This work was made possible by funding from the German Federal Ministry of Education and Research (BMBF, 1315883) as well as by the S&#228;chsische Aufbaubank (SAB) project 100116526 from a funding of the European Regional Development Fund (ERDF).

Bütün insan kan örnekleri sağlıklı gönüllülerden elde edildi ve uygulanan lökosit zenginleştirme protokolü Leipzig Üniversitesi Tıp Fakültesi Etik komisyonu yönergeleri takip eder. sıçan kan deneyler, hayvan bakımı ve kullanımı ile ilgili Alman kurallarına göre, sorumlu yerel etik kurulu (Landesdirektion Sachsen, Referat 24) tarafından onaylanmıştır. 1. Deney Düzeneği NOT: kan örneklerinden eritrositlerin tükenmesi için hipotonik parçalama prosedürü zaman kritik bir işlem olduğundan, önceden protokolün bu kısmı için gerekli tüm donanım (örneğin, tamponlar) hazırlar. <ol><li> hipotonik liziz için bir 15 ml santrifüj tüpüne ve kan numune başına takip eden aminofenil floresein (APF) boyama için bir 1.5 ml örnek tüp etiketleyin. <ol><li> Lökosit zenginleştirme, steril koşullar altında yapılacak ise, akışı altında Bu etiketlenmesikutu. </li></ol></li><li> örnek başına 12 ml fosfat tamponlu salin (PBS, 10 mM) hazırlanır. lökositler, steril koşullar altında izole ya da edilip edilmeyeceğine bağlı olarak, ilgili steril hazır çözelti ile ya da damıtılmış su içinde PBS çözünen tabletler yoluyla PBS hazırlar. pH değeri kontrol ve gerekirse, 0.1 M HCI ve NaOH çözümler küçük miktarlarda kullanılarak pH 7.4&#39;e ayarlanır. <ol><li> yaklaşık 16 numune için yeterli steril olmayan bir tampon çözeltisi elde etmek üzere distile su, 200 ml (Malzeme Tablo) PBS tablet içinde çözülür. Eğer arzu edilirse, steril süzme ile bu çözüm sterilize edin. </li></ol></li><li> Ca ile desteklenmiş 1 ml Hanks dengeli tuz çözeltisi (HBSS) 2+ numune başına hazırlayın. <ol><li> 100 ml HBSS tuzu (nihai hacim), iki kez damıtılmış su ile 970 mg eritin. Nihai hacme kadar doldurmadan önce, pH değerini kontrol ve pH 7.4 ayarlayın. Düşük tampon kapasitesi nedeniyle, bir her gün taze olarak bu tampon hazırlamak0.1 M HCI ve NaOH çözümler küçük miktarlarda kullanarak özel itina ile pH ayarlamasını yapmak d. Not: steril bir çözelti deneye bağlı olarak, kullanılabilir. Çözelti, steril filtrasyon ile sterilize edilir. </li></ol></li><li> İki tampon, etiket dışında ve bir tüp hazırlanması (örneğin, 50 mi santrifüj borusu) ya da bir şişe (örneğin, ölçüm kabı 250 mi) önceden hipotonik lizis prosedürü için iki kez damıtılmış su ile yıkanır. örnek başına 10 ml su hazırlayın. </li><li> Buz üzerinde gerçekleştirilir APF boyama (bölüm 3) için, ezilmiş buz ile bir kap hazırlanır. </li><li> boyama esnasında kullanılan çalışma çözümleri hızlı hazırlanmasını sağlamak için önceden APF hacimde hazırlayın (3.2 adım) ve donma ve APF çözümünün çözülme defalarca önlemek için. Not: AFP genellikle 5 mg / ml metil asetat (11.81 mM) stok çözeltisi olarak elde edilir. <ol><li> 0.5 ml tüpler içinde 10-100 ul alikotları dondurun. APF nihai boyama için10 uM boya konsantrasyonu (adım 3.8) kullanılmıştır. </li></ol></li></ol> Eritrositler 2. Hipotonik Lizis NOT: kirlenmesini önlemek için bir laminer akış tezgah altında (santrifüj adımları hariç) hipotonik lizis adımları uygulayın. Oda sıcaklığında tüm prosedürü uygulayın. hipotonik lizis zaman kritik bir süreç olduğu için, önceden su (2 mi) ve PBS (5 mi) eklenmesi için pipetler ayarlayın ve işleme başlamadan önce su ve PBS şişeler açın. Kullanımdan önce, oda sıcaklığında PBS çözeltisi ve saf su saklayın. <ol><li> Her kan örneği transferi uygun 15 ml santrifüj tüpüne 100 ul. Not: Deneylerde kan örnekleri, genellikle pıhtılaşmayı önlemek için, heparinin 10 U / ml ihtiva etmektedir. Ancak, numune malzemenin farklı kaynaklardan anti-koagülan doğası ve konsantrasyonu farklı olabilir. APF boyaması üzerindeki etkisi karş tarafından test edilmelidirdiğer türleri veya anti-koagülan konsantrasyonları ile takviye edilmiş, kan numuneleri elde edilen sonuçlara sonuçları ing. </li><li> 2 mL distile su ekleyin ve bir orta düzeyde ayarlanmış bir vorteks mikser kullanarak örnekleri karıştırın. daha sonra numune başına 5 ml PBS ilave ve vorteks karıştırıcı ile karıştırın, 60 saniye boyunca inkübe edin. Not: yaklaşık 5 numuneye kadar paralel hazırlanabilir. numune sipariş karşılaştırılabilir inkübasyon süreleri elde etmek için su ve PBS eklenmesi için aynı tutmak. </li><li> PBS ilave (aşama 2.2), oda sıcaklığında 6 dakika 450 x g santrifüj ile tüm örneklerde kalan sağlam hücreler pelet izotonik koşulların yenilenme sonra. </li><li> Bir tablo çöp kutusuna dökerek süpernatantı. santrifüj tersini tüp ve bir kağıt havlu üzerine açılış dokunarak kadar sıvı mümkün olduğunca kaldırın. Hücre topağı mümkün olduğunca kuru olduğundan emin olun. </li><li> (Adım 2.2) daha önce açıklandığı gibi hipotonik lizis işlemi tekrarlayın. NOT: Prensip olarak, bu hipotonik lizis prosedürü elde edilecek karışık bir lökosit fraksiyonunun saflığı bağlı olarak, birden fazla kez tekrar edilebilir (2.5 2.3 adım). İki parçalama elde karışık hücre fraksiyonu içinde eritrosit kalan payı adımlar sonra yaklaşık% 25&#39;tir. </li><li> Oda sıcaklığında 6 dakika 450 x g santrifüj ile geri kalan sağlam hücreler pelet. süpernatant (adım 2.4) sökün. pelet 500 ul HBSS ekleyin ve homojen bir çözelti elde edilene kadar yavaşça çözülür. buna göre etiketlenmiş 1.5 ml numune tüpüne her örnek aktarın. </li><li> Deneye bağlı olarak, doğrudan, (akış sitometrisi ile, örneğin,) elde edilen numunelerin, 25, 32 (tek hücre tiplerinin tanımlanması için) floresans etiketli antikorlar ile leke analizi (hücre aktivasyon deneyleri için) hücre uyaranlara 33 inkübe ya da buz ve Kullanım depolanan sonra. Çalışmanın amacı bağlı olarak, hemen üzerinde sonraki deneylerigranülosit yana karışık bir lökosit fraksiyonu yaklaşık 20 saat arasında oldukça kısa bir yarı ömre sahiptir. Not: Bu, aynı zamanda, aşağıda tarif edilen peroksidaz aktivitesi boyama için de geçerlidir. </li></ol> 3. Halojenleyici Peroksidaz Aktivitesi Boyama Not: kandan alınan hema peroksidazlar MPO ve EPO tarafından HOCl- ve HOBr&#39;nin üretim adlandırılan arasında hipohalus asitlerinin ile floresan oksidize edilir APF kullanılarak ölçülür. floresan işaretli antikorlar ile hücre etiketleme APF boyama ile bir arada gerçekleştirilen bu yüzden eğer floresan emisyon sinyali engelleyebilir florofor kaçının. <ol><li> buz üzerinde 4 ° C de APF boyama gerçekleştirin. </li><li> APF bir çalışma çözeltisi hazırlamak için boya uygun bir kısım Çözülme (örneğin, 10 ul, 11.81 mM) ve tam 1 ​​mM (örneğin, 10 ul 108.1 ul tampon ekleyin) için HBSS ile seyreltin. <ol><li> Her numune (500 ul hücre çözeltisi) için 5 u hazırlamaktarif APF hazır çözeltinin l. Bu duruma göre, 118.1 ul AFP çalışma çözeltisi (1 mM) 20 numune hazırlamak için verir APF (11,81 mm), bir adet 10 ul tablet kullanımı. Nedeniyle pipetleme sırasında kaybı hesaplanmış yaklaşık% 10 daha fazla APF çalışma çözeltisi hazırlayın. </li></ol></li><li> , APF boyama peroksidaz özgüllük kontrol hema peroksidaz inhibitörü, 4-aminobenzoik asit hidrazid (4-ABAH) 35 ile kontrol örneklerini hazırlamak için. <ol><li> Çözücü, 500 ul, 75.6 mg 4-ABAH seyreltilerek, dimetil sülfoksit içinde 4-ABAH (151.17 g / mol), (DMSO) içindeki bir 1 M stok çözelti hazırlayın. Dahası HBSS 4-Abah 1/10 sulandırmak. </li></ol></li><li> Sırasıyla, &quot;70 mM H2O 2&quot; ve &quot;7 mM H2O 2&quot;, bir H2O 2 çalışma çözeltisi etiketi iki 1.5 mi santrifüj tüpleri hazırlanması için. <ol><li> &quot;70 mM H 2 O 2&quot; etiketli tüp içinde, taze 10 ul sulandırmakyaklaşık 88 mM&#39;lik bir konsantrasyon elde etmek için distile su 990 ul kullanılarak H2O 2,% 30&#39;luk bir stok çözeltisi (8.8 mM). Buz üzerinde saklayın ve 4 saat içinde kullanın. NOT: H 2 O 2, tipik tedarikçiler tarafından% 30 stok çözelti olarak teslim edilir. 4 ° C&#39;de depolandığında, yaklaşık 3 yıl stabildir. Bozunmadan kaçınmak için damıtılmış su içinde H2O 2 dilüsyonları gerçekleştirin. H2O 2 seyreltmeler, 0.1 M NaOH çözeltisi içinde hazırlanabilir. </li><li> Tam H belirlenmesi için 2 O 2 konsantrasyonunun etiketlenmiş 1.5 ml&#39;lik bir tüp içinde damıtılmış su 900 ul bu solüsyondan 100 ul eklenmesiyle ilk H 2 O 2 stok solüsyonu (yaklaşık 88 mm), daha da 1-10 seyreltme hazırlanması &quot;7 mM H 2 O 2&quot;. </li><li> (UV-Vis fotospektrometre kullanarak yakın UV aralığında (örneğin, 200-300 nm) spektrumunu kaydetme ve 240 nm&#39;de absorbansı kullanın49; 240 = 34 M -1 cm -1) ikinci H 2 O 2 stok solüsyonu 34 gerçek H 2 O 2 konsantrasyonunu belirlemek için. Referans küvet sadece distile su içerdiğinden emin olun. Ölçüm kullanım kuvars küvetler UV aralığında bir spektrum kaydedilir olarak. </li><li> Bu sonuçtan, hem H 2 O 2 stok çözümleri tam konsantrasyonları hesaplayın. Damıtılmış su, uygun bir miktarının ilave edilmesi ile &quot;70 mM H2O 2&quot; örnek tüp tam olarak 70 mM ilk ihtiyat çözeltisinin yoğunluğu ayarlayın. buz üzerinde elde edilen çalışma çözüm saklayın ve bir saat içinde kullanın. </li></ol></li><li> 1 mM&#39;lik bir son konsantrasyon için, uygun örnekler 4-ABAH çalışma çözeltisi (100 mM) 5 ul ekle. APF ilave edilmeden önce bir inkübatör içerisinde 37 ° C&#39;de 15 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> Her bir 5 ul APF çalışma çözeltisi (1 mM) ilave500 ul numune 10 uM bir nihai boya konsantrasyonu elde edildi. (Orta ayara vorteks karıştırıcı kullanılarak, örneğin) yavaşça örnekleri karıştırın ve 37 ° C&#39;de 30 dakika inkübe edilir. </li><li> 700 uM&#39;lik bir son konsantrasyon için her 500 ul numune 5 ul H2O 2 çalışma çözeltisi (70 mM) eklenir. Yavaşça örnekleri karıştırın ve 37 ° C&#39;de 60 dakika boyunca inkübe. paralel olarak uygun kontrol ölçümleri gerçekleştirmek. NOT: Kontrol ölçümleri 700 uM H 2 O 2 hücreleri için toksik olmadığını gösterdi. Ayrıca önemli bir hücresel tepkiler gözlenmiştir. NOT: APF boyama, H2O 2 ilavesi olmaksızın, bilimsel soruya bağlı olarak ile gerçekleştirilebilir. H2O 2 eklenmesi hücreleri tarafından maksimum HOCl ve HOBr&#39;nin üretim saptanmasına izin verir ise, hidrojen peroksit yokluğunda sadece bazal klorlama MPO ve EPO aktivitesi belirlenir. TO ikinci bir anlamlı olarak daha yüksek floresan sinyal anlamına gelir. </li><li> hücreler pelet için, oda sıcaklığında 10 dakika karıştırıldı ve 400 x g&#39;de için örnekler santrifüj. İyice pelet bozmadan süpernatant kaldırmak ve hücreleri tekrar süspansiyon 250 ul HBSS ekleyin. NOT: Numuneler şimdi 25 flow sitometri aracılığı ile analiz için hazır. </li><li> ağartma önlemek için analize kadar karanlıkta örnekleri saklayın. 480-490 nm&#39;de eksitasyonla sonra yaklaşık 525 nm 37 ° floresan emisyonu tespit eder. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Nötrofiller, insan kanından en bol lökositlerdir olarak peroksidaz-pozitif hücrelerinin elde edilmesi çoğu zaman sadece bu hücreler üzerinde odaklanır ve yoğunluk dereceli santrifüj 38 diğer lökositlerin nötrofillerin bir şekilde ayrılmasını da içerir. Nötrofiller daha az bol sıçangil kan örneklerinde henüz olarak ikinci daha karmaşık yöntemleri için 39 40 kullanılmalıdır. Ayrıca her iki yöntemde de bağlı daha büyük kan hacim ihtiyacı için, numunelerden peroksidaz pozitif monositler kaldırılmasına neden ve (örneğin, 400 ul 41), küçük laboratuar hayvanlarından tekrarlanan kan örneği elde edilen mikro-numune için geçerli değildir 38,40. Periton eksüda fare nötrofillerin arıtma da dahası, kan türevi granülositler 38,40 vermezse, hayvanların kurban gerekir ve. Son zamanlarda fare bl gelen yüksek derecede saflaştırılmış granülosit elde etmek üzere yöntemler geliştirmişlerdirood (örneğin, antikorların uygulaması) çoğu zaman pahalı, karmaşık ve zaman alıcı ve 40,42,43 yine tek peroksidaz pozitif lökosit tipi arıtma odaklanmak. Böylece Burada sunulan yöntem, peroksidaz pozitif lökositlerin saflaştırılması için uygulanan diğer yöntemlere göre avantajları bir çift vardır. Bu az miktarda kan örnekleri dayanır de elde edilen hücreler dolaşımdaki durumu ifade eder. protokol için gereken küçük bir ilk örnek hacmi nedeniyle yöntemi nötrofillerin bolca türe özgü farklılıklara rağmen, insan ve insan-olmayan kan hem de geçerlidir. Aslında, hatta 50 ul kadar küçük kan hacmine başlangıç ​​açıklanan yöntemin kullanılması mümkün (veriler gösterilmemiştir). Yöntem için gereken küçük bir kan örneği, aynı zamanda, küçük laboratuar hayvanları ya da özel tıbbi uygulamalar (örneğin, yeni doğmuş teşhis) tekrarlanan kan çekilmesi için uygun yapar. t olarakO lökosit zenginleştirme Tüm peroksidaz-pozitif hücrelerin (nötrofiller, eozinofiller, monositler) elde karışık bir lökosit fraksiyonu dahil edilir ve ayrı akış sitometresi kullanılarak analiz edilebilir eritrositlerin tükenmesi dayanır. yöntem, hızlı, güvenilir ve çok sayıda bilimsel ortamlar için protokol uygun hale kimyasallar ve enstrümantasyon konusunda düşük gereksinimleri vardır. Nötrofiller kolay kullanılan tampon çözeltisi pH değerinin tam ayar tarif edilen yöntem sırasında bir kritik adım aktive olduğu için (PBS ve HBSS, adım 1.2 ve protokol bölümünün 1.3). Ayrıca damıtılmış su ile kan hücrelerinin inkübasyon süresi normosmotic koşulları (protokol bölümünün adım 2.2 bkz geri yüklemeden önce 60 saniye daha uzun olmalıdır. Eklenmeden önce hücre pelet (adım 2.4) çözücü (neredeyse) tamamen kaldırılması ikinci hipotonik liziz su tutkunu olarak başka kritik bir adımdırer artıkları hipotonik lizis prosedürünün etkinliğini azaltacaktır. Diğer önemli adım APF boyama esnasında H 2 O 2 uygulama anlamına gelir. uygulanan miktar sitotoksik olmamalı rağmen, hücre canlılık kontrol edilmelidir. Çalışmalarımızda sırasında tipik haliyle boya 5,5 geçerlidir &#39;, 6,6&#39;-tetrakloro-1,1&#39;, 3,3&#39;-tetraethylbenzimi-dazolylcarbocyanine iyodür (JC-1) erken apoptotik olayların saptanması için. Ayrıca, açıklanan basitleştirilmiş lökosit zenginleştirme yöntemi sınırlamaları bir çift vardır. Teknik, birkaç tür (insan, sıçan ve fare denenmiştir) kan örnekleri uygulanabilir olsa da, eritrositlerin lizinin ardından elde edilen lökosit kanda başlangıç ​​bolluk bağlıdır. Ikinci kesinlikle türler 39 arasında değişir ve incelenen pervane bireyin inflamatuar durumuna bağlıdır. Ayrıca, parçalama prosedürü, bir ila yapılabilir iseYüz örnekleri paralel ara madde santrifüj adımları yalnızca 30 numune paralel işlenebilir, kullanılan santrifüje bağlı olarak bir sınırlama oluşturmaktadır. APF kolayca SCN huzurunda HOCl ve HOBr&#39;nin tespit ederken Dahası, -, MPO ve EPO halojenleştirici aktivitesi ikinci yalancı halide etkiler. (- OSCN) bu suretle hypothiocyanite APF oksitleyebileceğini mümkün olan oluşturulur. Diğer bir sınırlama, MPO ve EPO tarafından HOCl- belirlenmesi ve HOBr&#39;nin-yapının üretimi için kullanılan APF boya özellikleri gelir. Boya Floresana oksitlenir gibi, boyama aynı aralıkta yansıtıcı spektrumlu floresan antikorlar ile birleştirilemez. Tabii ki APF türetilmiş floresan ve ek floresan sinyallerin sinyal arasındaki herhangi müdahaleler kontrol ve akış sitometresi içinde telafi edilmesi gerekir. Aksi takdirde, halojenleme peroksidaz aktivitesinin tespiti kapsamı değilseEritrosit tükenmesi yönteminin uygulanmasından sonra, diğer analitik metodlar yerine AFP kullanılabilir, çalışma. tarif edilen hipotonik lizis prosedürü yalnızca eritrositlerin kısmi tükenmesine ve lökosit olmakta gibi, yine de tek bir hücre analizi uygulanmalıdır izin olan yöntemler elde edilen karma hücre fraksiyonu mevcuttur. (Örneğin, Batı arsa analizi) hücrelerin erimesini içeren Yöntemleri güvenilir sonuçlar vermeyecektir. küçük başlangıç ​​numune hacmi gibi analitik yöntemler için bir engel olabilir. Hücreler tarafından lökosit MPO (EPO) soruşturma aktivitesini genellikle sadece genel oksidan üretimi ile ilgili yerine özellikle heme peroksidaz aktivitesini 44,45 değerlendirilmesi ele alınmaktadır. Üstelik çoğu zaman hiçbir girişimde halojenleme ve MPO ve EPO 46,47 peroksidaz aktivitesi arasında ayrım yapılır. Özellikle qu tarafından klorlama MPO aktivitesi ele Yöntemler,chlorotyrosine gibi HOCl türevli ürünler antifying okside aşırı ve / veya ürün metabolize algılamak ve böylece genellikle gerçek HOCl üretim 48 küçümsenmesi yol açmaz. Ayrıca bu yöntem, hem de, HOCl türevi 2-chloroethidium tespiti klorlama MPO aktivitesi spesifik tayini için Yeni boyalar ile ilgili bir çok yayın vardır, aynı zamanda zaman alıcıdır maliyetli analitik ekipmanı gerektirir ve hücreler 48-50 .Orada&#39;da erimesini içerir canlı hücrelerde 44,51,52 içinde. Ancak, bugüne kadar yalnızca APF ve ilgili bileşik, hidroksifenil floresein (HPF) ticari olarak temin edilebilen ve bu yüzden rutin araştırma 25,33 olarak kullanılmaktadır. Aslında, APF kullanarak Bu klorlama MPO aktivitesi, sadece izole edilmiş enzim 53 ile değil, aynı zamanda canlı hücreler 26,33 boyayı uygulayarak ölçülebilir edilemez gösterebilir. Böylece yukarıda belirtilen kan mikro-örneklerinden hızlı lökosit zenginleştirme birleştirerekn APF boyama Özellikle ve aynı anda tüm peroksidaz pozitif lökositlerin, örneğin, nötrofiller, monositler ve eozinofil 32 MPO ve EPO halojenleme aktivitesi yönelik uygun olan bir protokol geliştirilmiştir. Ayrıca yöntem, akış sitometrisi ve konfokal mikroskopi flüoresan içeren analitik yöntemler, geniş bir çeşitlilik sağlar hücre lisisi, gerektirmez. Ayrıca, bu peroksidaz aktivitesi boyama bilimsel göreve bağlı olarak, lökosit alt kısımların özel analiz sağlar hücre yüzeyi markerlerinin uygulanması ile birleştirilebilir. Ancak, uygulanan floresan etiketli antikorlar HOCl- ve HOBr&#39;nin türetilmiş APF oksidasyonu ölçmek için kullanılan flöresan bazlı floresan sinyali karışmaz olduğu göz önünde bulundurulmalıdır. Özetle bu yöntem immünolojik yeniden halojenleştirici peroksidaz aktivitesinin fizyolojik rolüne daha fazla ayrıntılı bilgi edinmek için yeni bir araç sağlayabilirolan levant kan türevi peroksidazlar MPO ve EPO, yine de 8,20,23 anlaşılamamıştır. Ayrıca romatoid artrit bir hayvan çalışmasında son zamanlarda bu protokol kronik inflamatuar hastalıklar (yayınlanmamış veri) yeni bir klinik belirteç olarak MPO türetilmiş HOCl üretiminin değerlendirilmesine neden olabileceğini görebiliyoruz.

Polimorfonükleer lökositler (PMN olarak da adlandırılır granülositler) ve monositler kan 1,2 olarak doğuştan gelen bağışıklık sisteminin önemli hücresel bileşenleri temsil eder. Patojenlere karşı ve kazanılmış bağışıklık sistemi aktivasyonu ve sistemik enflamatuar tepki 2-4 başlatılmasından birincil savunma katkıda bulunur. Oysa özellikle nötrofiller, granülosit en bol türü ve monositler de önemli ölçüde akut inflamatuar olayların 5 düzenlenmesi ve fesih katkıda bulunur. Bu nedenle, bu hücreler aynı zamanda römatoid artrit, 6,7 gibi kronik iltihaplı hastalıklarda önemli bir rol oynayabilir. Aslında, astım, kronik enflamasyonlu hava geçiş yolu hastalığı olarak, eozinofil bozulmuş apoptoz, kan 8&#39;de ikinci granülosit Çeşidi ile karakterize edilir. Oysa granülosit apoptoz ve makrofajlar tarafından onların hızlı çıkarma hücresel sonlandırma sırasında iki temel adımlardırinflamasyon 9-11. Adı bağışıklık hücreleri, iki yakın ilişkili enzimler, yani miyeloperoksidaz (MPO, nötrofiller ve monositler) ve eozinofil peroksidaz (EPO, eozinofiller) &#39;de 12,13 bulunabilir. Bu hem peroksidazlar klasik iki-elektronik ilgili hipo (sözde) ila (sözde) halidler bakterisid özellikleri 14-16 için bilinen halojen asitleri okside olarak humoral bağışıklık tepkisi ile ilişkilidir. Fizyolojik koşullar altında MPO esas olarak form hipokloröz asit (HOCI) ve hypothiocyanite (- OSCN) ikinci ve hipobromus asit (HOBr&#39;nin) EPO 17-19 oluşturduğu getirilmektedir. Yeni sonuçlar, bu (sözde) halojenasyon enzim aktivitesi aynı zamanda inflamatuar yanıtların düzenlenmesinde ve bağışıklık reaksiyonları 20,21 feshi katkıda bulunabileceğini düşündürmektedir. Aslında, MPO ve elde edilen ürünlerin tarafından HOCl üretimi T hücre tabanlı adaptif immün yanıtları 22-2 bastırmak gösterilmiştir4. Bu fizyolojik fonksiyonu MPO ve EPO katkısı kronik inflamatuar hastalıklarda doğuştan gelen bağışıklık sisteminden lökositlerin immünolojik rolüne daha fazla anlayışlar kazanmak için ve belirlemek için hızla bir sonraki özgü küçük kan örneklerinden lökosit zenginleştirmek için bir yöntem geliştirdi bu hücrelerde halojenleştirici peroksidaz etkinliğinin belirlenmesi. eritrosit tükenmesi için biz düşük malzeme maliyetleri hızlı bir lökosit zenginleşmeye yol açar damıtılmış su ile iki müteakip hipotonik lizis adımları içeren bir standart yöntem seçtiniz. Sonraki halojenleme MPO belirlenmesi ve EPO faaliyeti için HOCl- ve HOBr&#39;nin özel boya aminofenil floresein (APF) 25-27 kullanılmıştır. Spesifik olmayan peroksidaz boyama yöntemleri 28,29 uygulanması aksine olarak, bu yaklaşım, genellikle ciddi iltihaplanmaya karşı en bozulur halojenleme peroksidaz aktivitesi seçici algılama sağlar,amasyon 30,31.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="738">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">materials/equipment</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">15 ml centrifugation tubes</td>
			<td style="width:203px;">VWR/Corning</td>
			<td style="width:120px;">734-0451</td>
			<td style="width:203px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">1.5 ml sample tubes</td>
			<td style="width:203px;">VWR/Eppendorf</td>
			<td style="width:120px;">211-2130DE</td>
			<td style="width:203px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:213px;">Pipettes for volumes up to 5 ml</td>
			<td style="width:203px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:120px;">e.g. 3120000070</td>
			<td style="width:203px;">We are using Eppendorf Resarch plus pipettes with adjustable volumes in the range 1-10 &#181;l, 10-100&#181;l, 100-1000 &#181;l an 500-5000&#181;l</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">laminar flow bench</td>
			<td style="width:203px;">Thermo Electron Corperation</td>
			<td style="width:120px;">HeraSafe</td>
			<td style="width:203px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">Vortex mixer</td>
			<td style="width:203px;">Bender &#38; Hobein AG</td>
			<td style="width:120px;">Vortex Genie 2</td>
			<td style="width:203px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Tabletop centrifuge</td>
			<td style="width:203px;">Kendro Laboratory Products</td>
			<td style="width:120px;">Laborfuge 400R</td>
			<td style="width:203px;">The centrifuge should be able to be used at 450x g</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Small centrifuge</td>
			<td style="width:203px;">eppendorf</td>
			<td style="width:120px;">5415D</td>
			<td style="width:203px;">The centrifuge should be able to be used at 400x g</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Incubator</td>
			<td style="width:203px;">Heraeus</td>
			<td style="width:120px;">cytoperm 2</td>
			<td style="width:203px;">Settings: 37 &#176;C, 95% humidity, 5 % CO2 content</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;">UV-Vis spectrophotometer</td>
			<td style="width:203px;">Varian</td>
			<td style="width:120px;">Cary 50 bio</td>
			<td style="width:203px;">A spectrum between 200 and 300 nm has to be recorded. Thus quartz cuvettes have to be applied</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;">Flow cytometer</td>
			<td style="width:203px;">Becton, Dickinson</td>
			<td style="width:120px;">BD Facs Calibur</td>
			<td style="width:203px;">Any flow cytometer can be used which is equiped with a laser suitable for the excitation of fluorescein (e.g 488 nm argon laser)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name</td>
			<td style="width:203px;">Company</td>
			<td style="width:120px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:203px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">Chemicals</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:213px;">Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:203px;">amresco</td>
			<td style="width:120px;">K812</td>
			<td style="width:203px;">sterile solution, ready to use</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:213px;"></td>
			<td style="width:203px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">P4417</td>
			<td style="width:203px;">tablets for solving in 200 ml millipore water</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:213px;">Hanks balanced salt solution (HBSS) with Ca(2+)</td>
			<td style="width:203px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">H1387</td>
			<td style="width:203px;">970 mg/100 ml, carefully check and adjust the pH value to 7.4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:203px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:120px;">1.09057.1000</td>
			<td style="width:203px;">1M solution</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:213px;">Sodium hydroxide</td>
			<td style="width:203px;">Riedel-deHa&#235;n</td>
			<td style="width:120px;">30620</td>
			<td style="width:203px;">Solid pellets. For a 1M solution solve 4 g/100 ml Millipore water</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:213px;">Aminophenyl fluorescein</td>
			<td style="width:203px;">Cayman</td>
			<td style="width:120px;">10157</td>
			<td style="width:203px;">5 mg/ml solution (11.81 mM) in methyl acetate, aliquotes of e.g. 100 &#181;l should be prepared and stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="168">
			<td height="168" style="height:168px;width:213px;">Hydrogen peroxide</td>
			<td style="width:203px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">H1009</td>
			<td style="width:203px;">This 30% stock solution corresponds to a concentration of about 8.8 M. Further dilutions have to be freshly prepared in distilled water immediately prior to use and quantified by absorbance measurements</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:213px;">4-aminobenzoic acid hydrazide (4-ABAH)</td>
			<td style="width:203px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">A41909</td>
			<td style="width:203px;">A first stock solution of 1 M should be prepared in DMSO a second one of 100 mM by 1:10 dilution in HBSS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">DMSO</td>
			<td style="width:203px;">VWR chemicals</td>
			<td style="width:120px;">23500.26</td>
			<td style="width:203px;">-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fast and specific assessment of the halogenating peroxidase activity in leukocyte-enriched blood samples

Bu yazıda küçük tam kan örneklerinden lökositlerin hızlı ve standardize zenginleştirme için bir protokol tanımlanmıştır. Bu prosedür, eritrositlerin hipotonik liziz dayalıdır ve insan olmayan kökenli kan hem de insan örnekleri uygulanabilir. yaklaşık 50 ile 100 ul az ilk örnek hacmi küçük laboratuar hayvanlarından tekrarlanan kan örneğinin, bu yöntem uygulanabilir hale getirir. Ayrıca, lökosit zenginleştirme birden laboratuvar ortamlarında bu yöntem uygulanabilir hale dakika içinde ve kimyasallar ve enstrümantasyon konusunda düşük malzeme çabaları ile elde edilir. Lökositlerin standardize saflaştırma son derece seçici bir hema peroksidaz halojenleştirici peroksidaz aktivitesinin değerlendirilmesi için boyama yöntemi, miyeloperoksidaz (MPO), eozinofil peroksidaz (EPO) örneğin, hipokloröz ve hipobromus asitinin (HOCI ve HOBr) oluşumu ile birleştirilir. MPO güçlü neut&#39;ait olarak ifade edilirkenrophils, insan kanında olarak monositlerde en bol immün hücre tipi, ilgili enzim EPO özel eozinofil olarak ifade edilir. Bu enzimlerin halojenleme aktivitesi neredeyse HOCl- ve HOBr&#39;nin özgü boya aminofenil fluoresein (APF) ve primer peroksidaz substrat hidrojen peroksit kullanılarak giderilir. daha sonra akım sitometrisi analizi üzerine tüm peroksidaz-pozitif hücrelerin (nötrofiller, monositler, eozinofil) ayırt edilebilir ve halojenleme peroksidaz aktivitesi belirlenebilir. APF lekeli hücre yüzeyi markerlerinin uygulama ile birlikte olabilir için, bu protokol, spesifik olarak, lökosit alt parçacığı gidermek için uzatılabilir. yöntem, insan ve kemirgen lökositleri hem HOCl ve HOBr&#39;nin üretimi tespit etmek için de geçerlidir. kronik inflamatuvar hastalıklarda bu enzimatik ürünlerin yaygın ve çeşitli şekillerde tartışılan immünolojik rol göz önüne alındığında, bu protokol daha iyi anlaşılmasına katkıda bulunabilirlökosit kaynaklı heme peroksidaz immünolojik alaka.

Daha önce belirtildiği gibi, yukarıda tarif edilen yöntem, insan ve insan-olmayan madde 32 her ikisi de uygulanabilir olduğu ortaya çıktı. astım semptomları olan fareler için gösterilen üstelik olarak APF boyama sistemik pro-enflamatuar durum farklılıkları tespit etmek için uygun bir araç olabilir. Bu nedenle bu protokol kullanılır Takip eden bir çalışmada, art arda, pristan-kaynaklı artrit (PIA) dişi Koyu Agouti sıçanlarda MPO (EPO) ve halojenasyon etkinliğini değerlendirmek için. Lökosit zenginleştirme ve deney sırasında gerçekleştirilen boyama temsili bir örneği Şekil 1 &#39;de gösterilmiştir. 200 ul tam kan anestezi altında hayvanın retrobulber venöz pleksus elde edilir ve heparinize edilmiş. Eritrosit tükenmesi ve daha sonraki bir APF boyama 100 ul numune hacmi ile gerçekleştirildi. Daha sonra örnek bir akış sitometrisi ile analiz edilmiştir. (Şekil 1A) karşı hücre boyutu, örnek elde edilmiştir eritrosit güçlü bir tükenmesi çizilmesi ile gösterildiği gibi. Ayrıca, farklı lökosit tipleri floresan etiketli hücre yüzeyi işaretçileri uygulanarak tespit edilmiştir ki, pek belirgin edildi (gösterilmemiştir). Olayların yaklaşık% 48 CD16-pozitif nötrofil olarak tespit edildi ise kısaca eritrosit (CD235a-pozitif) / hücre enkaz bölgesi sadece olayların% 22 olarak gerçekleşmiştir. Ayrıca olayların% 3 her CCR3-pozitif eozinofiller ve CD14-pozitif monositler olarak tespit edildi ve olayların yaklaşık% 19&#39;u sırasıyla CD5 / CD19-pozitif B ve T lenfositleri sorumluydu. Monositler ve eozinofiller ılımlı APF oksidasyona açtı ve nötrofiller ch altında güçlü bir peroksidaz-pozitif iken APF türetilmiş floresan yoğunluğu dağılımı (Şekil 1B) açık bir şekilde peroksidaz-negatif eritrositler ve lenfositlerin ayrımı izinosen deney koşulları. Monositler 20 enzim konsantrasyonu ile karşılaştırıldığında Bu sonuçlar, ikinci hücre MPO yüksek bolluk ile uyum içindedir. eozinofillerin, nispeten zayıf bir yanıt yok bromür hobr EPO türevi oluşmasını teşvik etmiş olabilir, ilave edildi gerçeğiyle açıklanabilir. İzole eozinofiller üzerinde ön çalışmalar şaşırtıcı bu hücreler tarafından APF oksidasyonu üzerindeki harici eklenen bromür büyük bir etkisi yoktu. Yine, Br, az miktarda katılmasıyla açıklanabilir gözlenmiştir eozinofillerin APF oksidasyonu - (PBS ve HBSS) kullanılan tampon çözeltiler ile. Alternatif olarak EPO da (fagolizozomları örneğin,), en azından, asidik koşullar altında HOCl az miktarda üretebilir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54484/54484fig1.jpg" /> Şekil 1: Lökosit zenginleştirme ve APF-derivedBir sıçandan kan mikro-numune içinde D floresan. 200 ul tam kan bir miktar bir dişi Koyu Agouti sıçan retrobulbar venöz pleksus elde edilmiştir. karma hücre fraksiyonu boyama 100 ul kan tarif edilen hemoliz prosedürünün uygulanması ve daha sonraki bir APF sonra akış sitometrisi ile analiz edilmiştir. FSC / SSc Test alanı (A) ile gösterildiği gibi eritrositler, numune tükenmiş ve farklı lökosit tipleri kolaylıkla ayırt olabilir. APF türetilmiş floresan yoğunluğu (B) dağılımı açıkça gösterdi heme peroksidaz-negatif orta (eozinofiller ve monositler) ya da kuvvetli (nötrofiller) halojenasyon peroksidaz aktivitesi ile hücreleri (eritrositler ve lenfositler) yanı sıra lökositler. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54484/54484fig1large.jpg" target="_blank">Bir görmek için buraya tıklayınız Bu rakamın daha büyük bir versiyonu.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Fast and Specific Assessment of the Halogenating Peroxidase Activity in Leukocyte-enriched Blood Samples at JoVE.com

Fast and Specific Assessment of the Halogenating Peroxidase Activity in Leukocyte-enriched Blood Samples

This protocol describes the quick enrichment of leukocytes from small blood samples for a subsequent specific determination of the halogenating peroxidase activity within the cells. The method can be applied to human and non-human material and may contribute to the evaluation of new inflammatory markers.

Lökosit zenginleştirilmiş Kan Örneklerinde Halojenleyici Peroksidaz Faaliyet Hızlı ve Özgül Değerlendirme

In this paper a protocol for the quick and standardized enrichment of leukocytes from small whole blood samples is described. This procedure is based on ...

fast-specific-assessment-halogenating-peroxidase-activity-leukocyte

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.2K Görüntüleme.  University of Leipzig. This protocol describes the quick enrichment of leukocytes from small blood samples for a subsequent specific determination of the halogenating peroxidase activity within the cells. The method can be applied to human and non-human material and may contribute to the evaluation of new inflammatory markers.

Video: Fast and Specific Assessment of the Halogenating Peroxidase Activity in Leukocyte-enriched Blood Samples

Depletion of Specific Cell Populations by Complement Depletion

The purification of immune cell populations is often required in order to study their unique functions. In particular, molecular approaches such as real-time PCR and microarray analysis require the isolation of cell populations with high purity. Commonly used purification strategies include fluorescent activated cell sorting (FACS), magnetic bead separation and complement depletion. Of the three strategies, complement depletion offers the advantages of being fast, inexpensive, gentle on the cells and a high cell yield. The complement system is composed of a large number of plasma proteins that when activated initiate a proteolytic cascade culminating in the formation of a membrane-attack complex that forms a pore on a cell surface resulting in cell death1. The classical pathway is activated by IgM and IgG antibodies and was first described as a mechanism for killing bacteria. With the generation of monoclonal antibodies (mAb), the complement cascade can be used to lyse any cell population in an antigen-specific manner. Depletion of cells by the complement cascade is achieved by the addition of complement fixing antigen-specific antibodies and rabbit complement to the starting cell population. The cells are incubated for one hour at 37&deg;C and the lysed cells are subsequently removed by two rounds of washing. MAb with a high efficiency for complement fixation typically deplete 95-100% of the targeted cell population. Depending on the purification strategy for the targeted cell population, complement depletion can be used for cell purification or for the enrichment of cell populations that then can be further purified by a subsequent method.

To effectively study the function of immune cell populations their purification is often required. Complement depletion is a fast and inexpensive technique for the isolation of immune cell populations with high purity.

Kompleman tükenmesi Özel Hücre Populasyonlarının tükenmesi

The purification of immune cell populations is often required in order to study their unique functions.  In particular, molecular approaches such as ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Experimental and clinical studies often require highly purified cell populations.  FACS is a technique of choice to purify cell populations of known phenotype.  Other bulk methods of purification include panning, complement depletion and magnetic bead separation.  However, FACS has several advantages over other available methods.  FACS is the preferred method when very high purity of the desired population is required, when the target cell population expresses a very low level of the identifying marker or when cell populations require separation based on differential marker density.  In addition, FACS is the only available purification technique to isolate cells based on internal staining or intracellular protein expression, such as a genetically modified fluorescent protein marker.  FACS allows the purification of individual cells based on size, granularity and fluorescence.  In order to purify cells of interest, they are first stained with fluorescently-tagged monoclonal antibodies (mAb), which recognize specific surface markers on the desired cell population (1).  Negative selection of unstained cells is also possible.  FACS purification requires a flow cytometer with sorting capacity and the appropriate software.  For FACS, cells in suspension are passed as a stream in droplets with each containing a single cell in front of a laser.  The fluorescence detection system detects cells of interest based on predetermined fluorescent parameters of the cells.  The instrument applies a charge to the droplet containing a cell of interest and an electrostatic deflection system facilitates collection of the charged droplets into appropriate collection tubes (2).  The success of staining and thereby sorting depends largely on the selection of the identifying markers and the choice of mAb.  Sorting parameters can be adjusted depending on the requirement of purity and yield.  Although FACS requires specialized equipment and personnel training, it is the method of choice for isolation of highly purified cell populations.

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

For many scientific studies requiring a biological and chemical analysis of cell populations the cells must be in a high state of purity. Fluorescence activated cell sorting (FACS) is a superior method in which to obtain pure cell populations.

Floresan Aktive Hücre Ayırma (FACS) Özgül Hücre Nüfus Arıtma

Experimental and clinical studies often require highly purified cell populations.  FACS is a technique of choice to purify cell populations of known ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

Bakteriyel Yapışma Çalışma Kesme Stres Tanıtımı

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Determining the Phagocytic Activity of Clinical Antibody Samples

Antibody-driven phagocytosis is induced via the engagement of Fc receptors on professional phagocytes, and can contribute to both clearance as well as pathology of disease. While the properties of the variable domains of antibodies have long been considered critical to in vivo function, the ability of antibodies to recruit innate immune cells via their Fc domains has become increasingly appreciated as a major factor in their efficacy, both in the setting of recombinant monoclonal antibody therapy, as well as in the course of natural infection or vaccination1-3.
Importantly, despite its nomenclature as a constant domain, the antibody Fc domain does not have constant function, and is strongly modulated by IgG subclass (IgG1-4) and glycosylation at Asparagine 2974-6. Thus, this method to study functional differences of antigen-specific antibodies in clinical samples will facilitate correlation of the phagocytic potential of antibodies to disease state, susceptibility to infection, progression, or clinical outcome.
Furthermore, this effector function is particularly important in light of the documented ability of antibodies to enhance infection by providing pathogens access into host cells via Fc receptor-driven phagocytosis7. Additionally, there is some evidence that phagocytic uptake of immune complexes can impact the Th1/Th2 polarization of the immune response8.
Here, we describe an assay designed to detect differences in antibody-induced phagocytosis, which may be caused by differential IgG subclass, glycan structure at Asn297, as well as the ability to form immune complexes of antigen-specific antibodies in a high-throughput fashion. To this end, 1 &mu;m fluorescent beads are coated with antigen, then incubated with clinical antibody samples, generating fluorescent antigen specific immune complexes. These antibody-opsonized beads are then incubated with a monocytic cell line expressing multiple Fc&gamma;Rs, including both inhibitory and activating. Assay output can include phagocytic activity, cytokine secretion, and patterns of Fc&gamma;Rs usage, and are determined in a standardized manner, making this a highly useful system for parsing differences in this antibody-dependent effector function in both infection and vaccine-mediated protection9.

We present a high-throughput flow cytometric assay to determine the phagocytic activity of antigen-specific antibodies from clinical samples, utilizing fluorescent antigen-coated beads and a monocytic cell line expressing multiple Fc receptors&#x2014;providing receptor usage and phagocytic activity determinations in a standardized and reproducible fashion for any antigen of interest.

Klinik Antikor Örnekleri fagositik Aktivitesi Belirlenmesi

Antibody-driven phagocytosis is induced via the engagement of Fc receptors on professional phagocytes, and can contribute to both clearance as well as ...

Quantitative Imaging of Lineage-specific Toll-like Receptor-mediated Signaling in Monocytes and Dendritic Cells from Small Samples of Human Blood

Individual variations in immune status determine responses to infection and contribute to disease severity and outcome. Aging is associated with an increased susceptibility to viral and bacterial infections and decreased responsiveness to vaccines with a well-documented decline in humoral as well as cell-mediated immune responses1,2. We have recently assessed the effects of aging on Toll-like receptors (TLRs), key components of the innate immune system that detect microbial infection and trigger antimicrobial host defense responses3. In a large cohort of healthy human donors, we showed that peripheral blood monocytes from the elderly have decreased expression and function of certain TLRs4 and similar reduced TLR levels and signaling responses in dendritic cells (DCs), antigen-presenting cells that are pivotal in the linkage between innate and adaptive immunity5. We have shown dysregulation of TLR3 in macrophages and lower production of IFN by DCs from elderly donors in response to infection with West Nile virus6,7. 
Paramount to our understanding of immunosenescence and to therapeutic intervention is a detailed understanding of specific cell types responding and the mechanism(s) of signal transduction. Traditional studies of immune responses through imaging of primary cells and surveying cell markers by FACS or immunoblot have advanced our understanding significantly, however, these studies are generally limited technically by the small sample volume available from patients and the inability to conduct complex laboratory techniques on multiple human samples. ImageStream combines quantitative flow cytometry with simultaneous high-resolution digital imaging and thus facilitates investigation in multiple cell populations contemporaneously for an efficient capture of patient susceptibility. Here we demonstrate the use of ImageStream in DCs to assess TLR7/8 activation-mediated increases in phosphorylation and nuclear translocation of a key transcription factor, NF-&kappa;B, which initiates transcription of numerous genes that are critical for immune responses8. Using this technology, we have also recently demonstrated a previously unrecognized alteration of TLR5 signaling and the NF-&kappa;B pathway in monocytes from older donors that may contribute to altered immune responsiveness in aging9.

We describe use of ImageStream technology (<a href="http://www.amnis.com/" target="_blank">www.amnis.com</a>), which combines quantitative flow cytometry with simultaneous high-resolution digital imaging, to quantify cellular mechanisms of primary immune cells from well-defined patient cohorts. Our studies provide a blueprint for translational investigations to quantify lineage specific cellular responses in small samples from subject cohorts.

Monositler ve İnsan Kan Küçük Örneklerden Dendritik Hücrelerde Lineage özgü Toll-like reseptör-aracılı Sinyali Kantitatif Görüntüleme

Individual variations in immune status determine responses to infection and contribute to disease severity and outcome.  Aging is associated with an ...

Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide antigens presented by MHC (human ortholog HLA) molecules through the T cell receptor (TCR) in a highly sensitive and specific manner. While the primary function of T cells is to mediate protective immune responses to foreign antigens presented by self-MHC, T cells respond robustly to antigenic differences in allogeneic tissues. T cell responses to alloantigens can be described as either direct or indirect alloreactivity. In alloreactivity, the T cell responds through highly specific recognition of both the presented peptide and the MHC molecule. The robust oligoclonal response of T cells to allogeneic stimulation reflects the large number of potentially stimulatory alloantigens present in allogeneic tissues. While the breadth of alloreactive T cell responses is an important factor in initiating and mediating the pathology associated with biologically-relevant alloreactive responses such as graft versus host disease and allograft rejection, it can preclude analysis of T cell responses to allogeneic ligands. To this end, this protocol describes a method for generating alloreactive T cells from naive human peripheral blood leukocytes (PBL) that respond to known peptide-MHC (pMHC) alloantigens. The protocol applies pMHC multimer labeling, magnetic bead enrichment and flow cytometry to single cell in vitro culture methods for the generation of alloantigen-specific T cell clones. This enables studies of the biochemistry and function of T cells responding to allogeneic stimulation.

This article describes a method for the generation and propagation of human T cell clones that specifically respond to a defined alloantigen. This protocol can be adapted for cloning human T cells specific for a variety of peptide-MHC ligands.

Periferik Kan İnsan alloantijen-özgü T hücrelerinin üretilmesi

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide ...

Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in diameter. In addition to a characterization of forward and sideward scatter properties, it enables the use of fluorescent labeled markers like antibodies to detect respective structures. Using indirect antibody staining, flow cytometry is employed here to quantify birch pollen allergen (precisely Bet v 1)-loaded particles of 0.5 to 10 &#181;m in diameter in inhalable particulate matter (PM10, particle size &#8804;10 &#181;m in diameter). PM10 particles may act as carriers of adsorbed allergens possibly transporting them to the lower respiratory tract, where they could trigger allergic reactions.
So far the allergen content of PM10 has been studied by means of enzyme linked immunosorbent assays (ELISAs) and scanning electron microscopy. ELISA measures the dissolved and not the particle-bound allergen. Compared to scanning electron microscopy, which can visualize allergen-loaded particles, flow cytometry may additionally quantify them. As allergen content of ambient air can deviate from birch pollen count, allergic symptoms might perhaps correlate better with allergen exposure than with pollen count. In conjunction with clinical data, the presented method offers the opportunity to test in future experiments whether allergic reactions to birch pollen antigens are associated with the Bet v 1 allergen content of PM10 particles &#62;0.5 &#181;m.

Here, we present a protocol to quantify allergen-loaded particles by flow cytometry. Ambient particulate matter particles may act as carriers of adsorbed allergens. We show here that flow cytometry, a method widely used to characterize suspended solids &#62;0.5 &#181;m in diameter, can be used to measure these allergen-loaded particles.

PM10 parçacık bağlı Bet v 1 Allergen Akışı Sitometrik Analizi

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and reproducibility of this assay can be considered unstable, either because of user&#39;s errors or because of the sensitivity of NK cells to experimental manipulation. To eliminate these issues, a workflow that reduces them to a minimum was established and is presented here. To illustrate, we obtained blood samples, at various time points, from runners (n = 4) that were submitted to an intense bout of exercise. First, NK cells are simultaneously identified and isolated through CD56 tagging and magnetic-based sorting, directly from whole blood and from as little as one milliliter. The sorted NK cells are removed of any reagent or capping antibodies. They can be counted in order to establish an accurate NK cell count per milliliter of blood. Secondly, the sorted NK cells (effectors cells or E) can be mixed with 3,3&#39;-Diotadecyloxacarbocyanine Perchlorate (DiO) tagged K562 cells (target cells or T) at an assay-optimal 1:5 T:E ratio, and analyzed using an imaging flow-cytometer that allows for the visualization of each event and the elimination of any false positive or false negatives (such as doublets or effector cells). This workflow can be completed in about 4 h, and allows for very stable results even when working with human samples. When available, research teams can test several experimental interventions in human subjects, and compare measurements across several time points without compromising the data&#39;s integrity.

This work describes an advanced workflow for the accurate and fast determination of NK (Natural Killer) cell count and NK cell cytotoxicity in human blood samples.

İnsan Tüm Kan Natural Killer Hücre Parçalayıcı Faaliyet Akışı Sitometrik Analizi

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Dextran Enhances the Lentiviral Transduction Efficiency of Murine and Human Primary NK Cells

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining the role of the gene of interest in the development, differentiation, and function of NK cells. Recent advances related to chimeric antigen receptors (CARs) in cancer immunotherapy accentuate the need for an efficient method to deliver exogenous genes to effector lymphocytes. The efficiencies of lentiviral-mediated gene transductions into primary human or mouse NK cells remain significantly low, which is a major limiting factor. Recent advances using cationic polymers, such as polybrene, show an improved gene transduction efficiency in T cells. However, these products failed to improve the transduction efficiencies of NK cells. This work shows that dextran, a branched glucan polysaccharide, significantly improves the transduction efficiency of human and mouse primary NK cells. This highly reproducible transduction methodology provides a competent tool for transducing human primary NK cells, which can vastly improve clinical gene delivery applications and thus NK cell-based cancer immunotherapy.

The goal of this study was to formulate technologies that allow for successful gene transduction in primary natural killer (NK) cells. The dextran-mediated lentiviral transduction of human or mouse primary NK cells results in higher gene expression efficiencies. This method of gene transduction will vastly improve NK cell genetic manipulation.

Dextran fare ve insan birincil NK hücreleri Lentiviral iletim verimliliğini artırır

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining ...

Magnetic Stirrer Method for the Detection of Trichinella Larvae in Muscle Samples

Trichinellosis is a debilitating disease in humans and is caused by the consumption of raw or undercooked meat of animals infected with the nematode larvae of the genus Trichinella. The most important sources of human infections worldwide are game meat and pork or pork products. In many countries, the prevention of human trichinellosis is based on the identification of infected animals by means of the artificial digestion of muscle samples from susceptible animal carcasses.
There are several methods based on the digestion of meat but the magnetic stirrer method is considered the gold standard. This method allows the detection of Trichinella larvae by microscopy after the enzymatic digestion of muscle samples and subsequent filtration and sedimentation steps. Although this method does not require special and expensive equipment, internal controls cannot be used. Therefore, stringent quality management should be applied throughout the test. The aim of the present work is to provide detailed handling instructions and critical control points of the method to analysts, based on the experience of the European Union Reference Laboratory for Parasites and the National Reference Laboratory of Germany for Trichinella.

Magnetic Stirrer Method for the Detection of Trichinella Larvae in Muscle Samples

The prevention of human trichinellosis in many countries worldwide is based on the laboratory examination of muscle samples from susceptible animals by methods of digestion, of which the magnetic stirrer method is considered the gold standard.

Tespiti için Manyetik Karıştırıcı Yöntemi<em&gt; Trichinella</emKas Samples&gt; Larva

Trichinellosis is a debilitating disease in humans and is caused by the consumption of raw or undercooked meat of animals infected with the nematode ...