Araştırma Ulusal Enstitüsü alerji ve enfeksiyon hastalıkları (NIH-NIAID) ödülü R15AI079685 tarafından desteklenmiştir.

1. çözüm hazırlık
Not: E. coli spheroplasts ve d. megaterium önceki, sırasıyla üretmek için 1.1-1.9 ve 1.8-1,11 adımlarda açıklanan çözümler hazırlamak.
<ol><li>1 hazırlamak M Tris-Cl, 10.34 g Tris HCl ve Tris OH 4,17 g 50 ml dH2O 125 mL şişe içinde eriterek tarafından pH 7.8. 0.2 µm membran ile 25 mm şırınga filtre ile filtre uygulayarak sterilize ve konik tüp oda sıcaklığında saklayın.</li>
	<li>Çözüm bir (20 mM MgCl2, 0,7 M sukroz, 10 mM Tris-Cl, pH 7.8) 0,10 g MgCl2 (95.2 g/mol) ve 25 mL dH2O 125 mL şişe (342.3 g/mol) 11.98 g sükroz çözülerek hazırlayın. 500 µL eklemek 1 M Tris-Cl (pH 7.8) ve 50 ml ses seviyesini. 0.2 µm membran ile 25 mm şırınga filtre ile filtre uygulayarak sterilize ve konik tüp oda sıcaklığında saklayın.</li>
	<li>Çözüm B (10 mM MgCl2, 0, 8 M Sükroz, 10 mM Tris-Cl, pH 7.8) 0,05 g MgCl2 (95.2 g/mol) ve 25 mL dH2O 125 mL şişe (342.3 g/mol) 13.69 g sükroz çözülerek hazırlayın. 500 µL eklemek 1 M Tris-Cl (pH 7.8) ve 50 ml ses seviyesini. 0.2 µm membran ile 25 mm şırınga filtre ile filtre uygulayarak sterilize ve konik tüp oda sıcaklığında saklayın.</li>
	<li>0, 8 M Sükroz 50 mL dH2O 125 mL şişe (342.3 g/mol) 13.69 g sükroz çözülerek hazırlayın. 0.2 µm membran ile 25 mm şırınga filtre ile filtre uygulayarak sterilize ve konik tüp oda sıcaklığında saklayın.</li>
	<li>5 mg/mL deoksiribonükleaz hazırlamak ben (DNaz ben) 0,015 g DNaz eriterek tarafından ben dH2O 50 mL şişe içinde 3 ml. 0.2 µm membran ile 25 mm şırınga filtre ile filtre uygulayarak sterilize. Microfuge boru ve mağaza-20 ° C'de içine aliquot çözüm</li>
	<li>0,125 M ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) hazırlamak, 0.698 g EDTA disodyum eriterek tarafından pH 8.0 içine 15 mL dH2O'bir 125 mL şişe (372.2 g/mol) kurutmak. 0.2 µm membran ile 25 mm şırınga filtre ile filtre uygulayarak sterilize ve konik tüp oda sıcaklığında saklayın.</li>
	<li>600 µg/mL sefaleksin 50 ml dH2O'bir 125 mL şişe (365.404 g/mol) sefaleksin hidrat 0,03 g çözülerek hazırlayın. 0.2 µm membran ile 25 mm şırınga filtre ile filtre uygulayarak sterilize ve konik tüp 4 ° C'de depolayın</li>
	<li>5 mg/mL lizozim 0,015 g lizozim dH2O 50 mL şişe içinde 3 ml çözülerek hazırlayın. 0.2 µm membran ile 25 mm şırınga filtre ile filtre uygulayarak sterilize. Microfuge boru ve mağaza-20 ° C'de içine aliquot çözüm</li>
	<li>%3 w/v Trypticase soya suyu (TSB) TSB dH2O 2 lt şişeye 1 litre içinde 30 g çözülerek hazırlayın. Aliquot çözüm 25 mL veya 100 mL sırasıyla E. coli spheroplasts veya B. megaterium önceki, hazırlanmasında kullanılacak TSB içeren şişeler içine. Sıvı orta sterilize etmek için basınçlı kap şişeler. Steril TSB-ebilmek var olmak stok oda sıcaklığında ya da 4 ° C.</li>
	<li>Çözüm C (1 M Sükroz, 0,04 M maleat, 0,04 M MgCl2, pH 6,5) 34.23 g sükroz (342.3 g/mol), 0,46 g Maleik asit (116.07 g/mol) ve 0.38 g MgCl2 (95.21 g/mol) dH2O'bir 250 mL şişe 100 ml çözülerek hazırlayın. PH 6,5 için ayarlayın. 0.2 µm membran ile 25 mm şırınga filtre ile filtre uygulayarak sterilize ve konik tüp oda sıcaklığında saklayın.</li>
	<li>200 mL protoplast orta 100 mL % 3 w/v TSB ve 100 mL solüsyon C 1 L cam şişede karıştırarak hazırlayın. Otoklav çözüm sterilize ve oda sıcaklığında saklamak için.</li>
</ol>2. gecede kültür hazırlanması
Not: Bölüm 2-4 uygun steril teknikleri kullanarak gerçekleştirin. İstenirse, bakteriyel bir yük bir plazmid potansiyel kirlilik azaltmak antibiyotik direnci için içerir. Bir tür antibiyotik direnci ile kullanıyorsanız, gerekli antibiyotikler adımları 2.1, 3.1-3.2 ve 4.1-4.4 ekleyin.
<ol><li>Bir gecede kültür steril pipet ucu kullanarak ve 2-3 mL % 3 w/v TSB içeren 14 mL kültür tüp içine yerleştirerek bir koloni bakterilerin seçerek hazırlayın. 37 ° C'de 16 – 21 h için sallayarak süre kuluçkaya.</li>
</ol>3. gram-negatif E. coli Spheroplasts hazırlanması
<ol><li>250 mL şişeye gecede kültür 1: %100 3 w/v TSB 25 mL hacminde sulandırmak ve 37 ° C'de bakteriyel çözüm çözüm 0,5-0,8 600 optik bir yoğunluk ulaşmıştır kadar yaklaşık 2,5 h sallayarak süre kuluçkaya nm. Bir spektrofotometre kullanarak optik yoğunluk ölçer.</li>
	<li>Bu kültür 1:10 % 3 w/v TSB 30 ml 250 mL şişeye sulandırmak ve 37 ° C'de yaklaşık tek hücre filamentler üretmek için 60 µg/mL Sefaleksin (347.4 g/mol) huzurunda 2,5 h için sallayarak süre kuluçkaya uzunluğu 50-150 µm , gözlemlenebilir ışık mikroskobu (Şekil 1B) kullanarak 1000 X büyütme altında olan.</li>
	<li>Bakteriyel çözüm 1.500 x g, 4 dk. Decant 4 ° C de centrifuging tarafından filamentler hasat ve Pelet rezerve etme süpernatant, atın.</li>
	<li>Filamentler yavaşça 0,8 M sukroz, Pelet bozmamaya dikkat edin 1 mL ekleyerek yıkayın. 1 dk. için kuluçkaya ve sonra süpernatant Pelet bozmadan atın.</li>
	<li>1 150 µL eklemek M Tris-Cl (pH 7.8), 5 mg/mL lizozim 120 µL, 5 mg/ml DNaz 30 µL ben ve sipariş için Pelet ve çözüm için 10 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya 120 µL 0,125 M EDTA içinde onların anılan sıraya göre.</li>
	<li>Çözüm A 1 mL 1 dk yavaşça çözüm el ile dönen bir micropipette kullanarak 3.5 içinde hazırlanan solüsyona yavaş yavaş ekleyin. Oda sıcaklığında 4 dk için çözüm kuluçkaya.</li>
	<li>7 mL 4 ° C çözeltisi B iki 15 mL konik tüpler içine koymak. 3.6 her iki tüpler içinde hazırlanan solüsyona eşit miktarda ekleyebilirsiniz. Belgili tanımlık eriyik vasıl 1.500 x g, 4 ° C 4 dk için santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Serolojik pipet kullanarak, dikkatli bir şekilde tüm 1-2 mL süpernatant Pelet bozmadan çıkarın. Pelet yavaşça P1000 micropipette kullanarak yukarı ve aşağı pipetting tarafından resuspend. Görsel olarak spheroplasts oluşumu 1000 X büyütme ışık mikroskobu (Şekil 1 c) kullanarak da örneğine gözlemleyerek denetleyin.</li>
	<li>Spheroplasts-20 ° C'de için en fazla bir hafta veya 3 donma-çözülme başlatıldıkları gittiler kadar saklayın.</li>
</ol>4. gram-pozitif B. megaterium önceki hazırlanması
<ol><li>Bir 250 mL şişe 100 ml % 3 w/v TSB gecede kültür 1:1,000 sulandırmak ve 37 ° C'de bakteriyel çözüm çözüm 0,9-optik bir yoğunluğa ulaşmıştır kadar yaklaşık 4.5 için s sallayarak süre kuluçkaya 1.0 600 nm. Bir spektrofotometre kullanarak optik yoğunluk ölçer.</li>
	<li>Sıvı kültür iki 50 mL konik boru ve 2.000 x de g, 4 ° C'de 10 dakika santrifüj içine dökün.</li>
	<li>Serolojik pipet kullanarak, her iki konik boru üzerinden süpernatant atmak. Her Pelet 2.5 mL protoplast ortamda resuspend ve resuspended çözümleri tek bir konik tüp birleştirebilirsiniz. 125 mL şişe kombine resuspended çözümünde pipette.</li>
	<li>5 mg/mL lizozim 1 mL ekleyin ve 37 ° C'de 1 h için kuluçkaya sallayarak süre.</li>
	<li>Önceki küreler (Şekil 2) yerine şişmiş çubuklar olarak görüntülenir bakteri gibi herhangi bir usulsüzlük belirterek hafif bir mikroskop kullanarak 1000 x büyütme altında gelişimini izlemek. Serolojik pipet kullanarak, çözüm 15 mL konik tüp ve 2.000 x de g, 4 ° C'de 10 dakika santrifüj aktarın.</li>
	<li>Süpernatant dikkatle boşaltmak ve Pelet 5 mL protoplast medyada yeniden askıya alma. Önceki-20 ° C'de için en fazla bir hafta veya 3 donma-çözülme başlatıldıkları gittiler kadar saklayın.</li>
</ol>5. peptid çözüm ve membran boya görüntüleme için hazırlanması
<ol><li>
Peptid çözüm
	<ol>
<li>Alüminyum Folyo sarılı bir microfuge tüp içinde BF2 P11A 800 µL dH2içinde O. kullanım protein konsantrasyonu ölçümleri yapmak için en az bir triptofan kalıntı içeren bir peptid etiketli FITC 2 mg geçiyoruz.</li>
		<li>Spectrophotometrically, peptid çözüm 280, absorbans ölçmek nüsha nm. Molar tükenme katsayısı triptofan (5.700/Mcm) kullanarak peptid konsantrasyonu hesaplayın.</li>
		<li>2O 100-200 µM. Store-20 ° C'de microfuge tüp içinde son bir konsantrasyon için ışıktan korumak için alüminyum folyo sarılmış dH peptid konsantrasyon sulandırmak.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Membran boya
	<ol>
<li>Bir microfuge tüp di-8-ANEPPS (592.9 g/mol) 10 mM stokunun di-8-ANEPPS 843.3 µL DMSO, içinde 5 mg çözülerek hazırlayın. Işıktan korumak için alüminyum folyo sarılı 4 ° C'de depolayın.</li>
		<li>Bir microfuge tüp 0,03 mM di-8-ANEPPS 1 mL 997 µL DMSO için 10 mM di-8-ANEPPS 3 µL ekleyerek hazırlayın. Microfuge tüp ışıktan korumak için alüminyum folyo sarılı 4 ° C'de depolayın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. E. coli Spheroplasts ve d. megaterium önceki kullanarak Confocal mikroskobu görselleştirme
<ol><li>Spheroplasts veya önceki bir poli-L-lizin kaplamalı cam slayt üzerine 5 µL pipet. AMP (100-200 µM) slayt için etiketli FITC 2 µL ekleyin ve 3 dak ışıktan korunan için kuluçkaya.</li>
	<li>Membran boya di-8-ANEPPS (0,03 mM) 1 µL slayda ekleyin ve 3 dak ışıktan korunan için kuluçkaya. Bir cam coverslip ile kapak ve oje ile kapatın.</li>
	<li>Confocal mikroskop ve argon lazeri aç. Argon lazer % 20 güç çıkışı ve % 20 iletim ayarlayın.</li>
	<li>Emisyon dalga boyu aralığı 499-532 nm ve 670-745 nm FITC etiketli peptid emisyon kanal ve di-8-ANEPPS-etiketli membran boya emisyon kanalında, anılan sıraya göre ayarlayın.</li>
	<li>Görüntü önceki veya 63 X amacı ile spheroplasts (resim 1 ve Şekil 2). 8-bit almak için görüntüleme yazılımı kullanın, 512 x 512 bileşik z-yığın görüntüleri spheroplast veya protoplast tamamını 0.5 µm dilim oluşur. Not: taşma payı-aracılığıyla görüntüleme spheroplasts ve önceki emisyon azaltmak için dikkatli bir değerlendirme alın. Ayrıntılar için bkz.</li>
</ol>7. AMP yerelleştirme karakterizasyonu
<ol><li>Bileşik z-yığın görüntü görüntüleme yazılımı açın. Spheroplast veya işgal merkezi en dilim bulun ve bir dairesel bölge, faiz (ROI) yerleştirin (çapı 0.3 µm) membran (yatırım getirisi 1), spheroplast veya işgal (ROI 2) ortasına bir tane ve bir yere spheroplast veya ölçmek için işgal arka plan Floresan (ROI 3) (Şekil 5). Doymuş piksel dahil kaçının. Her yatırım getirisi floresan yoğunluğu görüntüleme yazılımı tarafından hesaplanır. Not: peptid membran bütünlüğü için Yerelleştir değil ne zaman, nerede peptid yerelleştirilmiştir alan membran üzerinde yatırım getirisi 1 durumlarda çizin.</li>
	<li>Aşağıdaki eşitliği hücre içi peptid floresan yoğunluğu membran peptid floresan yoğunluğu için oranını belirlemek için kullanın: <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/57904/57904eq1.jpg"> Not: Yatırım getirisi 3 floresan yoğunluğu arka plan floresan için hesap için floresans yoğunluklarda ROI 2 ve yatırım getirisi 1 den çıkarılır.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Baltzer, S. A., Brown, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+peptides:+promising+alternatives+to+conventional+antibiotics.">Antimicrobial peptides: promising alternatives to conventional antibiotics.</a> Journal of Molecular Microbiology Biotechnology. 20 (4), 228-235 (2011).</li><li>Hancock, R. E., Sahl, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+and+host-defense+peptides+as+new+anti-infective+therapeutic+strategies.">Antimicrobial and host-defense peptides as new anti-infective therapeutic strategies.</a> Nature Biotechnology. 24 (12), 1551-1557 (2006).</li><li>Jenssen, H., Hamill, P., Hancock, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+antimicrobial+agents.">Peptide antimicrobial agents.</a> Clinical Microbiology Reviews. 19 (3), 491-511 (2006).</li><li>Toke, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+peptides:+new+candidates+in+the+fight+against+bacterial+infections.">Antimicrobial peptides: new candidates in the fight against bacterial infections.</a> Biopolymers. 80 (6), 717-735 (2005).</li><li>Wang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+peptides+in+2014.">Antimicrobial peptides in 2014.</a> Pharmaceuticals. 8 (1), 123-150 (2015).</li><li>Epand, R. M., Vogel, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+antimicrobial+peptides+and+their+mechanisms+of+action.">Diversity of antimicrobial peptides and their mechanisms of action.</a> Biochim Biophys Acta. 1462, 11-28 (1999).</li><li>Drin, G., Rousselle, C., Scherrmann, J. -. M., Rees, A. R., Temsamani, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+Delivery+to+the+Brain+via+Adsorptive-Mediated+Endocytosis:+Advances+With+SynB+Vectors.">Peptide Delivery to the Brain via Adsorptive-Mediated Endocytosis: Advances With SynB Vectors.</a> AAPS PharmSciTech. 4 (4), 61-67 (2002).</li><li>Splith, K., Neundorf, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+peptides+with+cell-penetrating+peptide+properties+and+vice+versa.">Antimicrobial peptides with cell-penetrating peptide properties and vice versa.</a> European Biophysics Journal. 40 (4), 387-397 (2011).</li><li>Bustillo, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modular+analysis+of+hipposin,+a+histone-derived+antimicrobial+peptide+consisting+of+membrane+translocating+and+membrane+permeabilizing+fragments.">Modular analysis of hipposin, a histone-derived antimicrobial peptide consisting of membrane translocating and membrane permeabilizing fragments.</a> Biochim Biophys Acta. 1838 (9), 2228-2233 (2014).</li><li>Koo, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-activity+relations+of+parasin+I,+a+histone+H2A-derived+antimicrobial+peptide.">Structure-activity relations of parasin I, a histone H2A-derived antimicrobial peptide.</a> Peptides. 29 (7), 1102-1108 (2008).</li><li>Libardo, M. D., Cervantes, J. L., Salazar, J. C., Angeles-Boza, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+bioactivity+of+antimicrobial+peptides+by+addition+of+amino-terminal+copper+and+nickel+(ATCUN)+binding+motifs.">Improved bioactivity of antimicrobial peptides by addition of amino-terminal copper and nickel (ATCUN) binding motifs.</a> ChemMedChem. 9 (8), 1892-1901 (2014).</li><li>Park, C. B., Kim, H. S., Kim, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+Action+of+the+Antimicrobial+Peptide+Buforin+II:+Buforin+II+Kills+Microorganisms+by+Penetrating+the+Cell+Membrane+and+Inhibiting+Cellular+Functions.">Mechanism of Action of the Antimicrobial Peptide Buforin II: Buforin II Kills Microorganisms by Penetrating the Cell Membrane and Inhibiting Cellular Functions.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. , 253-257 (1998).</li><li>Park, C. B., Yi, K. -. S., Matsuzaki, K., Kim, M. S., Kim, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-activity+analysis+of+buforin+II,+a+histone+H2A-derived+antimicrobial+peptide:+The+proline+hinge+is+responsible+for+the+cell-penetrating+ability+of+buforin+II.">Structure-activity analysis of buforin II, a histone H2A-derived antimicrobial peptide: The proline hinge is responsible for the cell-penetrating ability of buforin II.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (15), 8245-8250 (2000).</li><li>Pavia, K. E., Spinella, S. A., Elmore, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+histone-derived+antimicrobial+peptides+use+different+antimicrobial+mechanisms.">Novel histone-derived antimicrobial peptides use different antimicrobial mechanisms.</a> Biochim Biophys Acta. 1818 (3), 869-876 (2012).</li><li>Wei, L., LaBouyer, M. A., Darling, L. E., Elmore, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+Spheroplasts+as+a+Model+for+Visualizing+Membrane+Translocation+of+Antimicrobial+Peptides.">Bacterial Spheroplasts as a Model for Visualizing Membrane Translocation of Antimicrobial Peptides.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60 (10), 6350-6352 (2016).</li><li>Chassy, B. M., Giuffrida, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+the+Lysis+of+Gram-Positive,+Asporogenous+Bacteria+with+Lysozyme.">Method for the Lysis of Gram-Positive, Asporogenous Bacteria with Lysozyme.</a> Appl. Environ. Microbiol. 39 (1), 153-158 (1980).</li><li>Fitz-James, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytological+and+Chemical+Studies+of+the+Browth+of+Protoplasts+of+Bacillus+megaterium.">Cytological and Chemical Studies of the Browth of Protoplasts of Bacillus megaterium.</a> J. Biophysic. and Biochem. Cytol. 4 (3), 257-266 (1958).</li><li>Martinac, B., Buechner, M., Delcour, A. H., Adler, J., Kung, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pressure-sensitive+ion+channel+in+Escherichia+coli.">Pressure-sensitive ion channel in Escherichia coli.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84, 2297-2301 (1986).</li><li>Martinac, B., Rohde, P. R., Cranfield, C. G., Nomura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch+clamp+electrophysiology+for+the+study+of+bacterial+ion+channels+in+giant+spheroplasts+of+E.+coli.">Patch clamp electrophysiology for the study of bacterial ion channels in giant spheroplasts of E. coli.</a> Methods Mol Biol. 966, 367-380 (2013).</li><li>Nadeau, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Introduction to Experimental Biophysics: Biological Methods for Physical Scientists. , (2016).</li><li>Sun, Y., Sun, T. L., Huang, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+properties+of+Escherichia+coli+spheroplast+membranes.">Physical properties of Escherichia coli spheroplast membranes.</a> Biophysical Journal. 107 (9), 2082-2090 (2014).</li><li>Branco, P., Viana, T., Albergaria, H., Arneborg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+peptides+(AMPs)+produced+by+Saccharomyces+cerevisiae+induce+alterations+in+the+intracellular+pH,+membrane+permeability+and+culturability+of+Hanseniaspora+guilliermondii+cells.">Antimicrobial peptides (AMPs) produced by Saccharomyces cerevisiae induce alterations in the intracellular pH, membrane permeability and culturability of Hanseniaspora guilliermondii cells.</a> Int J Food Microbiol. 205, 112-118 (2015).</li><li>Kobayashi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+Translocation+Mechanism+of+the+Antimicrobial+Peptide+Buforin+2.">Membrane Translocation Mechanism of the Antimicrobial Peptide Buforin 2.</a> Biochemistry. 43 (49), 15610-15616 (2004).</li><li>Spinella, S. A., Nelson, R. B., Elmore, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+peptide+translocation+into+large+unilamellar+vesicles.">Measuring peptide translocation into large unilamellar vesicles.</a> J Vis Exp. (59), e3571 (2012).</li><li>van der Kraan, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lactoferrampin:+a+novel+antimicrobial+peptide+in+the+N1-domain+of+bovine+lactoferrin.">Lactoferrampin: a novel antimicrobial peptide in the N1-domain of bovine lactoferrin.</a> Peptides. 25 (2), 177-183 (2004).</li><li>Sun, Y., Sun, T. L., Huang, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch+clamp+electrophysiology+for+the+study+of+bacterial+ion+channels+in+giant+spheroplasts+of+E.+coli.">Patch clamp electrophysiology for the study of bacterial ion channels in giant spheroplasts of E. coli.</a> Biophys J. 111 (1), 132-139 (2016).</li><li>Xie, Y., Fleming, E., Chen, J. L., Elmore, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+proline+position+on+the+antimicrobial+mechanism+of+buforin+II.">Effect of proline position on the antimicrobial mechanism of buforin II.</a> Peptides. 32 (4), 677-682 (2011).</li><li>Kobayashi, S., Takeshima, K., Park, C. B., Kim, S. C., Matsuzaki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+of+the+Novel+Antimicrobial+Peptide+Buforin+2+with+Lipid+Bilayers:+Proline+as+a+Translocation+Promoting+Factor.">Interactions of the Novel Antimicrobial Peptide Buforin 2 with Lipid Bilayers: Proline as a Translocation Promoting Factor.</a> Biochem. 39 (29), 8648-8654 (2000).</li><li>Decad, G. M., Nikaido, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outer+Membrane+of+Gram-Negative+Bacteria+XII.+Molecular-Sieving+Function+of+Cell+Wall.">Outer Membrane of Gram-Negative Bacteria XII. Molecular-Sieving Function of Cell Wall.</a> J. Bacteriol. 128 (1), 325-336 (1976).</li><li>Choi, H., Yang, Z., Weisshaar, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell,+real-time+detection+of+oxidative+stress+induced+in+Escherichia+coli+by+the+antimicrobial+peptide+CM15.">Single-cell, real-time detection of oxidative stress induced in Escherichia coli by the antimicrobial peptide CM15.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (3), E303-E310 (2015).</li><li>Yang, Z., Choi, H., Weisshaar, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melittin-Induced+Permeabilization,+Re-sealing,+and+Re-permeabilization+of+E.+coli+Membranes.">Melittin-Induced Permeabilization, Re-sealing, and Re-permeabilization of E. coli Membranes.</a> Biophys J. 114 (2), 368-379 (2018).</li><li>Ruthe, H. J., Adler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fusion+of+bacterial+spheroplasts+by+electric+fields.">Fusion of bacterial spheroplasts by electric fields.</a> Biochim. Biophys. Acta. 819 (1), (1985).</li></ol>

Hiçbir çıkar çatışmaları bildirilir.

Burada sunulan protokolleri genişlemiş, küresel bakteri bulun, yönlendirmek ve görüntü çok daha kolay olduğundan daha büyük örnek boyutları bakteriyel görüntülerin daha hızlı elde etmek araştırmacılar için uygun olun. Birkaç açıdan değerli, veri toplamak için geliştirilmiş bu yeteneğidir. İlk olarak, peptid yerelleştirme desen daha sistematik bir kantitatif analiz sağlar. Nitel eğilimleri daha küçük görüntüleri kümelerinden göstermiş olabilir iken, yüksek-nitelik imge sadece büyük örnek bir dizi ortaya daha nüanslı yerelleştirme desenleri, eğilimler için nerede bir peptid translocates karşı hücre yüzdesi yerelleştirir gibi membran. Ayrıca, yeteneği daha iyi çözmek için membran yerelleştirme üzerinden iç floresans yerelleştirme desenler zaman içinde değişim ne kadar ne kadar hızlı peptidler de bakteri hücreleri ile etkileşim değerlendirmek için zaman ders çalışmaları gerçekleştirmek daha kolay yapar. Geliştirilmiş çözünürlük de araştırmacılar daha küçük bakteri ile mümkün olmayan peptid yerelleştirme eğilimler dikkate almak sağlar. Örneğin, bazı bizim gözlenen spheroplasts ve önceki, membran, peptid sinyalleri değil tam, tutarlı bir halka bakteriler üremelerine rağmen ve yerine biraz punctate göstermek Yani, belirli bölümlerini yerelleştirmek için peptidler görünür etiketleme. Diğer durumlarda, peptidler tamamen eşit olarak bakteriyel membran içinde dağıtılamaz peptid sinyalleri değil tamamen doldurmak bakterilerin iç mekan yani . Biz bu eğilimleri geçerli analizimizi takip değil iken, böyle yerelleştirme eğilimleri göz önüne alındığında düşsel spheroplasts ve standart bakteri hücreleri yerine önceki uygulanabilir duruma gelir. Bu avantajları da hücre penetran peptidler gibi amper dışında peptidler lokalizasyonu belirlemek için geçerli olacak. Spheroplasts ve bu yaklaşımları ile üretilen önceki yama-kelepçe Elektrofizyoloji ölçümleri18,19gibi artan hücresel boyutu parası olmayan görüntüleme deneyler için yararlanılabilir.
Confocal mikroskobu tarama bir lazer bizim görüntüleme Protokolü geliştirilmesinde kullanılmıştır, ama her belirli görüntüleme sistemi parametrelerini optimize etmek için önemlidir. Bu peptid ve membran taşma payı aracılığıyla peptid'ın emisyon kanal içine membran boya ve membran'ın içine FITC etiketli peptid en aza indirirken floresans boya, tespiti en üst düzeye çıkarmak parametreleri kümesini seçmeyi içerir emisyon kanal. Taşma payı-üzerinden peptid membran'ın emisyon kanal içine herhangi bir bölümünü FITC'ın emisyon spektrum içermiyordu membran'ın emisyon kanal için bir dalga boyu aralığı seçerek kaçınılması. Taşma payı-yoluyla membran boya gelen di-8-ANEPPS, peptid'ın emisyon kanal içine di-8-ANEPPS emisyon spektrum FITC'ın emisyon spektrum çoğunluğu ile örtüştüğünden önlemek daha zor. Bu protokole özgü, taşma payı-üzerinden membran boya peptid'ın emisyon kanal içine amper yanlış karakterizasyonu olarak lokalize membran neden olabilir. Kimse taşma payı ile bu tür spheroplasts veya sadece membran boya ile etiketlenir önceki görüntüleme ve floresan peptid'ın emisyon kanalda görünür olup olmadığını görmek için kontrol oluşup oluşmadığını belirleyebilirsiniz. Peptid'ın emisyon kanal ve kazanç ve uzaklık değerleri tanımlamak için kullanılan dalgaboyu aralığı da dahil olmak üzere çeşitli görüntüleme parametreleri sistematik olarak taşma payı ile en aza indirir parametreleri kümesini belirlemek için test edilecek. Bir parametre kümesi oluşturulduğunda, spheroplasts veya peptid ve membran boya ile etiketli önceki kullanılmaktadır zaman görüntüleme floresans sinyalinin güçlü algılama verir olup olmadığını değerlendirmek için önemlidir. Bu yaklaşımla, taşma payı-FITC etiketli AMP ve membran floresans tespiti en üst düzeye çıkarma sırasında aracılığıyla etkisini en aza indirgemek görüntüleme parametreleri di-8-ANEPPS boya başarıyla kuruldu. Özellikle, emisyon taşma payı-yoluyla membran boya peptid kanal içine gelen emisyon dalga boyu aralığı 499-532 nm (peptid) ve 670-745 nm (membran) ve kazanç ≤800 volt (V) (peptid) olarak ayarlandığında kullanarak simge durumuna küçültülmüş olduğunu bulduk ve ≤900 V (membran) ve uzaklık ≤ -10.0 düzeltilmiş % (peptid, membran).
E. coli ve B. megateriumodaklı, sunulan iletişim kuralları spheroplasts veya önceki birçok farklı bakteri suşları üzerinden üretmek için adapte olabilir. Örneğin, biz başarılı bir şekilde 1-2 µm çapı 4 bölümünde özetlenen protokolünü kullanarak edildi Bacillus subtilis önceki üretmek mümkün olmuştur ve uyarlamalar Protokolü'nün daha fazla boyutu optimize etmek için yapılmış olabilir. Hücre duvar yapısı bakterilerin iki bu sınıflar arasındaki farkları amper ile etkileşimini etkileyebilir çünkü peptid yerelleştirme okuduğunuzda, gram-negatif ve gram-pozitif bakteriler gözlemek için yetenek amper çalışma için yararlıdır hücresel zarları. Ancak, birçok görüntüleme çalışmaları amper bugüne sadece modeli E. coli suşları odaklanmış ve böylece, peptidler gram-pozitif bakteri suşları ile davranışını yansıtmıyor olabilir.
Spheroplasts ve önceki normal bakteri, en önemlisi onların eksikliği bir dış hücre duvarı farklı ve sonuç olarak tüm deneysel sorular için iyi modelleri olmayabilir. Örneğin, dış membran Ayagin Gram-negatif bakteri daha büyük moleküllerin29moleküler bir elek olarak hareket olduğu gösterilmiştir. Daha büyük peptidler, bu nedenle, ne zaman onlar çok normal bakteri yapmak istiyorsunuz değil spheroplasts içinde translocate mümkün olabilir. Ayrıca, AMP bakteri hücre duvarı, dış membran ve sitoplazmik membran ile etkileşim ayrıntılı çalışmalar spheroplasts ve önceki kullanılarak gerçekleştirilemez. Örneğin, WEISSHAAR Laboratuarı'ndan son çalışma eylem30,31CM15 ve melittin mekanizmaları daha kesin pozisyonlarda peptid, Not için görüntüleme kullanıldığında vardır. Ancak, yaklaşımımız, burada açıklandığı gibi Havacilik uygulanması mikroskobu araçları içine gerekli çözünürlük31ulaşmak için gerektirmez. Önceki çalışma spheroplasts uygun21,32olduğunu göstermiştir rağmen onlar yine de büyük olasılıkla bazı metabolik ve fizyolojik farklılıklar potansiyel olarak bazı membran etkileşimleri alter "normal" bakterilerden var durumlarda. Çünkü biz spheroplast nüfus canlılığı değerlendirildi değil, Ayrıca, bir kolayca sadece bir ölü arasında translocate bir peptid karşı bir yaşam hücrenin hücre zarı arasında translocate yapabiliyor bir peptid arasında ayırt edemez veya hücre ölüyor. Bu farklılıklara rağmen biz burada sunulan B. megaterium önceki ile BF2 P11A eylem15ve sonuçlarımız bilinen mekanizmaları ile tutarlı olduğundan birçok amper için yerelleştirme okuduğunuzda, E. coli spheroplasts gördük Bu peptid13,27,28diğer gözlemleri ile tutarlı görünüyor. Spheroplasts ve önceki membran besteleri de kesinlikle daha fizyolojik lipid veziküller gibi diğer model sistemlerde kullanılan tipik karışımları daha ilgilidir. Özetle, geliştirilmiş çözünürlük ve spheroplasts ve önceki, tarafından tanınan görüntüleme kolaylığı verilen onların yararlı modelleri membran etkin ajanlar, amper gibi bir dizi bakteri suşları görüntülenmesi için olduğunu düşünüyorum.

Antimikrobiyal peptidler (amper) önem onların potansiyel kullanım nedeniyle konvansiyonel antibiyotik1,2,3,4,5alternatif olarak kazanmıştır. Amper ya hücre zarı arasında translocating ve hücre içi bileşenleri veya nükleik asitler gibi ile etkileşerek hücre içeriği6kaçağı neden membran permeabilizing tarafından bakterileri öldürmek. Sigara zorlanarak geçirimsiz hücre zarı7,8çapraz olabilir çünkü antibiyotik olarak kullanımlarının yanı sıra, amper translocating ilaç teslim uygulamalar için adapte. Biz, bu nedenle, temel AMP mekanizmaları uyuşturucu tasarımda kullanımları için zemin hazırlamaya eylem anlamak arıyorlar.
Confocal mikroskobu yerelleştirme desenleri fluorescently etiketli amper onların mekanizması eylem9,10,11,12, ilgili bilgiler sağlayan bakteri hücreleri içinde değerlendirmek için bir yol sunar 13 , 14. bakteri membran etiketleme tarafından kimse fluorescently etiketli bir peptid membran veya bakteri hücre hücre içi boşluğun üzerine yerelleştirir belirleyebilirsiniz. Ancak, bu tekniğin konvansiyonel ışık mikroskoplar çözünürlük sınırları ve değişken yönlendirmesi slayt15bakteri nedeniyle zorlu Imaging yapabilirsiniz bakteriler, küçük boyutu ve çubuk şeklinde ile sınırlıdır.
Gelişmiş görsel olarak fluorescently etiketli peptid yerelleştirme desenleri confocal mikroskobu kullanarak etkinleştirmek için sunulan Yöntem hedefidir. Görselleştirme gelişmiş küçük, ince, çubuk şekilli gram-negatif Escherichia coli (e.coli) ve gram-pozitif Bacillus megaterium (B. megaterium) kapatarak genişlemiş, küresel formları içine bakteri olarak anılacaktır spheroplasts (için gram-negatif suşları) ve önceki (için gram-pozitif suşları)16,17,18,19,20,21. Artan büyüklükleri ve bir bakteri yönünü bir slaytta, görüntüleme için alakasız yapar simetrik şekilleri nedeniyle spheroplasts ve önceki görüntü için daha kolay olur. Buna ek olarak, biz kantitatif amper yerelleştirme veya translocating her iki membran karakterize için confocal mikroskobu verileri çözümlemek için sistematik bir yaklaşım sunuyoruz. Bu yöntemler uygulamak ayırt etmek fluorescently peptid yerelleştirme desenleri etiketli kolaylaştırır. Burada sunulan protokolleri membran-aktif ajanlar amper hücre penetran peptidler de dahil olmak üzere dışında çeşitli lokalizasyonu değerlendirmek için kullanılabilir.
Bir avantaj bu tekniğin bu hücre hücre heterojenite15, aksine tanımlamak için yaygın olarak kullanılan diğer floresans deneyleri gösterebilir bir tek hücre düzeyinde anlayışlar amper etki mekanizması sağlar eylem yalnızca sağlar toplu tahminleri9,22,23,24,25amper mekanizmaları. Hücre girişini, lipid veziküller24gibi değerlendirmek için kullanılan diğer modellere kıyasla daha fizyolojik ilgili15 oldukları için spheroplasts ve AMP hücre girişini değerlendirmek için önceki belirli yararlı26 yaşında.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Trizma hydrocloride (Tris HCl)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base (Tris OH)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>106361</td>
			<td>Used Sigma 106361 in original protocol development; 106361 discontinued with ED2SS as replacement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cephalexin hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C4895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1760</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BBL Trypticase soy broth</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>B11768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BF2 P11A FITC</td>
			<td>NeoScientific</td>
			<td>Custom ordered</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>di-8-ANEPPS</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>61012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>34869</td>
			<td>Used Sigma D8779 in original protocol development; D8779 discontinued with 34869 as replacement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maleic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M0375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrodisc 25 mm Syringe Filter w/ 0.2 &#956;m HT Tuffryn Membrane</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>4192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser scanning confocal microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>TCS SP5 II</td>
			<td>For image acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Application Suite, Advanced Fluorescence</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td>For image processing</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production and visualization of bacterial spheroplasts and protoplasts to characterize antimicrobial peptide localization

Peptid yerelleştirme desenleri bakteri içinde değerlendirmek için bir yöntem olarak confocal mikroskobu kullanımı yaygın olarak konvansiyonel ışık mikroskoplar çözünürlük sınırları ile engellenir. Kolayca çözümlemesi için verilen mikroskop geliştirilemez gibi biz küçük çubuk şekilli gram-negatif Escherichia coli (e.coli) ve gram-pozitif Bacillus megaterium (B. megaterium) dönüştürmek için protokolleri mevcut daha büyük, kolayca görüntülü küresel formlara spheroplasts veya önceki adı. Bu dönüşüm gözlemciler hızla ve açıkça peptidler kendilerini (Yani, membran yerelleştirme) bakteriyel membran lodge veya girin (Örneğin, translocating) hücre membran çapraz belirlemek izin verir. Bu yaklaşım ile biz de peptidler yerelleştirme veya translocating membran karakterize etmek için sistematik bir yöntem mevcut. Bu yöntem çeşitli membran-aktif peptidler ve bakteri suşları için kullanılabilir iken, biz göstermek belgili tanımlık yarar bu protokolün Buforin II P11A arasındaki etkileşimin gözlemleyerek (BF2 P11A), E. coli ile antimikrobiyal bir peptid (AMP), spheroplasts ve d. megaterium önceki.

Peptidler bakteriyel membran yerelleştirmek veya bakteriyel membran arasında kolayca translocate bakteri büyütmek ve onları küresel yaparak, biz kolayca ayırt edebilirsiniz. Konvansiyonel ışık mikroskoplar çözünürlük sınırları membran için yerelleştirilmiş sinyalleri ile üst üste gözükeceği peptid sinyalleri membran veya normal bakteri hücre içi alan ortaya olup olmadığını ayırt etmek zor yapmak hücre içi alanı (Şekil 3A). Buna ek olarak, membran marker ve kolaylaştırmak için hücre içi alanı arasında açık çözünürlükte genişlemiş boyutu olan genellikle sadece çapı 1 µm, normal bakteri için karşılaştırıldığında önceki (2-3 µm) ve spheroplasts (2-5 µm) sonuçları peptid yerelleştirme (Şekil 3B) ayırt.
Burada, spheroplasts ve önceki AMP BF2 P11A etiketli N-terminal FITC yerelleştirme desenini göstermek için kullanılır. Biz FITC BF2 hem membran için yerelleştirilmesine ve E. coli spheroplasts ve d. megaterium önceki (Şekil 4) arasında hücre membran translocate P11A etiketli görmekteyiz. Vahşi türü BF2 E. coli ve lipid vezikül membranlar arasında translocate için gözlenen iken, P11A mutasyon bu translocation13,27,28azaltmak için bilinir. Bir sigara antibiyotik dirençli B. megaterium ve ampisilin dayanıklı Top 10 E. coli (pET45B) sunulan veri içinde kullanılmaktadır. Ampisilin dirençli E. coli ampisilin (349.4 g/mol) 25 µg/mL çözelti içinde son bir konsantrasyon, huzurunda yetişkin. Görüntüleme için 7, bölümünde özetlenen sistematik bir yaklaşım takip ROIs membran, hücre içi alanı ve arka plan (Şekil 5B) çizildi. Hücre içi peptid floresan yoğunluğu peptid floresan yoğunluğu membran üzerinde için oranı her spheroplast veya protoplast BF2 P11A ile etkileşim için hesaplanan 7.2 bölümünde açıklanan denklemi kullanarak. Şekil 5A bu oran tüm spheroplasts ve attı protoplast dağılımını gösterir. Spheroplasts ve önceki büyük ölçüde düştü spheroplasts veya daha az 0.3 veya 1'den büyük bir oranını sahip önceki çoğunluğu ile iki gruba attı.
Oranları içine düşmek farklı gruplar göz önüne alındığında, 7.2 bölümünde hesaplanan oranı sıfırdan büyük veya 1'e eşit iken translocating olarak peptid yerelleştirme tanımlı. Diğer taraftan, peptid yerelleştirme 7.2 bölümünde açıklanan oranı az 1 yaşındayken membran yerelleştirme olarak tanımlanmıştır. Puanlama yöntemi, biz % 71 ve E. coli spheroplasts dolapları % 70'i membran için yerelleştirme benzer yerelleştirme için bir desen BF2 P11A E. coli spheroplasts ve d. megaterium önceki BF2 P11A ile gözlenen ve B. megaterium önceki, sırasıyla (Tablo 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57904/57904fig1.jpg"> Resim 1: E.coli temsilcisi görüntüler. (A) E. coli bakteri (B) E. coli yılan ve (C) E. coli spheroplast. Görüntüleri 100 X büyütme oranında alındı. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57904/57904fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57904/57904fig2.jpg"> Resim 2: B. megateriumtemsilcisi görüntülerini. (A) B. megaterium bakteri ve (B) B. megaterium işgal. Görüntüleri 100 X büyütme oranında alındı. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57904/57904fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57904/57904fig3.jpg"> Şekil 3: B. megateriumtemsilcisi görüntülerini. (A) B. megaterium bakteri hücre ve (B) B. megaterium protoplast membran marker di-8-ANEPPS ile etiketlenmiş. Görüntüleri orta z yığından 100 X (A) ve 63 X (B) büyütme gösterilir. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57904/57904fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57904/57904fig4.jpg"> Şekil 4: Temsilcisi E. coli spheroplasts ve d. megaterium önceki FITC ile etkileşim etiketli BF2 P11A. (A) E. coli spheroplast gösteren BF2 P11A membran için yerelleştirme. (B) E. coli spheroplast gösteren BF2 P11A membran arasında translocating. (C) B. megaterium protoplast gösteren BF2 P11A membran için yerelleştirme. (D) B. megaterium protoplast gösteren BF2 P11A membran arasında translocating. E. coli spheroplasts ve d. megaterium önceki membran marker di-8-ANEPPS ile (kırmızı) etiketlenir ve FITC BF2 P11A (yeşil) etiketli. Görüntüleri orta z yığından 63 X büyütme oranında gösterilir. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57904/57904fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57904/57904fig5.jpg"> Şekil 5: analiz peptid yerelleştirme kalıplarının. Hücre içi floresan yoğunluğu (ROI 2) membran floresan yoğunluğu (yatırım getirisi 1) için oranını(a)dağıtım arka plan çıkarma sonra ((ROI 2-YG 3) / (yatırım getirisi 1-YG 3)) E. coli spheroplasts ve d. megaterium için BF2 P11A ile etiketli önceki FITC ile etkileşim (B) E. coli spheroplast etiketli BF2 P11A. Dairesel bölgeler, faiz (ROI) 0.3 µm membran (yatırım getirisi 1) hücre içi alan (ROI 2) çizilmiş çapı ve arka plan (ROI 3). Peptid floresan yoğunluğu her yatırım getirisini sayılabilir ve arka plan floresans yatırım getirisi 1 ve yatırım getirisi 2 floresan yoğunluğu düşük yatırım getirisi 3 floresan yoğunluğu çıkararak sorumluydu. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57904/57904fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Bakteriyel zorlanma</td>
			<td>No spheroplast veya işgal</td>
			<td>Membran % yerelleştirme</td>
			<td>% Translocating</td>
		</tr>
<tr>
<td>E. coli</td>
			<td>84</td>
			<td>71</td>
			<td>29</td>
		</tr>
<tr>
<td>B. megaterium</td>
			<td>70</td>
			<td>70</td>
			<td>30</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1: BF2 P11A ile etkileşim yerelleştirme desen E. coli spheroplasts ve B. megaterium önceki.

Watch this Scientific Journal Video about Production and Visualization of Bacterial Spheroplasts and Protoplasts to Characterize Antimicrobial Peptide Localization at JoVE.com

Production and Visualization of Bacterial Spheroplasts and Protoplasts to Characterize Antimicrobial Peptide Localization

Burada Ayagin Gram-negatif Escherichia coli (e.coli) üretmek için bir protokol mevcut spheroplasts ve gram-pozitif Bacillus megaterium (B. megaterium) önceki açıkça görselleştirmek ve hızla karakterize peptid-bakteri etkileşimler. Bu yerelleştirme ve peptidler translocating membran tanımlamak için sistematik bir yöntem sağlar.

Üretim ve bakteriyel Spheroplasts ve önceki antimikrobiyal peptid yerelleştirme karakterize etmek için görselleştirme

The use of confocal microscopy as a method to assess peptide localization patterns within bacteria is commonly inhibited by the resolution limits of ...

production-visualization-bacterial-spheroplasts-protoplasts-to

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

11.6K Görüntüleme.  Wellesley College. Burada Ayagin Gram-negatif Escherichia coli (e.coli) üretmek için bir protokol mevcut spheroplasts ve gram-pozitif Bacillus megaterium (B. megaterium) önceki açıkça görselleştirmek ve hızla karakterize peptid-bakteri etkileşimler. Bu yerelleştirme ve peptidler translocating membran tanımlamak için sistematik bir yöntem sağlar.

Video: Production and Visualization of Bacterial Spheroplasts and Protoplasts to Characterize Antimicrobial Peptide Localization

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental stimuli in any multicellular organism. In situ hybridization and reporter gene visualization can to a limited extent be used to this end but for high resolution quantitative RT-PCR or high-throughput transcriptome-wide analysis the isolation of RNA from particular cell types is requisite. Cellular dissociation of tissue expressing a fluorescent protein marker in a specific cell type and subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) makes it possible to collect sufficient amounts of material for RNA extraction, cDNA synthesis/amplification and microarray analysis.
An extensive set of cell type-specific fluorescent reporter lines is available to the plant research community. In this case, two marker lines of the Arabidopsis thaliana root are used: PSCR::GFP (endodermis and quiescent center) and PWOX5::GFP (quiescent center). Large numbers (thousands) of seedlings are grown hydroponically or on agar plates and harvested to obtain enough root material for further analysis. Cellular dissociation of plant material is achieved by enzymatic digestion of the cell wall. This procedure makes use of high osmolarity-induced plasmolysis and commercially available cellulases, pectinases and hemicellulases to release protoplasts into solution.
FACS of GFP-positive cells makes use of the visualization of the green versus the red emission spectra of protoplasts excited by a 488 nm laser. GFP-positive protoplasts can be distinguished by their increased ratio of green to red emission. Protoplasts are typically sorted directly into RNA extraction buffer and stored for further processing at a later time.
This technique is revealed to be straightforward and practicable. Furthermore, it is shown that it can be used without difficulty to isolate sufficient numbers of cells for transcriptome analysis, even for very scarce cell types (e.g. quiescent center cells). Lastly, a growth setup for Arabidopsis seedlings is demonstrated that enables uncomplicated treatment of the plants prior to cell sorting (e.g. for the cell type-specific analysis of biotic or abiotic stress responses). Potential supplementary uses for FACS of plant protoplasts are discussed.

A method for isolating specific cell types from plant material is demonstrated. This technique employs transgenic marker lines expressing fluorescent proteins in particular cell types, cellular dissociation and Fluorescence Activated Cell Sorting. Additionally, a growth setup is established here that facilitates treatment of Arabidopsis thaliana seedlings prior to cell sorting.

Bitki protoplast Floresan Aktif Hücre Ayırma

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

Biyoloji

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

İyon Kanalları ve Fonksiyonel Analiz Mutagenez Heterologously Memeli Hücreleri cinsinden ifade edilir

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Nano-fEM: Protein Localization Using Photo-activated Localization Microscopy and Electron Microscopy

Mapping the distribution of proteins is essential for understanding the function of proteins in a cell. Fluorescence microscopy is extensively used for protein localization, but subcellular context is often absent in fluorescence images. Immuno-electron microscopy, on the other hand, can localize proteins, but the technique is limited by a lack of compatible antibodies, poor preservation of morphology and because most antigens are not exposed to the specimen surface. Correlative approaches can acquire the fluorescence image from a whole cell first, either from immuno-fluorescence or genetically tagged proteins. The sample is then fixed and embedded for electron microscopy, and the images are correlated 1-3. However, the low-resolution fluorescence image and the lack of fiducial markers preclude the precise localization of proteins. 
Alternatively, fluorescence imaging can be done after preserving the specimen in plastic. In this approach, the block is sectioned, and fluorescence images and electron micrographs of the same section are correlated 4-7. However, the diffraction limit of light in the correlated image obscures the locations of individual molecules, and the fluorescence often extends beyond the boundary of the cell. 
Nano-resolution fluorescence electron microscopy (nano-fEM) is designed to localize proteins at nano-scale by imaging the same sections using photo-activated localization microscopy (PALM) and electron microscopy. PALM overcomes the diffraction limit by imaging individual fluorescent proteins and subsequently mapping the centroid of each fluorescent spot 8-10. 
We outline the nano-fEM technique in five steps. First, the sample is fixed and embedded using conditions that preserve the fluorescence of tagged proteins. Second, the resin blocks are sectioned into ultrathin segments (70-80 nm) that are mounted on a cover glass. Third, fluorescence is imaged in these sections using the Zeiss PALM microscope. Fourth, electron dense structures are imaged in these same sections using a scanning electron microscope. Fifth, the fluorescence and electron micrographs are aligned using gold particles as fiducial markers. In summary, the subcellular localization of fluorescently tagged proteins can be determined at nanometer resolution in approximately one week.

We describe a method to localize fluorescently tagged proteins in electron micrographs. Fluorescence is first localized using photo-activated localization microscopy on ultrathin sections. These images are then aligned to electron micrographs of the same section.

Nano-fem: Foto-aktif Yerelleştirme Mikroskobu ve Elektron Mikroskop Kullanarak Protein Yerelleştirme

Mapping the distribution of proteins is essential for understanding the function of proteins in a cell. Fluorescence microscopy is extensively used for ...

Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate

Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both mitochondrial (respiration) and non-mitochondrial (other redox) reactions consume oxygen, but these reactions can be easily distinguished by chemical inhibition of mitochondrial respiration. However, while mitochondrial oxygen consumption is an unambiguous and direct measurement of respiration rate2, the same is not true for extracellular acid production and its relationship to glycolytic rate 3-6. Extracellular acid produced by cells is derived from both lactate, produced by anaerobic glycolysis, and CO2, produced in the citric acid cycle during respiration. For glycolysis, the conversion of glucose to lactate- + H+ and the export of products into the assay medium is the source of glycolytic acidification. For respiration, the export of CO2, hydration to H2CO3 and dissociation to HCO3- + H+ is the source of respiratory acidification. The proportions of glycolytic and respiratory acidification depend on the experimental conditions, including cell type and substrate(s) provided, and can range from nearly 100% glycolytic acidification to nearly 100% respiratory acidification 6. Here, we demonstrate the data collection and calculation methods needed to determine respiratory and glycolytic contributions to total extracellular acidification by whole cells in culture using C2C12 myoblast cells as a model.

Glycolysis is a defining metabolic marker in multiple biological systems. Monitoring glycolysis by measuring the extracellular flux of H+ is common, but requires correction to be quantitative and unambiguous. Here, we demonstrate how to gather and correct extracellular flux data to distinguish between respiratory and glycolytic sources of extracellular acidification.

Ekstraselüler Asit Üretim Ölçüm ve Analiz Glikolitik Hızı belirleme

Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both ...

Targeted RNA Sequencing Assay to Characterize Gene Expression and Genomic Alterations

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding RNAs. Standard RNAseq requires 30 - 100 million sequencing reads and can include multiple RNA products such as mRNA and noncoding RNAs. We demonstrate how targeted RNAseq (capture) permits a focused study on selected RNA products using a desktop sequencer. RNAseq capture can characterize unannotated, low, or transiently expressed transcripts that may otherwise be missed using traditional RNAseq methods. Here we describe the extraction of RNA from cell lines, ribosomal RNA depletion, cDNA synthesis, preparation of barcoded libraries, hybridization and capture of targeted transcripts and multiplex sequencing on a desktop sequencer. We also outline the computational analysis pipeline, which includes quality control assessment, alignment, fusion detection, gene expression quantification and identification of single nucleotide variants. This assay allows for targeted transcript sequencing to characterize gene expression, gene fusions, and mutations.

We describe a targeted RNA sequencing-based method that includes preparation of indexed cDNA libraries, hybridization and capture with custom probes and data analysis to interrogate selected transcripts for gene expression, mutations, and gene fusions. Targeted RNAseq permits cost-effective, rapid evaluation of selected transcripts on a desktop sequencer.

RNA Sıralama Deneyi Gen İfade ve Genomik değişiklikleri tanımlamak için hedeflenen

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding ...

Visualization of Surface-tethered Large DNA Molecules with a Fluorescent Protein DNA Binding Peptide

Large DNA molecules tethered on the functionalized glass surface have been utilized in polymer physics and biochemistry particularly for investigating interactions between DNA and its binding proteins. Here, we report a method that uses fluorescent microscopy for visualizing large DNA molecules tethered on the surface. First, glass coverslips are biotinylated and passivated by coating with biotinylated polyethylene glycol, which specifically binds biotinylated DNA via avidin protein linkers and significantly reduces undesirable binding from non-specific interactions of proteins or DNA molecules on the surface. Second, the DNA molecules are biotinylated by two different methods depending on their terminals. The blunt ended DNA is tagged with biotinylated dUTP at its 3' hydroxyl terminus, by terminal transferase, while the sticky ended DNA is hybridized with biotinylated complimentary oligonucleotides by DNA ligase. Finally, a microfluidic shear flow makes single DNA molecules stretch to their full contour lengths after being stained with fluorescent protein-DNA binding peptide (FP-DBP).

We present an approach for visualizing fluorescent protein DNA binding peptide (FP-DBP)-stained large DNA molecules tethered on the polyethylene glycol (PEG) and avidin-coated glass surface and stretched with microfluidic shear flows.

Peptit bağlanma floresan protein DNA ile yüzey-gergin büyük DNA moleküllerinin Görselleştirme

Large DNA molecules tethered on the functionalized glass surface have been utilized in polymer physics and biochemistry particularly for investigating ...

Utilizing pHluorin-tagged Receptors to Monitor Subcellular Localization and Trafficking

Understanding membrane protein trafficking, assembly, and expression requires an approach that differentiates between those residing in intracellular organelles and those localized on the plasma membrane. Traditional fluorescence-based measurements lack the capability to distinguish membrane proteins residing in different organelles. Cutting edge methodologies transcend traditional methods by coupling pH-sensitive fluorophores with total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM). TIRF illumination excites the sample up to approximately 150 nm from the glass-sample interface, thus decreasing background, increasing the signal to noise ratio, and enhancing resolution. The excitation volume in TIRFM encompasses the plasma membrane and nearby organelles such as the peripheral ER. Superecliptic pHluorin (SEP) is a pH sensitive version of GFP. Genetically encoding SEP into the extracellular domain of a membrane protein of interest positions the fluorophore on the luminal side of the ER and in the extracellular region of the cell. SEP is fluorescent when the pH is greater than 6, but remains in an off state at lower pH values. Therefore, receptors tagged with SEP fluoresce when residing in the endoplasmic reticulum (ER) or upon insertion in the plasma membrane (PM) but not when confined to a trafficking vesicle or other organelles such as the Golgi. The extracellular pH can be adjusted to dictate the fluorescence of receptors on the plasma membrane. The difference in fluorescence between TIRF images at neutral and acidic extracellular pH for the same cell corresponds to a relative number of receptors on the plasma membrane. This allows a simultaneous measurement of intracellular and plasma membrane resident receptors. Single vesicle insertion events can also be measured when the extracellular pH is neutral, corresponding to a low pH trafficking vesicle fusing with the plasma membrane and transitioning into a fluorescent state. This versatile technique can be exploited to study localization, expression, and trafficking of membrane proteins.

Labeling the extracellular domain of a membrane protein with a pH sensitive fluorophore, superecliptic pHluorin (SEP), allows subcellular localization, expression, and trafficking to be determined. Imaging SEP-labeled proteins with total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM) enables the quantification of protein levels in the peripheral ER and plasma membrane.

pHluorin etiketli Reseptör kullanarak Subselüler Yerelleşme ve Ticareti Monitör

Understanding membrane protein trafficking, assembly, and expression requires an approach that differentiates between those residing in intracellular ...

Measuring Endoreduplication by Flow Cytometry of Isolated Tuber Protoplasts

Endoreduplication, the replication of a cell's nuclear genome without subsequent cytokinesis, yields cells with increased DNA content and is associated with specialization, development and increase in cellular size. In plants, endoreduplication seems to facilitate the growth and expansion of certain tissues and organs. Among them is the tuber of potato (Solanum tuberosum), which undergoes considerable cellular expansion in fulfilling its function of carbohydrate storage. Thus, endoreduplication may play an important role in how tubers are able to accommodate this abundance of carbon. However, the cellular debris resulting from crude nuclear isolation methods of tubers, methods that can be used effectively with leaves, precludes the estimation of the tuber endoreduplication index (EI). This article presents a technique for assessing tuber endoreduplication through the isolation of protoplasts while demonstrating representative results obtained from different genotypes and compartmentalized tuber tissues. The major limitations of the protocol are the time and reagent costs required for sample preparation as well as relatively short lifespan of samples after lysis of protoplasts. While the protocol is sensitive to technical variation, it represents an improvement over traditional methods of nuclear isolation from these large specialized cells. Possibilities for improvements to the protocol such as recycling enzyme, the use of fixatives, and other alterations are proposed.

The protocol described herein is a method for measuring endoreduplication within tubers of potato (Solanum tuberosum). It includes plasmolysis and protoplast extraction steps to decrease the noise and debris in downstream flow cytometric analysis.

Endoreduplication izole yumru önceki Akış Sitometresi tarafından ölçme

Endoreduplication, the replication of a cell's nuclear genome without subsequent cytokinesis, yields cells with increased DNA content and is associated ...

A Simple Method for Isolation of Soybean Protoplasts and Application to Transient Gene Expression Analyses

Soybean (Glycine max (L.) Merr.) is an important crop species and has become a legume model for the studies of genetic and biochemical pathways. Therefore, it is important to establish an efficient transient gene expression system in soybean. Here, we report a simple protocol for the preparation of soybean protoplasts and its application for transient functional analyses. We found that young unifoliate leaves from soybean seedlings resulted in large quantities of high quality protoplasts. By optimizing a PEG-calcium-mediated transformation method, we achieved high transformation efficiency using soybean unifoliate protoplasts. This system provides an efficient and versatile model for examination of complex regulatory and signaling mechanisms in live soybean cells and may help to better understand diverse cellular, developmental and physiological processes of legumes.

We developed a simple and efficient protocol for the preparation of large quantities of soybean protoplasts to study complex regulatory and signaling mechanisms in live cells.

Soya önceki ve geçici gen ifade analiz için uygulama yalıtım için basit bir yöntem

Soybean (Glycine max (L.) Merr.) is an important crop species and has become a legume model for the studies of genetic and biochemical pathways. ...

Assessment of Zebrafish Lens Nucleus Localization and Sutural Integrity

The zebrafish is uniquely suited to genetic manipulation and in vivo imaging, making it an increasingly popular model for reverse genetic studies and for generation of transgenics for in vivo imaging. These unique capabilities make the zebrafish an ideal platform to study ocular lens development and physiology. Our recent findings that an Aquaporin-0, Aqp0a, is required for stability of the anterior lens suture, as well as for the shift of the lens nucleus to the lens center with age led us to develop tools especially suited to analyzing the properties of zebrafish lenses. Here we outline detailed methods for lens dissection that can be applied to both larval and adult lenses, to prepare them for histological analysis, immunohistochemistry and imaging. We focus on analysis of lens suture integrity and cortical cell morphology and compare data generated from dissected lenses with data obtained from in vivo imaging of lens morphology made possible by a novel transgenic zebrafish line with a genetically encoded fluorescent marker. Analysis of dissected lenses perpendicular to their optical axis allows quantification of the relative position of the lens nucleus along the anterior-posterior axis. Movement of the lens nucleus from an initial anterior position to the center is required for normal lens optics in adult zebrafish. Thus, a quantitative measure of lens nuclear position directly correlates with its optical properties.

These protocols were developed to analyze cortical lens morphology, structural integrity of the zebrafish lens sutures in fixed and live lenses and to measure the position of the zebrafish lens nucleus along the anterior-posterior axis.

Zebrafish objektif Nucleus yerelleştirme ve sütür bütünlüğü değerlendirmesi

The zebrafish is uniquely suited to genetic manipulation and in vivo imaging, making it an increasingly popular model for reverse genetic studies and for ...