einschränkung des Gag-iCre Tests ist, dass es einen zusätzlichen Tag für das Signal zu entwickeln, dauert im Vergleich zu BlaM-Vpr. Darüber hinaus repliziert das Gag-iCre Virus in seinem gegenwärtigen Zustand nur für einen einzigen Zyklus, der für Drogen-Screening unter den Bedingungen funktioniert, wir haben beschrieben, aber wäre nicht geeignet für Langzeitstudien oder Wachstumskurven. In Zukunft werden neue Versionen des Tests mit verschiedenen Reporter Signalen, z. B. Luciferase, so dass für eine breitere Palette von Anwendungen erfolgen. Darüber hinaus wird das Screening von größeren zusammengesetzten Bibliotheken wahrscheinlich Ausbeute neuartiger Inhibitoren spezifisch für die Fusion Schritt der Virusreplikation.

Die Notwendigkeit einer neuen antiretroviralen Therapien veranlasste die Entwicklung von Hochdurchsatz-Bildschirme für Inhibitoren der HIV-1 Eintrag. Die Gag-iCre Reporter Assay wurde entwickelt, um Inhibitoren der viralen Eintrag bei der Fusion Schritt in einem System von Zelle zu Zelle Infektion zu identifizieren, durch speziell virale Membranfusion mit dem Host Zellmembran1messen. Ein Test wurde entwickelt, um Bildschirm für neuartige Hemmstoffe, die speziell auf den frühen Stadien der HIV-1-Infektion bis zu dem Punkt der viralen Membranfusion gehandelt. Eine Herausforderung für die Messung der Zell-Zell-Infektion ist, dass das anfängliche Inokulum enthält infizierten Spenderzellen und ininfected Zielzellen, so Neuinfektionen zu messen schwierig ist, von der Eingabezellen unterscheiden. Das ideale System würde bedeuten, eine Heterologe gen-Markierung, die durch die Einleitung einer Ziel-Zelle-Infektion verursacht werden kann und in der Spender Zelle ist nicht vorhanden. Eine beliebte virale Inhalte mischen Assay basiert auf einer viralen Protein-Enzym-Fusion, BlaM-Vpr, wirksam sein können, aber hat seine Grenzen für hohen Durchsatz, Zell-Zell-Screening-2. Dieser Test beinhaltet eine Beta-Lactamase (BlaM) Reporter-gen, die mit HIV-1 Vpr verschmolzen, in Virionen verpackt und geliefert in Zielzellen auf virale Membranfusion. Das Substrat CCF2-AM wird in das Zytoplasma der Zielzellen geladen und eine Fluoreszenz Veränderung bei der Spaltung. Das CCF2-AM Substrat ist teuer und unerschwinglich für Hochdurchsatz-Bildschirme werden kann. Um Spender und Ziel-Zellen zu unterscheiden, ist es notwendig, Farbstoff-Label der Zielgruppen. Schließlich erfordert das Protokoll mehrere Wasch- und Inkubation Schritte, die aufwändig und kostspielig sein können, wenn große Anzahl von Verbindungen zu testen.
Die Gag-iCre Assay entwickelte sich als eine Lösung für diese Probleme eine Hochdurchsatz-screening für Inhibitoren der Fusion in Zell-Zell-Übertragung zu entwickeln. Dieses System erfordert keine Substrat in Zellen geladen werden. Der Test eignet sich auch für zellfreie Studien und ist anpassungsfähig an andere virale Fusion Studien mit Pseudo-typisierte HIV-1-Gag-iCre Viruspartikel. HIV Env vermittelte Zell-Zell-Fusion-Assays können Virus Env Protein-vermittelte Zellfusion, Messen, aber diese nicht tatsächliche Viruspartikel benutzen, ebenso wie die Gag-iCre HIV-1-Assay3,4,5. Dieser Test kann mit Flow-zytometrie oder Fluoreszenz-Mikroskopie gelesen werden. Es wird erfolgreich eingesetzt, die FDA-Bibliothek sowie eine kleine Bibliothek von Purinergic Inhibitoren1,6auf den Bildschirm. Andere Forscher identifizierten auch Purinergic Inhibitoren in HIV-1 Fusion mit eine angepasste und optimierte Hochdurchsatz-Fusion-Assay, der berichtet die Übertragung des Virus-gekapselte Beta-Lactamase in das Zytoplasma7,8 .
Die Gag-iCre-Virus wurde mit einem ähnlichen Ansatz für das Einfügen von Cre-Rekombinase zwischen Matrix und Kapsid, flankiert von HIV-1 Protease Seiten9Gag-iGFP-Virus entwickelt. Das Cre-Enzym erfolgt als Vorläufer innerhalb der Gag-funkionalen, die reift bei HIV-1 Protease innerhalb der im Entstehen begriffenen Viruspartikel aktivierter eingefügt. Die Cre-Lieferung ist somit abhängig von der Lieferung der Inhalte von HIV-1 Protease-aktivierten Teilchen in ein Ziel Zelle über eine virale Membran Fusionsprozess. Zwei Versionen des Protokolls stehen hier zur Verfügung. Die erste verwendet eine Bevölkerung von HIV-1 infizierten Zielzellen, zur Untersuchung der direkten Zell-Zell-Übertragung von HIV zu infizieren. Die zweite Version verwendet einen zellfreie Virus eine zellfreie Virusinfektion zu studieren. Der Zell-Zell-Übertragung-Test dauert 7 Tage ab dem Tag abgeschlossen, die die Zellen aufgetaut sind, oder 5 Tage, wenn die Zellen bereits aufgetaut und passagiert sind. Zellfreie Infektion Assay kann in 5 Tagen, wenn die Zellen müssen aufgetaut werden und 3 Tage durchgeführt werden, wenn die Zellen aufgetaut und passagiert sind. Anweisungen sind auch generieren eine RG (rot, grün) Ziel-Zelllinie in der gewünschten Zelltyp (wenn eine bereits vorhandene RG-Ziel-Zelllinie nicht verwendet wird) mit einem Plasmid von Clevers Lab10erstellt. Es wird empfohlen, entsprechende biologische Sicherheitsvorkehrungen, mit dem Virus und der Virus exprimierenden Zellen in diesem Test getroffen werden. Wir führen die infektiöse Teil des Assays in einer Gewebekultur Einrichtung BSL2 +. Nachdem die Zellen fixiert sind, können sie im standard Flow Cytometry und Mikroskopie Einrichtungen analysiert werden.
Hier beschreiben wir die Anwendung des Assays auf Bildschirm für Roman Verbindungen hemmen HIV-1 Virus Membranfusion (Abbildung 1). Purinergic Rezeptoren sind Pro-inflammatorischen Mediatoren. Unser Labor hat gezeigt, dass nicht-selektive Inhibitoren der Purinergic Rezeptoren als Inhibitoren von HIV-1 virale Membran Fusion6handeln. Wir berichten, dass die Nutzung des Assays in hohem Durchsatz Roman HIV-1 virale Membran Fusion Inhibitoren identifizieren kann. Wir zeigen, dass ein Inhibitor der Purinergic Klasse Rezeptoren eine neuartige Klasse von HIV-1 virale Membran Fusion Inhibitoren darstellt.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle&#039;s Medium (DMEM)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5546</td><td>Media for 293 Cells</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R0883</td><td>Media for Jurkats</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum Albumin</td><td>Gibco</td><td>16140-071</td><td>Serum for 293 Cells</td></tr><tr><td>Cosmic Calf Serum</td><td>Hyclone</td><td>SH30087.03</td><td>Serum for Jurkat Cells</td></tr><tr><td>Hyclone Pennecillin Streptomycin solution</td><td>GE Healthcare Life sciences</td><td>SV30010</td><td>Penn/Strep used in both media</td></tr><tr><td>T75 Flasks</td><td>Corning</td><td>3073</td><td>Used for Culture of Jurkat Cells</td></tr><tr><td>10 cm Tissue Culture Plates</td><td>Corning</td><td>430167</td><td>Used for Culture of 293 Cells</td></tr><tr><td>96 Well Plates (tissue culture Treated)</td><td>Corning</td><td>3595</td><td>Used for fusion assay</td></tr><tr><td>Polyjet Transfection Reagent</td><td>Signagen</td><td>SL100688</td><td>Used to transfect 293 Cells</td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Phosphate Buffered Saline</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8537-100ML</td><td>Used in wash steps</td></tr><tr><td>Hyclone Trypsin Protease</td><td>GE Healthcare Life sciences</td><td>SH30042.01</td><td>For Trypsinization of 293 cells</td></tr><tr><td>Amaxa Cell Line Nucleofector Kit V</td><td>Lonza</td><td>VACA-1003</td><td>For Nucleofection of Jurkats</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque plus</td><td>GE Healthcare Life sciences</td><td>17144002</td><td>For Nucleofection of Jurkats</td></tr><tr><td>Serological Pipettes</td><td>Fisher Brand</td><td>13-678-11E</td><td>For all tissue culture</td></tr><tr><td>Pipettor Tips</td><td>Denville Scientific</td><td>P3020-CPS</td><td>For all tissue culture and liquid handling steps</td></tr><tr><td>Millex Syringe Filter (0.45 &amp;mu;m)</td><td>Millipore</td><td>SLHA033</td><td>For filtration of virus</td></tr><tr><td>BD Slip Tip Sterile syringes</td><td>BD Diagnostics</td><td>309656</td><td>For filtration of virus</td></tr><tr><td>Amaxa Nucleofector</td><td>Lonza</td><td>2b</td><td>for Nucleofection of Jurkats (various models available)</td></tr><tr><td>BD Fortessa Flow Cytometer</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>for flow cytometry analyss of samples</td></tr><tr><td>Tissue Culture Hood</td><td>Various models</td><td>Fortessa 2</td><td></td></tr><tr><td>pMSCV-loxp-dsRed-loxp-eGFP-Puro-W PRE</td><td>Addgene</td><td>32702</td><td>&lt;strong&gt;Koo BK&lt;em&gt; et al.&lt;/em&gt;&lt;/strong&gt; Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures. Nature Methods &lt;strong&gt;9:&lt;/strong&gt;81-83 (2011).</td></tr><tr><td>pCL10a1</td><td>Novus Bio</td><td>NBP2-29542</td><td>&lt;strong&gt;Naviaux, RK, Costanzi, E, Haas, M and Verma, I&lt;/strong&gt;. The pCL vector system: Rapid production of helper-free, high titer, recombinant retroviruses. Journal of Virology &lt;strong&gt;70&lt;/strong&gt;: 5701-5705 (1996)</td></tr><tr><td>Gag-iCre</td><td>Benjamin Chen Lab</td><td></td><td>&lt;strong&gt;Esposito AM&lt;em&gt; et al.&lt;/em&gt; &lt;/strong&gt;A high throughput Cre-lox activated viral membrane fusion assay identifies pharmacological inhibitors of HIV entry. Virology &lt;strong&gt;490:&lt;/strong&gt;6-16 (2016).</td></tr></tbody></table>

a high-throughput cre-lox activated viral membrane fusion assay to identify inhibitors of hiv-1 viral membrane fusion

Dieser Test soll speziell auf HIV-1 Fusion über den Ausdruck des grün fluoreszierenden Proteins (GFP) nachweisbar Berichten von Flow-zytometrie oder Fluoreszenz-Mikroskopie. Eine HIV-1-Reporter-Virus (HIV-1-Gag-iCre) entsteht durch das HIV-1-Genom zwischen der Matrix und die Kapsid-Proteine der Gag funkionalen Cre-Rekombinase einfügen. Dies führt zu einer Verpackung der Cre-Rekombinase in Viruspartikel, die dann in einer Zielzelle freigesetzt wird Linie stabil ein Cre Rekombinase aktiviert rot fluoreszierenden Proteins (RFP) zur GFP-Schalter-Kassette zum Ausdruck zu bringen. In den basalen Zustand drückt diese Kassette nur RFP. Im Anschluss an die Übergabe der Cre-Rekombinase in die Zielzelle oder beschneidet RFP, flankiert von LoxP-Websites, wodurch GFP Ausdruck. Dieser Test kann verwendet werden, um Inhibitoren der viralen Eintrag (speziell bei der Fusion Schritt) in zellfreien und Zell-Zell-Infektion Systeme zu testen und wurde verwendet, um eine Klasse von Purinergic-Rezeptor-Antagonisten als neuartige virale Membranfusion HIV-1-Hemmer zu identifizieren.

Nicht infizierte RG Jurkat Zellen weisen ein niedriges Niveau der GFP Hintergrundsignal (0,3 %) mit einem sehr starken RFP-Signal (Abb. 2A, nicht infizierten Spalte). Die Infektion mit Knebel-iCre führt zu einer Erhöhung im GFP Signal (24,9 %), während das Vorhandensein von HIV-1-Fusion-Inhibitor AMD3100 (20 µM) hemmt die Entwicklung dieses Signals, bringt es auf nicht infizierten Hintergrundwerte (0,34 %). Wenn ein Inhibitor eines Post-fusion Events wie der reversen Transkription Inhibitor AZT (2 µM) verwendet wird, wirkt nicht auf das Signal deutlich darauf hinweist, dass das GFP-Signal von der Assay produziert (23,5 %), ist spezifisch für HIV-1 Fusion. Abbildung 2 b zeigt eine dosisabhängige Inhibition der Gag-iCre Fusion mit PPADS (100 µM), ein nicht-selektiven Purinergic Inhibitor.
Abbildung 3 zeigt einen Vergleich der zellfreien virale Membranfusion HIV-1 mit der Gag-iCre-Assay (Abb. 3A) und die Konvention BlaM-Vpr-Assay (Abb. 3 b). Eine Titrierung der Gag-iCre und BlaM-Vpr Viren wurde verwendet, um Spinoculate — ein 2 h lang 1.200 x g Spin der Platte 96-Well-Infektion zu Beginn der Infektion auf seine Effizienz steigern – RG Jurkat Zellen mit Knebel-iCre und Jurkat Zellen mit dem BlaM-Vpr-Virus als zuvor beschrieben2. Bei 3 ng des Virus, ein robustes Signal von 64,7 % (Gag-iCre) und 47,2 % (BlaM-Vpr) der Zellen wurden verschmolzen beide Assays angeboten. Bei 0,3 ng des Virus, die Signale waren 1,18 % (Gag-iCre) und 2 % (BlaM-Vpr). Diese Daten legen nahe, dass Gag-iCre eine vergleichbare Signal für virale Fusion der etablierten BlaM-Vpr-Test bei einer Reihe von Virus-Konzentrationen anbieten kann.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58074/58074fig1.jpg"> Abbildung 1: Gag-iCre Assay Übersicht. RG Jurkat-Zellen sind mit Jurkat Spenderzellen mit HIV Gag-iCre transfiziert Co inkubiert. Bei viralen Membranfusion ist die Cre in den Zielzellen, die das DsRed gen an den LoxP-Standorten ermöglichen EGFP Ausdruck Spalten können, was in den Zellen grün fluoreszierenden freigegeben. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58074/58074fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58074/58074fig2.jpg"> Abbildung 2: Vertreter ergibt sich aus einem zellfreien und eine Zelle zu Zelle Gag-iCre Infektion. (A) zellfreie Gag-iCre Fusion wird gehemmt durch die Fusion-Inhibitor AMD3100, aber nicht von der reversen Transkription Inhibitor AZT. Diese Platten nicht infizierten RG Jurkat Zellen, unbehandelten RG Jurkat Zellen 48 h nach der Infektion und RG Jurkat Zellen 48 h nach der Infektion zeigen doch mit AMD3100 oder AZT, wie angegeben. Die oberen Platten repräsentieren fluoreszierende mikrographen auf dem GFP-Kanal, die mittleren Platten stellen fluoreszierende mikrographen auf dem Kanal von RFP, während die unteren Platten Fluoreszenz-aktivierte Zelle Sortieren (FACS) Daten für Proben mit GFP positiv darstellen ein der Prozentsatz ist bezeichnend für Fusion. Maßstabsleiste = 100 µm. Dieses Panel wurde mit freundlicher Genehmigung von Esposito Et Al. modifiziert 1. (B) das HIV-1 Virus Membranfusion nach Zell-Zell-Infektion wird durch PPADS gehemmt. RG Jurkat-Zellen wurden mit Jurkat Zellen mit HIV-1-Gag-iCre transfiziert gemischt, und die Inhibitoren AMD3100 und PPADS wurden für ihre Fähigkeit, Block virale Membranfusion bei 100 µM, getestet, wie in repräsentativen Fluoreszenz-activated Cell Sorter Grundstücke gezeigt. Diese Zahl wurde von Swartz Et Al. modifiziert 6. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58074/58074fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58074/58074fig3.jpg"> Abbildung 3: HIV Gag-iCre Reporter Signal ist vergleichbar mit BlaM-Vpr. Diese Tafeln zeigen die Ergebnisse einer FACS-Analyse (A) RG Zellen Spinoculated mit einem Knebel-iCre Virus und (B) Jurkat Zellen Spinoculated mit NL43 BlaM-Vpr, 16 h nach einem 6 h-Infektion in der angegebenen Konzentration des Virus. Dieses Panel wurde mit freundlicher Genehmigung von Esposito Et Al. modifiziert 1. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58074/58074fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

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A High-throughput Cre-Lox Activated Viral Membrane Fusion Assay to Identify Inhibitors of HIV-1 Viral Membrane Fusion

Wir beschreiben eine zellbasierte Assays auf HIV-1 Fusion über den Ausdruck von grün fluoreszierendes Protein nachweisbar durch Flow-zytometrie oder Fluoreszenz-Mikroskopie melden. Es kann verwendet werden, Inhibitoren der viralen Eintrag (speziell bei der Fusion Schritt) in zellfreien und Zell-Zell-Infektion Systeme zu testen.

Ein High-Throughput Cre-Lox aktiviert virale Membran Fusion Assay Ermittlung Inhibitoren der HIV-1 Virus Membranfusion

This assay is designed to specifically report on HIV-1 fusion via the expression of green fluorescent protein (GFP) detectable by flow cytometry or ...

a-high-throughput-cre-lox-activated-viral-membrane-fusion-assay-to

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

6.3K Aufrufe.  Icahn School of Medicine at Mount Sinai, Immunology Institute. Wir beschreiben eine zellbasierte Assays auf HIV-1 Fusion über den Ausdruck von grün fluoreszierendes Protein nachweisbar durch Flow-zytometrie oder Fluoreszenz-Mikroskopie melden. Es kann verwendet werden, Inhibitoren der viralen Eintrag (speziell bei der Fusion Schritt) in zellfreien und Zell-Zell-Infektion Systeme zu testen.

Serie: A High-throughput Cre-Lox Activated Viral Membrane Fusion Assay to Identify Inhibitors of HIV-1 Viral Membrane Fusion

Two Methods of Heterokaryon Formation to Discover HCV Restriction Factors

Hepatitis C virus (HCV) is a hepatotropic virus with a host-range restricted to humans and chimpanzees. Although HCV RNA replication has been observed in human non-hepatic and murine cell lines, the efficiency was very low and required long-term selection procedures using HCV replicon constructs expressing dominant antibiotic-selectable markers1-5. HCV in vitro research is therefore limited to human hepatoma cell lines permissive for virus entry and completion of the viral life cycle. Due to HCVs narrow species tropism, there is no immunocompetent small animal model available that sustains the complete HCV replication cycle 6-8. Inefficient replication of HCV in non-human cells e.g. of mouse origin is likely due to lack of genetic incompatibility of essential host dependency factors and/or expression of restriction factors.
We investigated whether HCV propagation is suppressed by dominant restriction factors in either human cell lines derived from non-hepatic tissues or in mouse liver cell lines. To this end, we developed two independent conditional trans-complementation methods relying on somatic cell fusion. In both cases, completion of the viral replication cycle is only possible in the heterokaryons. Consequently, successful trans-complementation, which is determined by measuring de novo production of infectious viral progeny, indicates absence of dominant restrictions.
Specifically, subgenomic HCV replicons carrying a luciferase transgene were transfected into highly permissive human hepatoma cells (Huh-7.5 cells). Subsequently, these cells were co-cultured and fused to various human and murine cells expressing HCV structural proteins core, envelope 1 and 2 (E1, E2) and accessory proteins p7 and NS2. Provided that cell fusion was initiated by treatment with polyethylene-glycol (PEG), the culture released infectious viral particles which infected na&iuml;ve cells in a receptor-dependent fashion.
To assess the influence of dominant restrictions on the complete viral life cycle including cell entry, RNA translation, replication and virus assembly, we took advantage of a human liver cell line (Huh-7 Lunet N cells 9) which lacks endogenous expression of CD81, an essential entry factor of HCV. In the absence of ectopically expressed CD81, these cells are essentially refractory to HCV infection 10 . Importantly, when co-cultured and fused with cells that express human CD81 but lack at least another crucial cell entry factor (i.e. SR-BI, CLDN1, OCLN), only the resulting heterokaryons display the complete set of HCV entry factors requisite for infection. Therefore, to analyze if dominant restriction factors suppress completion of the HCV replication cycle, we fused Lunet N cells with various cells from human and mouse origin which fulfill the above mentioned criteria. When co-cultured cells were transfected with a highly fusogenic viral envelope protein mutant of the prototype foamy virus (PFV11) and subsequently challenged with infectious HCV particles (HCVcc), de novo production of infectious virus was observed. This indicates that HCV successfully completed its replication cycle in heterokaryons thus ruling out expression of dominant restriction factors in these cell lines. These novel conditional trans-complementation methods will be useful to screen a large panel of cell lines and primary cells for expression of HCV-specific dominant restriction factors.

We describe two methods for conditional trans-complementation of hepatitis C virus (HCV) assembly and the completion of the full viral life cycle, which rely on heterokaryon formation. These techniques are suitable to screen for cell lines that express dominant restriction factors, which preclude production of infectious HCV progeny.

Zwei Methoden der Heterokaryon Formation zu entdecken HCV Restriktionsfaktoren

Hepatitis C virus (HCV) is a hepatotropic virus with a host-range restricted to humans and chimpanzees. Although HCV RNA replication has been observed in ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation

Proteases are intensively studied enzymes due to their essential roles in several biological pathways of living organisms and in pathogenesis; therefore, they are important drug targets. We have developed a magnetic-agarose-bead-based assay platform for the investigation of proteolytic activity, which is based on the use of recombinant fusion protein substrates. In order to demonstrate the use of this assay system, a protocol is presented on the example of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) protease. The introduced assay platform can be utilized efficiently in the biochemical characterization of proteases, including enzyme activity measurements in mutagenesis, kinetic, inhibition, or specificity studies, and it may be suitable for high-throughput substrate screening or may be adapted to other proteolytic enzymes.
In this assay system, the applied substrates contain N-terminal hexahistidine (His6) and maltose-binding protein (MBP) tags, cleavage sites for tobacco etch virus (TEV) and HIV-1 proteases, and a C-terminal fluorescent protein. The substrates can be efficiently produced in Escherichia coli cells and easily purified using nickel (Ni)-chelate-coated beads. During the assay, the proteolytic cleavage of bead-attached substrates leads to the release of fluorescent cleavage fragments, which can be measured by fluorimetry. Additionally, cleavage reactions can be analyzed by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). A protocol for the in-gel renaturation of assay components is also described, as partial renaturation of fluorescent proteins enables their detection based on molecular weight and fluorescence.

Here, we present the detailed procedure of a recently developed protease assay platform utilizing N-terminal hexahistidine/maltose-binding protein and fluorescent protein-fused recombinant substrates attached to the surface of nickel-nitrilotriacetic acid magnetic agarose beads. A subsequent in-gel analysis of the assay samples separated by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis is also presented.

Einsatz von rekombinanten Fusionsproteinen in eine fluoreszierende Protease-Assay-Plattform und ihre In-Gel-Renaturierung

Proteases are intensively studied enzymes due to their essential roles in several biological pathways of living organisms and in pathogenesis; therefore, ...

Biochemie

Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify new compounds that can inhibit infection by the common drug resistant HIV-1 strains with minimal toxicity. Here we describe an efficient assay that can be used to rapidly determine the cellular cytotoxicity and efficacy of a compound against WT and mutant viral strains.
The desired target cell line is seeded in a 96-well plate and, after a 24 hr incubation, serially dilutions of the compounds to be tested are added. No further manipulations are necessary for cellular cytotoxicity assays; for anti HIV assays a predetermined amount of either a WT or drug resistant HIV-1 vector that expresses luciferase is added to the cells. Cytotoxicity is measured by using an ATP dependent luminescence assay and the impact of the compounds on infectivity is measured by determining the amount of luciferase in the presence or the absence of the putative inhibitors.
This screening assay takes 4 days to complete and multiple compounds can be screened in parallel. Compounds are screened in triplicate and the data are normalized to the infectivity/ATP levels in absence of target compounds. This technique provides a quick and accurate measurement of the efficacy and toxicity of potential anti HIV compounds.

Here we describe cellular cytotoxicity and single round infectivity assays that allow for the rapid and accurate screening of compounds to determine their cellular cytotoxicity (CC50) and IC50 values against WT and drug resistant HIV-1.

Rapid-Screening von HIV-Reverse-Transkriptase und Integrase-Inhibitoren

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

A Restriction Enzyme Based Cloning Method to Assess the In vitro Replication Capacity of HIV-1 Subtype C Gag-MJ4 Chimeric Viruses

The protective effect of many HLA class I alleles on HIV-1 pathogenesis and disease progression is, in part, attributed to their ability to target conserved portions of the HIV-1 genome that escape with difficulty. Sequence changes attributed to cellular immune pressure arise across the genome during infection, and if found within conserved regions of the genome such as Gag, can affect the ability of the virus to replicate in vitro. Transmission of HLA-linked polymorphisms in Gag to HLA-mismatched recipients has been associated with reduced set point viral loads. We hypothesized this may be due to a reduced replication capacity of the virus. Here we present a novel method for assessing the in vitro replication of HIV-1 as influenced by the gag gene isolated from acute time points from subtype C infected Zambians. This method uses restriction enzyme based cloning to insert the gag gene into a common subtype C HIV-1 proviral backbone, MJ4. This makes it more appropriate to the study of subtype C sequences than previous recombination based methods that have assessed the in vitro replication of chronically derived gag-pro sequences. Nevertheless, the protocol could be readily modified for studies of viruses from other subtypes. Moreover, this protocol details a robust and reproducible method for assessing the replication capacity of the Gag-MJ4 chimeric viruses on a CEM-based T cell line. This method was utilized for the study of Gag-MJ4 chimeric viruses derived from 149 subtype C acutely infected Zambians, and has allowed for the identification of residues in Gag that affect replication. More importantly, the implementation of this technique has facilitated a deeper understanding of how viral replication defines parameters of early HIV-1 pathogenesis such as set point viral load and longitudinal CD4+ T cell decline.

A Restriction Enzyme Based Cloning Method to Assess the In vitro Replication Capacity of HIV-1 Subtype C Gag-MJ4 Chimeric Viruses

HIV-1 pathogenesis is defined by both viral characteristics and host genetic factors. Here we describe a robust method that allows for reproducible measurements to assess the impact of the gag gene sequence variation on the in vitro replication capacity of the virus.

Einem Restriktionsenzym basierte Klonen Methode, um das Beurteilen<em&gt; In-vitro-</em&gt; Replikation Kapazität von HIV-1 Subtyp C-Gag MJ4 chimären Viren

The protective effect of many HLA class I alleles on HIV-1 pathogenesis and disease progression is, in part, attributed to their ability to target ...

Method for Measurement of Viral Fusion Kinetics at the Single Particle Level

Membrane fusion is an essential step during entry of enveloped viruses into cells. Conventional fusion assays typically report on a large number of fusion events, making it difficult to quantitatively analyze the sequence of the molecular steps involved. We have developed an in vitro, two-color fluorescence assay to monitor kinetics of single virus particles fusing with a target bilayer on an essentially fluid support.
Influenza viral particles are incubated with a green lipophilic fluorophore to stain the membrane and a red hydrophilic fluorophore to stain the viral interior. We deposit a ganglioside-containing lipid bilayer on the dextran-functionilized glass surface of a flow cell, incubate the viral particles on the planar bilayer and image the fluorescence of a 100 x 100 &mu;m2 area, containing several hundreds of particles, on a CCD camera. By imaging both the red and green fluorescence, we can simultaneously monitor the behavior of the membrane dye (green) and the aqueous content (red) of the particles.
Upon lowering the pH to a value below the fusion pH, the particles will fuse with the membrane. Hemifusion, the merging of the outer leaflet of the viral membrane with the outer leaflet of the target membrane, will be visible as a sudden change in the green fluorescence of a particle. Upon the subsequent fusion of the two remaining distal leaflets a pore will be formed and the red-emitting fluorophore in the viral particle will be released under the target membrane. This event will give rise to a decrease of the red fluorescence of individual particles. Finally, the integrated fluorescence from a pH-sensitive fluorophore that is embedded in the target membrane reports on the exact time of the pH drop.
From the three fluorescence-time traces, all the important events (pH drop, lipid mixing upon hemifusion, content mixing upon pore formation) can now be extracted in a straightforward manner and for every particle individually. By collecting the elapsed times for the various transitions for many individual particles in histograms, we can determine the lifetimes of the corresponding intermediates. Even hidden intermediates that do not have a direct fluorescent observable can be visualized directly from these histograms.

We present an in vitro, two-color fluorescence assay to visualize the fusion of single virus particles with a fluid target bilayer. By labeling viral particles with fluorophores that differentially stain the viral membrane and its interior, we are able to monitor the kinetics of hemifusion and pore formation.

Methode zur Messung des Viral Fusion Kinetics auf der Single Particle Stufe

Membrane fusion is an essential step during entry of enveloped viruses into cells. Conventional fusion assays typically report on a large number of fusion ...

Biologie

Conformational Evaluation of HIV-1 Trimeric Envelope Glycoproteins Using a Cell-based ELISA Assay

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins are able to fuel the fusion process through their conformational changes could lead to the design of better, more effective immunogens for vaccine strategies. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows studying the recognition of trimeric HIV-1 Env by monoclonal antibodies. Following expression of HIV-1 trimeric Env at the surface of transfected cells, conformation specific anti-Env antibodies are incubated with the cells. A horseradish peroxidase-conjugated secondary antibody and a simple chemiluminescence reaction are then used to detect bound antibodies. This system is highly flexible and can detect Env conformational changes induced by soluble CD4 or cellular proteins. It requires minimal amount of material and no highly-specialized equipment or know-how. Thus, this technique can be established for medium to high throughput screening of antigens and antibodies, such as newly-isolated antibodies.

Understanding viral surface antigens conformations is required to evaluate antibody neutralization and guide the design of effective vaccine immunogens. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows the study of the recognition of trimeric HIV-1 Env expressed at the surface of transfected cells by specific anti-Env antibodies.

Konformationsänderungen Auswertung der HIV-1-Trimeric Hüllglycoproteine ​​mit eine Handy-basierte ELISA-Test

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins ...

Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic approach to identify and evaluate antiviral agents that target specific steps of the viral entry. In this report, the methods of examining viral inactivation, viral attachment, and viral entry/fusion as antiviral assays for such purposes are described, using hepatitis C virus as a model. These assays should be useful for discovering novel antagonists/inhibitors to early viral entry and help expand the scope of candidate antiviral agents for further drug development.

Here, we present a protocol that examines specific steps of the viral entry to identify and evaluate novel antiviral agents.

Frühe das Eindringen des Virus-Assays für die Ermittlung und Bewertung von antiviralen Verbindungen

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic ...

High Throughput In Vitro Assessment of Latency Reversing Agents on HIV Transcription and Splicing

HIV remains incurable due to the existence of a reservoir of cells that harbors stable and latent form of the virus, which stays invisible to the immune system and is not targeted by the current antiretroviral therapy (cART). Transcription and splicing have been shown to reinforce HIV-1 latency in resting CD4+ T cells. Reversal of latency by the use of latency reversal agents (LRAs) in the &#34;shock and kill&#34; approach has been studied extensively in an attempt to purge this reservoir but has thus far not shown any success in clinical trials due to the lack of development of adequate small molecules that can efficiently perturb this reservoir. The protocol presented here provides a method for reliably and efficiently assessing latency reversal agents (LRAs) on HIV transcription and splicing. This approach is based on the use of an LTR-driven dual color reporter that can simultaneously measure the effect of an LRA on transcription and splicing by flow cytometry. The protocol described here is adequate for adherent cells as well as the cells in suspension. It is useful for testing a large number of drugs in a high throughput system. The method is technically simple to implement and cost-effective. In addition, the use of flow cytometry allows the assessment of cell viability and thus drug toxicity at the same time.

A high throughput protocol for functional assessment of HIV efficient reactivation and clearance of latent proviruses is described and applied by testing the impact of interventions on HIV transcription and splicing. Representative results of the effect of latency reversing agents on LTR-driven transcription and splicing are provided.

Hoher Durchsatz In Vitro Bewertung der Latenz Umkehrung Agenten auf HIV Transkription und Spleißen

HIV remains incurable due to the existence of a reservoir of cells that harbors stable and latent form of the virus, which stays invisible to the immune ...

Single-Cell Characterization of Calcium Influx and HIV-1 Infection using a Multiparameter Optofluidic Platform

HIV-1 causes a chronic infection that affects more than 37 million people worldwide. People living with human immunodeficiency virus (HIV) experience comorbidity related to chronic inflammation despite antiretroviral therapy. However, these inflammatory signaling has not been fully characterized. The role of early entry events on the activation of cellular signaling events and downstream gene expression has not been captured at the single-cell level. Here the authors describe a method that applies principles of live-cell fluorescence microscopy to an automated single-cell platform that cultures and images cells over user-customized time courses, allowing for high-throughput analysis of dynamic cellular processes. This assay can track single-cell live fluorescence microscopy of early events that immediately follow HIV-1 infection, notably the influx of calcium that accompanies exposure to the virus and the development of productive infection using a fluorescent reporter virus. MT-4 cells are loaded with a calcium-sensitive dye and cultured in isolated pens on a nanofluidic device. The cultured cells are infected with an HIV-1 reporter virus (HIV-1 NLCI). A fluorescence microscope positioned above the nanofluidic device measures calcium influx over an 8-min time course following acute HIV-1 exposure. HIV-1 productive infection is measured in those same cells over a 4-day interval. Imaging data from these time courses are analyzed to define virus-host receptor interactions and signaling pathway dynamics. The authors present an integrated, scalable alternative to traditional imaging methods using a novel optofluidic platform capable of single-cell sorting, culturing, imaging, and software automation. This assay can measure the kinetics of events under various conditions, including cell type, agonist, or antagonist effect, while measuring an array of parameters. This is the first established method for nanofluidic high-throughput longitudinal single-cell culture and imaging: This technique can be broadly adapted to study cellular signaling kinetics and dynamic molecular interactions.

Here, we present a protocol in which single cells are monitored for acute events and productive HIV-1 infection on a nanofluidic device. Imaging data define virus-host receptor interactions and signaling pathway dynamics. This is the first method for nanofluidic high-throughput longitudinal single-cell culture and imaging to study signaling kinetics and molecular interactions.

Einzelzellcharakterisierung von Kalziumzufluss und HIV-1-Infektion mit einer multiparametern optofluidischen Plattform

HIV-1 causes a chronic infection that affects more than 37 million people worldwide. People living with human immunodeficiency virus (HIV) experience ...

Open Source High Content Analysis Utilizing Automated Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) based readouts of fixed or live cells in multiwell plates. This provides a means to screen for cell signaling processes read out using intramolecular FRET biosensors or intermolecular FRET of protein interactions such as oligomerization or heterodimerization, which can be used to identify binding partners. We describe here the functionality of this automated multiwell plate FLIM instrumentation and present exemplar data from our studies of HIV Gag protein oligomerization and a time course of a FRET biosensor in live cells. A detailed description of the practical implementation is then provided with reference to a list of hardware components and a description of the open source data acquisition software written in &#181;Manager. The application of FLIMfit, an open source MATLAB-based client for the OMERO platform, to analyze arrays of multiwell plate FLIM data is also presented. The protocols for imaging fixed and live cells are outlined and a demonstration of an automated multiwell plate FLIM experiment using cells expressing fluorescent protein-based FRET constructs is presented. This is complemented by a walk-through of the data analysis for this specific FLIM FRET data set.

We present an open source high content analysis (HCA) instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) based readouts. Data acquisition for this openFLIM-HCA instrument is controlled by software written in &#181;Manager and data analysis is undertaken in FLIMfit.

Open Source High Content Analyse Unter Verwendung Automatische Fluorescence Lifetime Imaging Mikroskopie

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions ...

Ein High-Throughput Cre-Lox aktiviert virale Membran Fusion Assay Ermittlung Inhibitoren der HIV-1 Virus Membranfusion

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Zwei Methoden der Heterokaryon Formation zu entdecken HCV Restriktionsfaktoren

Einsatz von rekombinanten Fusionsproteinen in eine fluoreszierende Protease-Assay-Plattform und ihre In-Gel-Renaturierung

Rapid-Screening von HIV-Reverse-Transkriptase und Integrase-Inhibitoren

Einem Restriktionsenzym basierte Klonen Methode, um das Beurteilen

Methode zur Messung des Viral Fusion Kinetics auf der Single Particle Stufe

Konformationsänderungen Auswertung der HIV-1-Trimeric Hüllglycoproteine mit eine Handy-basierte ELISA-Test

Frühe das Eindringen des Virus-Assays für die Ermittlung und Bewertung von antiviralen Verbindungen

Hoher Durchsatz In Vitro Bewertung der Latenz Umkehrung Agenten auf HIV Transkription und Spleißen

Einzelzellcharakterisierung von Kalziumzufluss und HIV-1-Infektion mit einer multiparametern optofluidischen Plattform

Open Source High Content Analyse Unter Verwendung Automatische Fluorescence Lifetime Imaging Mikroskopie

Ein High-Throughput Cre-Lox aktiviert virale Membran Fusion Assay Ermittlung Inhibitoren der HIV-1 Virus Membranfusion

Zusammenfassung

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Zwei Methoden der Heterokaryon Formation zu entdecken HCV Restriktionsfaktoren

Einsatz von rekombinanten Fusionsproteinen in eine fluoreszierende Protease-Assay-Plattform und ihre In-Gel-Renaturierung

Rapid-Screening von HIV-Reverse-Transkriptase und Integrase-Inhibitoren

Einem Restriktionsenzym basierte Klonen Methode, um das Beurteilen

Methode zur Messung des Viral Fusion Kinetics auf der Single Particle Stufe

Konformationsänderungen Auswertung der HIV-1-Trimeric Hüllglycoproteine ​​mit eine Handy-basierte ELISA-Test

Frühe das Eindringen des Virus-Assays für die Ermittlung und Bewertung von antiviralen Verbindungen

Hoher Durchsatz In Vitro Bewertung der Latenz Umkehrung Agenten auf HIV Transkription und Spleißen

Einzelzellcharakterisierung von Kalziumzufluss und HIV-1-Infektion mit einer multiparametern optofluidischen Plattform

Open Source High Content Analyse Unter Verwendung Automatische Fluorescence Lifetime Imaging Mikroskopie

Konformationsänderungen Auswertung der HIV-1-Trimeric Hüllglycoproteine mit eine Handy-basierte ELISA-Test