연구는 국립 연구소의 알레르기와 감염 증 (NIAID NIH) 수상 R15AI079685에 의해 지원 되었다.

1. 솔루션 준비
참고: 대장균 spheroplasts 및 B. megaterium protoplasts를 각각 일으키기 위하여 1.1-1.9, 1.8-1.11 단계에 설명 된 솔루션을 준비 합니다.
<ol><li>1 준비 M Tris-Cl, pH 7.8 10.34 g Tris HCl와 dH2O 125 mL 플라스 크에 50 mL에 트리 스 오의 4.17 g을 용 해 하 여. 0.2 µ m 막으로 25mm 주사기 필터를 통해 필터링 하 여 소독 하 고 실 온에서 원뿔 튜브에 저장 합니다.</li>
	<li>0.10 g MgCl2 (95.2 g/mol) 및 25 mL dH2O 125 mL 플라스 크에 11.98 g 자당 (342.3 g/mol)을 용 해 하 여 솔루션 (20 m m MgCl2, 0.7 M 자당, 10 mM Tris-Cl, pH 7.8)를 준비 합니다. 500 µ L을 추가 1 M Tris-Cl (pH 7.8) 50 mL를 볼륨을 조정. 0.2 µ m 막으로 25mm 주사기 필터를 통해 필터링 하 여 소독 하 고 실 온에서 원뿔 튜브에 저장 합니다.</li>
	<li>0.05 g MgCl2 (95.2 g/mol) 및 25 mL dH2125 mL 플라스 크에 O 13.69 g 자당 (342.3 g/mol)을 용 해 하 여 솔루션 B (10 m m MgCl2, 0.8 M 자당, 10 mM Tris-Cl, pH 7.8)를 준비 합니다. 500 µ L을 추가 1 M Tris-Cl (pH 7.8) 50 mL를 볼륨을 조정. 0.2 µ m 막으로 25mm 주사기 필터를 통해 필터링 하 여 소독 하 고 실 온에서 원뿔 튜브에 저장 합니다.</li>
	<li>50 mL dH2125 mL 플라스 크에 O 13.69 g 자당 (342.3 g/mol)을 용 해 하 여 0.8 M 자당을 준비 합니다. 0.2 µ m 막으로 25mm 주사기 필터를 통해 필터링 하 여 소독 하 고 실 온에서 원뿔 튜브에 저장 합니다.</li>
	<li>5 mg/mL deoxyribonuclease 준비 나 (DNase 나) 0.015 g DNase를 용 해 하 여 dH2O 50 mL 플라스 크에 3 mL에 나. 0.2 µ m 막으로 25mm 주사기 필터를 통해 필터링 하 여 소독. Aliquot 솔루션 microfuge 관으로-20 ° c.에 게</li>
	<li>0.125 M ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) 준비, EDTA disodium 0.698 g을 용 해 하 여 pH 8.0으로 15 mL dH2O 125 mL 플라스 크에 (372.2 g/mol)를 탈수. 0.2 µ m 막으로 25mm 주사기 필터를 통해 필터링 하 여 소독 하 고 실 온에서 원뿔 튜브에 저장 합니다.</li>
	<li>세 팔 렉 신 하이드 레이트 (365.404 g/mol) dH2O 125 mL 플라스 크에 50 ml에서의 0.03 g을 용 해 하 여 600 µ g/mL 세 팔 렉 신을 준비 합니다. 0.2 µ m 막으로 25mm 주사기 필터를 통해 필터링 하 여 소독 및 4 ° c.에 원뿔 튜브에 저장</li>
	<li>5 mg/mL lysozyme 0.015 g lysozyme dH2O 50 mL 플라스 크에 3 mL에 용 해 하 여 준비 합니다. 0.2 µ m 막으로 25mm 주사기 필터를 통해 필터링 하 여 소독. Aliquot 솔루션 microfuge 관으로-20 ° c.에 게</li>
	<li>DH2O 2 L 플라스 크에 1 리터에 TSB의 30 g을 용 해 하 여 3 %w / v Trypticase 간장 국물 (TSB)를 준비 합니다. 약 수 25 mL 100 mL TSB 각각 대장균 spheroplasts 또는 B. megaterium protoplasts, 의 준비에 사용할 수를 포함 하는 플라스 크에 솔루션. 오토 클레이 브 소독 액체 매체를 플라스 크입니다. 살 균 TSB 실내 온도 또는 4 ° C에서 저장 될 수 있다</li>
	<li>34.23 g 자당 (342.3 g/mol), 0.46 g maleic 산 (116.07 g/mol), 그리고 0.38 g MgCl2 (95.21 g/mol) dH2O 250 mL 플라스 크에 100 mL에 용 해 하 여 솔루션 C (1 M 자당, 0.04 M maleate, 0.04 M MgCl2, pH 6.5)를 준비 합니다. PH 6.5 조정 합니다. 0.2 µ m 막으로 25mm 주사기 필터를 통해 필터링 하 여 소독 하 고 실 온에서 원뿔 튜브에 저장 합니다.</li>
	<li>100 mL 3 %w / v TSB와 100 mL 해결책 C 1 리터 유리병에 혼합 하 여 200 mL 원생 동물 매체를 준비 합니다. 오토 클레이 브 소독 솔루션을 상 온에서 저장.</li>
</ol>2입니다. 준비의 숙박 문화
참고: 섹션 2-4 적절 한 무 균 기술을 사용 하 여 수행 합니다. 원하는 경우, 세균성 긴장을 잠재적인 오염 줄이기 위해 항생제 내성에 대 한 플라스 미드를 포함할 수 있습니다. 항생제 저항 긴장을 사용 하 여, 단계 2.1, 3.1-3.2, 그리고 4.1-4.4에에서 필요한 항생제를 추가 합니다.
<ol><li>살 균 피 펫 팁을 사용 하 고 3 %w / v TSB의 2-3 mL를 포함 하는 14 mL 문화 관으로 배치 박테리아에의 한 식민지를 선택 하 여 숙박 문화를 준비 합니다. 16-21 h를 흔들어 동안 37 ° C에서 품 어.</li>
</ol>3. 그람 음성의 대장균 Spheroplasts의 준비
<ol><li>250 mL 플라스 크에 25 mL 볼륨 3 %w / v TSB의 숙박 문화 1: 100 희석 하 고 37 ° C에서 세균성 솔루션 솔루션 600 0.5-0.8의 광학 밀도 도달 했습니다 때까지 약 2.5 h를 흔들어 동안 품 어 nm. 분 광 광도 계를 사용 하 여 광학 밀도 측정 합니다.</li>
	<li>250 mL 플라스 크에 희석이 문화 1:10 3 %w / v TSB의 30 ml에서 및 2.5 h 60 µ g/mL 세 팔 렉 신 (347.4 g/mol) 단일 셀 필 라 멘 트의 약 생산의 존재를 흔들어 동안 37 ° C에서 품 어 50-150 µ m 길이에서 는 가벼운 현미경 (그림 1B)를 사용 하 여 1000 X 배율에서 관찰.</li>
	<li>1500 x g, 4 분 Decant 4 ° C에서 세균성 솔루션 centrifuging 여는 필 라 멘 트를 수확 하 고 상쾌한, 펠 릿 예약 취소.</li>
	<li>부드럽게 되는 펠 렛을 방해 하지 않도록 주의 하는 0.8 M 자당의 1 mL을 추가 하 여는 필 라 멘 트를 씻어. 1 분 동안 incubate 고은 펠 렛을 방해 하지 않고는 상쾌한 삭제.</li>
	<li>150 µ L 1의 추가 M Tris-Cl (pH 7.8), lysozyme 5 mg/mL의 120 µ L, 5 mg/mL DNase의 30 µ L, 그리고 펠 릿을 주문 하 고 10 분 동안 실내 온도에 솔루션을 품 어는 그들의 각각에서 0.125 M EDTA의 120 µ L.</li>
	<li>추가 솔루션의 1 mL 점차적으로 1 분 이상 3.5 동안 부드럽게 손으로 솔루션을 소용돌이 micropipette를 사용 하 여 준비 하는 솔루션을 합니다. 실 온에서 4 분에 대 한 솔루션을 품 어.</li>
	<li>두 개의 15 mL 원뿔 튜브에 4 ° C 솔루션 B의 7 mL를 넣어. 이 두 튜브의 각 3.6에서 준비 하는 솔루션의 동일 금액을 추가 합니다. 1500 x g, 4 분 4 ° C에서 솔루션 원심</li>
	<li>혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여, 조심 스럽게 제거 1-의 2 개 mL 상쾌한 제외 하 고 모두는 펠 렛을 방해 하지 않고. 부드럽게 P1000 micropipette를 사용 하 여 위아래로 pipetting으로 펠 릿을 resuspend. 시각적으로 확인 spheroplasts 형성 1000 X 확대 가벼운 현미경 (그림 1C)을 사용 하 여 샘플을 관찰 하 여.</li>
	<li>-20 ° C에서 1 주까지 또는 그들은 3 freeze-thaw 주기를 통해 갈 때까지 spheroplasts를 저장 합니다.</li>
</ol>4. 그람 양성 B. megaterium Protoplasts의 준비
<ol><li>250 mL 플라스 크에 희석 3 %w / v TSB의 100 mL에서 하룻밤 문화 1:1,000 하 고 37 ° C에서 세균성 솔루션 솔루션 0.9-의 광학 밀도 도달 했습니다 때까지 약 4.5 h 흔들어 동안 품 어 1.0 600 nm. 분 광 광도 계를 사용 하 여 광학 밀도 측정 합니다.</li>
	<li>2 50 mL 원뿔 튜브와 2000 x g, 10 분 동안 4 ° C에서 원심 분리기에 액체 문화를 부 어.</li>
	<li>혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여 두 원뿔 튜브에서 상쾌한을 삭제 합니다. 2.5 mL 원생 동물 매체에 각 펠 릿을 resuspend 하 고 resuspended 솔루션을 결합 하 여 단일 원뿔 관으로. 125 mL 플라스 크에 결합 된 resuspended 솔루션 플라스틱</li>
	<li>5 mg/mL lysozyme의 1 mL을 추가 하 고 37 ° C에서 1 시간 흔들어 동안 품 어.</li>
	<li>1000 배 확대 가벼운 현미경, 부정, 분야 (그림 2) 대신 부 봉으로 표시 되는 박테리아와 같은 지적을 사용 하 여 아래 protoplasts의 증가 모니터링 합니다. 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여 솔루션 15 mL 원뿔 튜브와 2000 x g, 10 분 동안 4 ° C에서 원심 전송.</li>
	<li>가만히 따르다는 상쾌한 고 다시 5 mL 원생 동물 미디어에 펠 릿을 중단. -20 ° C에서 1 주까지 또는 그들은 3 freeze-thaw 주기를 통해 갈 때까지 protoplasts를 저장 합니다.</li>
</ol>5. 펩타이드 솔루션 및 이미징 막 염료의 준비
<ol><li>
펩 티 드 솔루션
	<ol>
<li>알루미늄 호 일에 싸여 microfuge 관, FITC BF2 P11A 800 µ L dH2오 사용 펩 티 드 단백질 농도 측정을 수행 하려면 적어도 하나의 트립토판 잔류물을 포함 표시의 2 밀리 그램을 디졸브.</li>
		<li>280에서 펩 티 드 용액의 흡 광도 측정 하는 spectrophotometrically, 3 중에 nm. 트립토판 (5,700/Mcm)에 대 한 어 금 니 소멸 계수를 사용 하 여 펩 티 드 농도 계산 합니다.</li>
		<li>DH-20 ° C에서 microfuge 관에서 100-200 µ M. 저장소의 최종 농도에2O 빛 으로부터 보호 하기 위해 알루미늄 호 일에 싸여 있는 펩 티 드 농도 희석.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
막 염료
	<ol>
<li>Microfuge 관에서 DMSO의 843.3 µ L에 디-8-ANEPPS의 5 mg를 용 해 하 여 디-8-ANEPPS (592.9 g/mol)의 10 m m 재고를 준비 합니다. 빛 으로부터 보호 하기 위해 알루미늄 호 일에 싸서 4 ° C에서 저장 합니다.</li>
		<li>Microfuge 관에서 10 m m 디-8-ANEPPS의 3 µ L 997 µ L DMSO를 추가 하 여 0.03 m m 디-8-ANEPPS의 1 mL를 준비 합니다. 빛 으로부터 보호 하기 위해 알루미늄 호 일에 싸서 4 ° C에서 microfuge 관에 저장 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. 대장균 Spheroplasts 및 B. megaterium Protoplasts를 사용 하 여 Confocal 현미경 검사 법의 시각화
<ol><li>Spheroplasts 또는 protoplasts 폴 리-L-리 신 코팅된 유리 슬라이드에 5 µ L 플라스틱 FITC 앰프 (100-200 µ M) 슬라이드에 표시 된의 2 µ L을 추가 하 고 빛 으로부터 보호 하는 3 분 동안 품 어.</li>
	<li>슬라이드에는 막 염료 디-8-ANEPPS (0.03 m m)의 1 µ L을 추가 하 고 빛 으로부터 보호 하는 3 분 동안 품 어. 유리 coverslip로 커버 하 고 매니큐어와 함께 인감.</li>
	<li>Confocal 현미경 및 아르곤 레이저를 켭니다. 20% 전원 출력을 20% 전송 아르곤 레이저를 조정 합니다.</li>
	<li>각각 499-532 nm와 FITC 표시 된 펩 티 드 방출 채널 및 디-8-ANEPPS-표시 막 염료 방출 채널, 670-745 nm의 방출 파장 범위를 설정 합니다.</li>
	<li>이미지 protoplasts 또는 spheroplasts (그림 1 및 그림 2) 63 X 목표. 8 비트를 이미징 소프트웨어를 사용 하 여, 512 x 512 복합 z-스택 이미지 구성 0.5 µ m 조각 spheroplast 또는 원생 동물의 전체. 참고: 이미징 spheroplasts 및 protoplasts 동안 피가 통해 방출 감소를 신중 하 게 고려 걸릴. 자세한 내용은 토론을 참조 하십시오.</li>
</ol>7입니다. 앰프 지역화의 특성
<ol><li>이미징 소프트웨어에 복합 z-스택 이미지를 엽니다. Spheroplast 또는 원생 동물의 센터-대부분 슬라이스를 찾아서 한 원형 지역의 관심 (ROI)을 배치 (직경에서 0.3 μ m) 막 (ROI 1), spheroplast 또는 원생 동물 (ROI 2)의 중심에와 spheroplast 또는 측정 하는 원생 동물에 배경 형광 (ROI 3) (그림 5) 포화 픽셀의 포함을 하지 마십시오. 이미징 소프트웨어에 의해 각 ROI의 형광 강도 계산할 수 있습니다. 참고: 경우에 펩 티 드를 막의 전체를 지역화 하지 않습니다, 그릴 때 투자 수익 1 펩 티 드 지역화는 막의 지역에.</li>
	<li>다음 방정식을 사용 하 여 막 펩 티 드 형광 강도 세포내 펩 티 드 형광 강도의 비율 결정. <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/57904/57904eq1.jpg"> 참고: 투자 수익 3에서 형광 강도에서 뺍니다 2 투자 수익 및 투자 수익 1 형광 강렬 배경 형광에 대 한 계정을 위해.</li>
</ol>

<ol>
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C., Matsuzaki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+of+the+Novel+Antimicrobial+Peptide+Buforin+2+with+Lipid+Bilayers:+Proline+as+a+Translocation+Promoting+Factor.">Interactions of the Novel Antimicrobial Peptide Buforin 2 with Lipid Bilayers: Proline as a Translocation Promoting Factor.</a> Biochem. 39 (29), 8648-8654 (2000).</li><li>Decad, G. M., Nikaido, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outer+Membrane+of+Gram-Negative+Bacteria+XII.+Molecular-Sieving+Function+of+Cell+Wall.">Outer Membrane of Gram-Negative Bacteria XII. Molecular-Sieving Function of Cell Wall.</a> J. Bacteriol. 128 (1), 325-336 (1976).</li><li>Choi, H., Yang, Z., Weisshaar, J. 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J., Adler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fusion+of+bacterial+spheroplasts+by+electric+fields.">Fusion of bacterial spheroplasts by electric fields.</a> Biochim. Biophys. Acta. 819 (1), (1985).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언 됩니다.

여기에 제시 된 프로토콜 연구자를 더 빠르게 세균 이미지의 더 큰 샘플 크기 확대, 구형 박테리아, 오리엔트, 찾아서 이미지를 훨씬 더 쉽게 하기 때문에 가능 하 게. 이 향상 된 기능은 데이터를 수집 하는 여러 가지 면에서 유용 합니다. 첫째, 펩 티 드 지역화 패턴의 체계적인 정량 분석을 수 있습니다. 동안 질적 동향은 이미지의 작은 세트에서 설명 될 수 있다, 높은-품질의 이미지의 큰 샘플 집합에 대해서만 공개 더 nuanced 지역화 패턴, 동향 펩 티 드 대 translocates 셀의 비율을 localizes 같은 막입니다. 또한, 더 나은 해결 수 막 지역화에서 내부 형광 쉽게 시간 과정 연구를 얼마나 빨리 펩 티 드와 상호 작용 뿐만 아니라 세균성 세포 지역화 패턴 시간이 지남에 변경 하는 방법으로 평가 수행할 수 있습니다. 향상 된 해상도 또한 작은 박테리아 가능 하지 않은 펩 티 드 지역화 추세를 고려 하는 연구를 수 있습니다. 예를 들어 일부 우리의 관찰 된 spheroplasts와 protoplasts, 펩 티 드 표시 막, 즉, 펩 티 드 신호 박테리아 주위는 완전 한, 응집력 반지를 형성 고 대신 일부 punctate 표시 하지 않습니다의 특정 부분을 지역화 하려면 라벨. 다른 경우에, 펩 티 드 배포할 수 없습니다 전적으로 균등 하 게 세균 막 내부 즉, 펩 티 드 신호 박테리아의 내부 공간을 완전히 채우지 않습니다. 우리가 우리의 현재 분석에 이러한 경향을 추구 하지, 하는 동안 같은 지역화 동향 고려 되 가능한 이미징 spheroplasts과 protoplasts 표준 세균성 세포 대신. 이러한 장점 또한 세포 관통 펩 티 드 같은 앰프, 다른 펩 티 드의 지역화 결정에 적용 됩니다. Spheroplasts 및 protoplasts이 접근 생산 증가 세포 크기, 패치 클램프 전기 생리학 측정18,19등 으로부터 혜택을 받는 비 이미징 실험에 대 한 이용 될 수 있습니다.
각 특정 이미징 시스템에 대 한 매개 변수를 최적화 하는 것이 중요 하지만 레이저 confocal 현미경 검사 우리의 이미징 프로토콜의 개발에 활용 되었다. 이 포함 하는 화상 물림 재단 통해 펩 티 드의 방출으로로 막 염료에서 고 막의에 FITC 표시 된 펩 티 드에서 최소화 하면서 펩 티 드와 막 염료 형광의 탐지를 극대화 하는 매개 변수 집합을 선택 하 방출 채널입니다. 막의 방출 채널에 펩 티 드에서 도련 통해 FITC의 방출 스펙트럼의 모든 부분을 포함 하지 않은 막의 방출 채널에 대 한 파장 범위를 선택 하 여 피할 되었습니다. 출혈-통해 막 염료에서 디-8-ANEPPS, 펩 티 드의 방출 채널에 있었다 더 디-8-ANEPPS' 방출 스펙트럼 FITC의 방출 스펙트럼의 대다수와 중복 때문에 피하기 어렵다. 이 프로토콜에 특정 펩 티 드의 방출으로 막 염료에서 도련 통해 발생할 수 있습니다 지역화 막으로 앰프의 잘못 된 특성. 하나는이 자연의 도련 통해 발생 하는지 spheroplasts 또는 독점적으로 막 염료 표시 됩니다 protoplasts 이미징 형광에 펩 티 드의 방출 채널에서 볼 수 있는지 확인 하 여 확인할 수 있습니다. 펩 티 드의 방출 채널 이득 및 오프셋 값을 정의 하는 데 사용 하는 파장 범위를 포함 하 여 다양 한 이미징 매개 변수 화상 물림 재단을 통해 최소화 하는 매개 변수 집합을 결정 하기 위해 체계적으로 테스트할 수 있습니다. 매개 변수 집합이 설정 되 면 그것은 이미징 생성 강한 형광 신호 검출 spheroplasts 또는 protoplasts 펩 티 드와 막 염료와 표시 활용 여부를 평가 하는 중요 한. 이 방법을 통해 우리는 성공적으로 FITC 표시 된 앰프와 막의 형광 검출을 극대화 하면서 피가 통해의 효과 최소화 하는 이미징 매개 변수 염색 디-8-ANEPPS 설립. 특히, 우리는 그는 방출 출혈-통해 펩 티 드로 막 염료에서 최소화 했다 방출 파장 범위 499-532 nm (펩타이드) 670-745 nm (막)의 고 이득 조정 되었다 ≤800 볼트 (V) (펩 티 드)를 사용 하 여 발견 하 고 ≤900 V (막) 및 오프셋 조정 했다 ≤-10.0% (펩타이드, 막).
비록 우리가 대장균 및 B. megaterium에 초점을 맞춘, 제시 프로토콜 spheroplasts 또는 많은 다른 세균성 긴장에서 protoplasts 생산에 적응 될 수 있습니다. 예를 들어 우리가 성공적으로 1-2 µ m 직경 섹션 4에에서 설명 된 프로토콜을 사용 하 여 했다 새 균의 subtilis protoplasts를 생산할 수 있었고 프로토콜의 적응 더 크기를 최적화 하기 위해 만들 수 있는. 이러한 두 클래스 박테리아의 세포 벽 구조 차이 앰프 상호 작용 하는 방법을 영향을 미칠 수 있기 때문에 펩 티 드 그람 음성 및 그람 양성 박테리아에서 지역화 패턴을 관찰 하는 능력은 앰프의 연구에 특히 유용 세포 막입니다. 그러나, 많은 이미징 연구의 최신 모델 대장균 변종에 전적으로 초점을 맞춘 그리고, 따라서, 그람 양성 세균 변종으로 펩 티 드의 동작을 반영 하지 않을 수 있습니다.
Spheroplasts와 protoplasts과 다는 외부 세포 벽의 그들의 부족에 가장 주목할 만한 정상적인 박테리아를 따라서 실험의 모든 질문에 대 한 좋은 모델을 되지 않을 수 있습니다. 예를 들어, 그램 음성 박테리아의 외부 막 큰 분자29분자 체로 표시 되었습니다. 더 큰 펩 티 드, 따라서, 그들은 일반적인 박테리아에서 그렇게을 할 것 이다 때 spheroplasts에 이동 수 수 있습니다. 또한, spheroplasts 및 protoplasts를 사용 하 여 박테리아 세포 벽, 외부 막과 세포질 막 앰프의 상호 작용의 상세한 연구를 수행할 수 없습니다. 예를 들어 Weisshaar 연구소에서 최근 작품 액션30,31의 CM15 및 melittin 메커니즘에는 펩 티 드의 더 정확한 위치를 주의 하는 이미징 활용 하고있다. 그러나, 우리의 접근, 여기에 설명 된 대로 필요 하지 않습니다 구현의 마이크로 현미경 계측에 필요한 해상도31달성 하기 위하여. 이전 작업으로 나타났습니다 spheroplasts 가능한21,32, 하지만 그들은 그럼에도 불구 하 고 가능성이 있다 대사 및 생리 적 차이가 잠재적으로 일부 막 상호 작용을 변경할 수 있는 "정상적인" 박테리아에서 케이스입니다. 또한, 우리 spheroplast 인구의 생존 능력을 평가 하지는, 때문에 하나 쉽게 수만 죽은 걸쳐 이동 펩 티 드 대 살아있는 세포의 세포 막에 걸쳐 이동 수 있는 펩 티 드 사이 구별할 수 없습니다 또는 죽어가는 셀입니다. 이러한 차이도 불구 하 고 우리가 본 대장균 spheroplasts에서 지역화 패턴 B. megaterium protoplasts 여기에 제시 된 BF2 P11A 행동15, 그리고 우리의 결과의 알려진된 메커니즘에 일치 하는 많은 앰프에 대 한 그 펩 티 드13,,2728다른 관측으로 일관 된 것. Spheroplasts 및 protoplasts의 막 작곡 지질 소포 등 다른 모델 시스템에 사용 되는 일반 혼합물 보다 확실히 더 순수 관련 있습니다. 요약, 향상 된 해상도 영상 spheroplasts 및 protoplasts에 의해 여유의 용이성에서에서 그들은 막 활성 에이전트, 앰프 등 다양 한 세균성 긴장을 시각화에 대 한 유용한 모델 우리 믿습니다.

항균 성 펩 티 드 (암페어)는 기존의 항생제1,2,3,,45대 안으로 그들의 잠재적인 사용 주의 얻고 있다. 앰프는 여 세포 막에 걸쳐 translocating 핵 산 또는 세포내 구성 요소와 상호 작용 하는 셀 내용을6의 누설을 일으키는 막 permeabilizing 여 박테리아를 죽 일. 항생제로 그들의 사용 이외에 앰프를 translocating 수 있습니다 적응 시킬 약물 전달 응용 프로그램에 대 한 그들은 불 침투성 세포 막7,8교차 비 비정상적으로 수 있기 때문에. 우리, 따라서, 약물 디자인에 그들의 사용을 위한 기초를 누워 행동의 근본적인 앰프 메커니즘을 이해 하고자 합니다.
지역화 액션9,10,,1112, 의 자신의 메커니즘에 대 한 통찰력을 제공 하는 세균성 세포에 붙일 라벨의 패턴을 평가 하는 방법을 제공 하는 confocal 현미경 검사 법 13 , 14. 박테리아의 막의 라벨, 하나 붙일 레이블된 펩 티 드 막에 세균성 세포의 세포내 공간 localizes 경우 확인할 수 있습니다. 그러나,이 기술은 기존의 가벼운 현미경의 해상도 한계 및 슬라이드15에 박테리아의 변수 방향 도전 이미징 할 수 있는 박테리아의 작은 크기와 막대 모양에 의해 제한 됩니다.
Confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 붙일 레이블된 펩 티 드 지역화 패턴의 향상 된 시각화 수 있도록 제시 방법의 목표가입니다. 시각화는 작고, 얇은, 막대 모양의 그람 음성의 대장균 (대장균) 및 그람 양성 간 균 megaterium (B. megaterium)를 설정 하 여 향상 된 확대, 둥근 형태로 박테리아 라고도 (그람 음성 긴장)에 대 한 spheroplasts 그리고 protoplasts (그람 양성 긴장)에 대 한16,17,18,19,,2021. Spheroplasts와 protoplasts는 그들의 증가 크기와 그 영상에 대 한 관련성이 없는 슬라이드에 박테리아의 방향을 만드는 그들의 대칭 모양 때문에 이미지 하기 쉽습니다. 또한, 우리는 양적 앰프 중 막 지역화 또는 translocating로 성격을 나타내기 위하여 confocal 현미경 검사 법 데이터를 분석 하는 체계적인 접근 방법을 제시. 이러한 방법을 적용 쉽게 구별에 놓여있는지 펩 티 드 지역화 패턴 표시 있습니다. 여기에 제시 된 프로토콜은 다양 한 앰프, 세포 관통 펩 티 드를 포함 하 여 다른 막-활성 에이전트의 지역화를 평가 하기 위해 사용할 수 있습니다.
뚜렷한이 기술의 장점은 그것 셀이15, 일반적으로 식별 하는 데 사용 하는 다른 형광 분석에 반대를 공개 수 있습니다 단일 세포 수준에서의 행동의 메커니즘에 통찰력을 제공 하나는 대량 견적9,22,23,,2425만 제공 하는 앰프의 행동의 메커니즘. Spheroplasts 및 protoplasts 앰프 셀 항목을 평가 사용 때문에 지질 소포24등 셀 항목을 평가 하기 위해 사용 되는 다른 모델 보다 더 순수 관련15 특정 유용한26 입니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Trizma hydrocloride (Tris HCl)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base (Tris OH)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>106361</td>
			<td>Used Sigma 106361 in original protocol development; 106361 discontinued with ED2SS as replacement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cephalexin hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C4895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1760</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BBL Trypticase soy broth</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>B11768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BF2 P11A FITC</td>
			<td>NeoScientific</td>
			<td>Custom ordered</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>di-8-ANEPPS</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>61012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>34869</td>
			<td>Used Sigma D8779 in original protocol development; D8779 discontinued with 34869 as replacement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maleic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M0375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrodisc 25 mm Syringe Filter w/ 0.2 &#956;m HT Tuffryn Membrane</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>4192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser scanning confocal microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>TCS SP5 II</td>
			<td>For image acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Application Suite, Advanced Fluorescence</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td>For image processing</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production and visualization of bacterial spheroplasts and protoplasts to characterize antimicrobial peptide localization

박테리아 내에서 펩 티 드 지역화 패턴을 평가 하는 방법으로 confocal 현미경 검사 법의 사용은 일반적으로 기존의 가벼운 현미경의 해결책 한계에 의해 억제 됩니다. 선물이 작은 막대 모양의 그람 음성의 대장균 (대장균) 및 그람 양성 간 균 megaterium (B. megaterium) 변환 하는 프로토콜 특정된 현미경에 대 한 해상도 쉽게 향상 될 수 없습니다, 더 큰, 쉽게 군데 둥근 모양으로 spheroplasts 또는 protoplasts 라고합니다. 이 변환 관찰자를 펩 티 드 (즉, 막 지역화) 세균 막으로 자신을 결 사 또는 교차 하는 셀 (예: translocating) 입력을 막 신속 하 고 명확 하 게 결정할 수 있습니다. 이 방법을 우리는 또한 막 지역화 또는 translocating으로 펩 티 드를 특성화 하는 체계적인 방법을 제시. 이 메서드를 사용 하 여 막 활성 펩 티 드 및 세균성 긴장의 다양 한 수, 있지만 우리 Buforin II P11A의 상호 작용을 관찰 하 여이 프로토콜의 유틸리티 설명 (BF2 P11A), 대장균 과 항균 성 펩타이드 (AMP), spheroplasts 및 B. megaterium protoplasts입니다.

박테리아를 확대 하 고 구형, 여 우리가 쉽게 펩 티 드 세균 막에 지역화 또는 세균 막에 걸쳐 이동 쉽게 구분할 수 있습니다. 기존의 가벼운 현미경의 해상도 한계 게 도전 막에 지역화 신호 겹칠 나타납니다 때문에 막 또는 정상적인 박테리아 세포내 공간에서 펩 티 드 신호 발생 여부를 구별 하는 세포내 공간 (그림 3A)입니다. 반면, 확대의 크기 spheroplasts (2-5 µ m) 및 protoplasts (2-3 µ m)는 일반적으로 단지 1 개의 µ m 직경에서 정상적인 박테리아에 비해 막 마커를 쉽게 하는 세포내 공간 사이 명확 해상도 결과 펩 티 드 지역화 (그림 3B)를 구별 합니다.
여기, spheroplasts 및 protoplasts 앰프 BF2 P11A 표시 된 N 맨끝 FITC의 지역화 패턴을 표시 하는 데 사용 됩니다. 우리는 FITC 라는 막에 지역화와 대장균 spheroplasts 및 B. megaterium protoplasts (그림 4)의 세포 막에 걸쳐 이동 BF2 P11A 관찰 합니다. 반면 야생 타입 BF2 대장균 과 지질 소포 막에 걸쳐 이동 관찰 되었습니다, P11A 돌연변이를 줄이기 위해이 전13,,2728알려져 있다. 우리는 비 항생제 내성 B. megaterium 와 암 피 실린 내성 톱 10 대장균 (pET45B) 데이터에 활용. 암 피 실린 내성 대장균 25 µ g/mL의 솔루션에서 최종 농도에 암 피 실린 (349.4 g/mol)의 면 전에 서 성장 했다. 이미징, 체계적인 접근 방법 섹션 7에에서 설명 된 다음 ROIs 했다에 그려진 막, 세포내 공간, 그리고 배경 (그림 5B). 멤브레인에 펩 티 드 형광 강도 세포내 펩 티 드 형광 강도의 비율 각 spheroplast 또는 BF2 P11A와 상호 작용 하는 원생 동물에 대 한 계산 섹션 7.2에서에서 설명 하는 수식을 사용 하 여. 그림 5A 는 모든 spheroplasts 및 득점 하는 원생 동물에 대 한이 비율의 분포를 보여 줍니다. Spheroplasts와 protoplasts spheroplasts 또는 protoplasts 미만 0.3 또는 1 보다 큰 비 데의 대다수와 가진 두 그룹으로 크게 떨어진 득점.
비율에 있는 분명 한 그룹을 감안할 때, 우리가 정의 펩 티 드 지역화 섹션 7.2에서에서 계산 비율 1 보다 크거나 때 translocating. 반대로, 펩 티 드 지역화 막 지역화 때 섹션 7.2에서에서 설명 하는 비율 1 미만으로 정의 되었다. 득점의이 방법에 따라 우리는 유사한 지역화에 대 한 패턴 BF2 P11A 대장균 spheroplasts 및 BF2 P11A와 B. megaterium protoplasts 71%와 70%의 경우 대장균 spheroplasts에 대 한 막에 지역화를 관찰 하 고 B. megaterium protoplasts, 각각 (표 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57904/57904fig1.jpg"> 그림 1: 대장균의 대표 이미지. (A) 대장균 박테리아 (B) 대장균 뱀 및 (C) 대장균 spheroplast. 이미지는 100 X 배율에서 촬영 했다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57904/57904fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57904/57904fig2.jpg"> 그림 2: B. megaterium의 대표 이미지. (A) B. megaterium 박테리아 그리고 원생 동물 (B) B. megaterium . 이미지는 100 X 배율에서 촬영 했다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57904/57904fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57904/57904fig3.jpg"> 그림 3: B. megaterium의 대표 이미지. (A) B. megaterium 세균성 세포 및 (B) B. megaterium 원생 동물 막 마커 디-8-ANEPPS로 표시. 중간 z 스택의 이미지 100 X (A)과 63 X (B) 확대 표시 됩니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57904/57904fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57904/57904fig4.jpg"> 그림 4: 대표적인 대장균 spheroplasts와 FITC와 상호 작용 하는 B. megaterium protoplasts BF2 P11A 표시 되어 있다. (A) 대장균 spheroplast 보여주는 BF2 P11A 막에 지역화. (B) 대장균 spheroplast 보여주는 BF2 P11A 막에 걸쳐 translocating. (C) B. megaterium 원생 동물 보여주는 BF2 P11A 막에 지역화. (D) B. megaterium 원생 동물 보여주는 BF2 P11A 막에 걸쳐 translocating. E. 콜라이 spheroplasts 및 B. megaterium protoplasts는 막 마커 디-8-ANEPPS (적색) 표시 됩니다 그리고 FITC 표시 BF2 P11A (녹색). 중간 z 스택의 이미지 63 X 확대 표시 됩니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57904/57904fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57904/57904fig5.jpg"> 그림 5: 펩 티 드 지역화 패턴의 분석. 배경 빼기 후 막 형광 강도 (투자 수익 1) 세포내 형광 강도 (ROI 2)의 비율의 (A) 배포 (ROI 2-수익 (3) / 투자 수익 1-수익 (3)) 대장균 spheroplasts 및 B. megaterium BF2 P11A 표시 protoplasts FITC와 상호 작용 하는 (B) 대장균 spheroplast BF2 P11A 표시. 원형 지역의 관심 (ROI) 0.3 µ m 직경 멤브레인 (ROI 1) 세포내 공간 (ROI 2)에 그려진 배경 (ROI 3). 펩 티 드의 형광 강도 각 ROI에 계량 하 고 배경 형광 투자 수익 1 및 ROI 2 형광 강도에서 ROI 3의 형광 강도 빼서 차지 했다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57904/57904fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>세균성 긴장</td>
			<td>롤 spheroplast 또는 원생 동물</td>
			<td>% 막 지역화</td>
			<td>% Translocating</td>
		</tr>
<tr>
<td>대장균</td>
			<td>84</td>
			<td>71</td>
			<td>29</td>
		</tr>
<tr>
<td>B. megaterium</td>
			<td>70</td>
			<td>70</td>
			<td>30</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: BF2 P11A 상호 작용의 지역화 패턴 대장균 spheroplasts 및 B. megaterium protoplasts.

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Production and Visualization of Bacterial Spheroplasts and Protoplasts to Characterize Antimicrobial Peptide Localization

여기에 우리가 그람 음성의 대장균 (대장균)를 생산 하는 프로토콜을 현재 spheroplasts 및 그람 양성 간 균 megaterium (B. megaterium) 명확 하 게 시각화 하 고 빠르게 특성 protoplasts 펩 티 드-박테리아의 상호 막 지역화 및 펩 티 드 translocating를 정의 하는 체계적인 방법을 제공 합니다.

생산 및 항균 성 펩 티 드 지역화 특성 세균 Spheroplasts Protoplasts의 시각화

The use of confocal microscopy as a method to assess peptide localization patterns within bacteria is commonly inhibited by the resolution limits of ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

11.6K 조회수.  Wellesley College. 여기에 우리가 그람 음성의 대장균 (대장균)를 생산 하는 프로토콜을 현재 spheroplasts 및 그람 양성 간 균 megaterium (B. megaterium) 명확 하 게 시각화 하 고 빠르게 특성 protoplasts 펩 티 드-박테리아의 상호 막 지역화 및 펩 티 드 translocating를 정의 하는 체계적인 방법을 제공 합니다.

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Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental stimuli in any multicellular organism. In situ hybridization and reporter gene visualization can to a limited extent be used to this end but for high resolution quantitative RT-PCR or high-throughput transcriptome-wide analysis the isolation of RNA from particular cell types is requisite. Cellular dissociation of tissue expressing a fluorescent protein marker in a specific cell type and subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) makes it possible to collect sufficient amounts of material for RNA extraction, cDNA synthesis/amplification and microarray analysis.
An extensive set of cell type-specific fluorescent reporter lines is available to the plant research community. In this case, two marker lines of the Arabidopsis thaliana root are used: PSCR::GFP (endodermis and quiescent center) and PWOX5::GFP (quiescent center). Large numbers (thousands) of seedlings are grown hydroponically or on agar plates and harvested to obtain enough root material for further analysis. Cellular dissociation of plant material is achieved by enzymatic digestion of the cell wall. This procedure makes use of high osmolarity-induced plasmolysis and commercially available cellulases, pectinases and hemicellulases to release protoplasts into solution.
FACS of GFP-positive cells makes use of the visualization of the green versus the red emission spectra of protoplasts excited by a 488 nm laser. GFP-positive protoplasts can be distinguished by their increased ratio of green to red emission. Protoplasts are typically sorted directly into RNA extraction buffer and stored for further processing at a later time.
This technique is revealed to be straightforward and practicable. Furthermore, it is shown that it can be used without difficulty to isolate sufficient numbers of cells for transcriptome analysis, even for very scarce cell types (e.g. quiescent center cells). Lastly, a growth setup for Arabidopsis seedlings is demonstrated that enables uncomplicated treatment of the plants prior to cell sorting (e.g. for the cell type-specific analysis of biotic or abiotic stress responses). Potential supplementary uses for FACS of plant protoplasts are discussed.

A method for isolating specific cell types from plant material is demonstrated. This technique employs transgenic marker lines expressing fluorescent proteins in particular cell types, cellular dissociation and Fluorescence Activated Cell Sorting. Additionally, a growth setup is established here that facilitates treatment of Arabidopsis thaliana seedlings prior to cell sorting.

식물 Protoplasts의 형광 활성 세포 정렬

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

연구

생물학

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

이온 채널의 돌연변이 유발과 기능 분석 Heterologously 포유 동물 세포에 표현

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Nano-fEM: Protein Localization Using Photo-activated Localization Microscopy and Electron Microscopy

Mapping the distribution of proteins is essential for understanding the function of proteins in a cell. Fluorescence microscopy is extensively used for protein localization, but subcellular context is often absent in fluorescence images. Immuno-electron microscopy, on the other hand, can localize proteins, but the technique is limited by a lack of compatible antibodies, poor preservation of morphology and because most antigens are not exposed to the specimen surface. Correlative approaches can acquire the fluorescence image from a whole cell first, either from immuno-fluorescence or genetically tagged proteins. The sample is then fixed and embedded for electron microscopy, and the images are correlated 1-3. However, the low-resolution fluorescence image and the lack of fiducial markers preclude the precise localization of proteins. 
Alternatively, fluorescence imaging can be done after preserving the specimen in plastic. In this approach, the block is sectioned, and fluorescence images and electron micrographs of the same section are correlated 4-7. However, the diffraction limit of light in the correlated image obscures the locations of individual molecules, and the fluorescence often extends beyond the boundary of the cell. 
Nano-resolution fluorescence electron microscopy (nano-fEM) is designed to localize proteins at nano-scale by imaging the same sections using photo-activated localization microscopy (PALM) and electron microscopy. PALM overcomes the diffraction limit by imaging individual fluorescent proteins and subsequently mapping the centroid of each fluorescent spot 8-10. 
We outline the nano-fEM technique in five steps. First, the sample is fixed and embedded using conditions that preserve the fluorescence of tagged proteins. Second, the resin blocks are sectioned into ultrathin segments (70-80 nm) that are mounted on a cover glass. Third, fluorescence is imaged in these sections using the Zeiss PALM microscope. Fourth, electron dense structures are imaged in these same sections using a scanning electron microscope. Fifth, the fluorescence and electron micrographs are aligned using gold particles as fiducial markers. In summary, the subcellular localization of fluorescently tagged proteins can be determined at nanometer resolution in approximately one week.

We describe a method to localize fluorescently tagged proteins in electron micrographs. Fluorescence is first localized using photo-activated localization microscopy on ultrathin sections. These images are then aligned to electron micrographs of the same section.

나노 FEM : 사진 활성화 된 현지화 현미경과 전자 현미경을 사용하여 단백질 현지화

Mapping the distribution of proteins is essential for understanding the function of proteins in a cell. Fluorescence microscopy is extensively used for ...

Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate

Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both mitochondrial (respiration) and non-mitochondrial (other redox) reactions consume oxygen, but these reactions can be easily distinguished by chemical inhibition of mitochondrial respiration. However, while mitochondrial oxygen consumption is an unambiguous and direct measurement of respiration rate2, the same is not true for extracellular acid production and its relationship to glycolytic rate 3-6. Extracellular acid produced by cells is derived from both lactate, produced by anaerobic glycolysis, and CO2, produced in the citric acid cycle during respiration. For glycolysis, the conversion of glucose to lactate- + H+ and the export of products into the assay medium is the source of glycolytic acidification. For respiration, the export of CO2, hydration to H2CO3 and dissociation to HCO3- + H+ is the source of respiratory acidification. The proportions of glycolytic and respiratory acidification depend on the experimental conditions, including cell type and substrate(s) provided, and can range from nearly 100% glycolytic acidification to nearly 100% respiratory acidification 6. Here, we demonstrate the data collection and calculation methods needed to determine respiratory and glycolytic contributions to total extracellular acidification by whole cells in culture using C2C12 myoblast cells as a model.

Glycolysis is a defining metabolic marker in multiple biological systems. Monitoring glycolysis by measuring the extracellular flux of H+ is common, but requires correction to be quantitative and unambiguous. Here, we demonstrate how to gather and correct extracellular flux data to distinguish between respiratory and glycolytic sources of extracellular acidification.

세포 외 산 생산의 측정 및 분석은 당분 속도를 확인하는

Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both ...

Targeted RNA Sequencing Assay to Characterize Gene Expression and Genomic Alterations

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding RNAs. Standard RNAseq requires 30 - 100 million sequencing reads and can include multiple RNA products such as mRNA and noncoding RNAs. We demonstrate how targeted RNAseq (capture) permits a focused study on selected RNA products using a desktop sequencer. RNAseq capture can characterize unannotated, low, or transiently expressed transcripts that may otherwise be missed using traditional RNAseq methods. Here we describe the extraction of RNA from cell lines, ribosomal RNA depletion, cDNA synthesis, preparation of barcoded libraries, hybridization and capture of targeted transcripts and multiplex sequencing on a desktop sequencer. We also outline the computational analysis pipeline, which includes quality control assessment, alignment, fusion detection, gene expression quantification and identification of single nucleotide variants. This assay allows for targeted transcript sequencing to characterize gene expression, gene fusions, and mutations.

We describe a targeted RNA sequencing-based method that includes preparation of indexed cDNA libraries, hybridization and capture with custom probes and data analysis to interrogate selected transcripts for gene expression, mutations, and gene fusions. Targeted RNAseq permits cost-effective, rapid evaluation of selected transcripts on a desktop sequencer.

RNA 시퀀싱 분석은 유전자 발현 및 게놈 변경을 특성화를 대상으로

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding ...

Visualization of Surface-tethered Large DNA Molecules with a Fluorescent Protein DNA Binding Peptide

Large DNA molecules tethered on the functionalized glass surface have been utilized in polymer physics and biochemistry particularly for investigating interactions between DNA and its binding proteins. Here, we report a method that uses fluorescent microscopy for visualizing large DNA molecules tethered on the surface. First, glass coverslips are biotinylated and passivated by coating with biotinylated polyethylene glycol, which specifically binds biotinylated DNA via avidin protein linkers and significantly reduces undesirable binding from non-specific interactions of proteins or DNA molecules on the surface. Second, the DNA molecules are biotinylated by two different methods depending on their terminals. The blunt ended DNA is tagged with biotinylated dUTP at its 3' hydroxyl terminus, by terminal transferase, while the sticky ended DNA is hybridized with biotinylated complimentary oligonucleotides by DNA ligase. Finally, a microfluidic shear flow makes single DNA molecules stretch to their full contour lengths after being stained with fluorescent protein-DNA binding peptide (FP-DBP).

We present an approach for visualizing fluorescent protein DNA binding peptide (FP-DBP)-stained large DNA molecules tethered on the polyethylene glycol (PEG) and avidin-coated glass surface and stretched with microfluidic shear flows.

펩타이드를 결합 형광 단백질 DNA와 표면 닿는 큰 DNA 분자의 시각화

Large DNA molecules tethered on the functionalized glass surface have been utilized in polymer physics and biochemistry particularly for investigating ...

Utilizing pHluorin-tagged Receptors to Monitor Subcellular Localization and Trafficking

Understanding membrane protein trafficking, assembly, and expression requires an approach that differentiates between those residing in intracellular organelles and those localized on the plasma membrane. Traditional fluorescence-based measurements lack the capability to distinguish membrane proteins residing in different organelles. Cutting edge methodologies transcend traditional methods by coupling pH-sensitive fluorophores with total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM). TIRF illumination excites the sample up to approximately 150 nm from the glass-sample interface, thus decreasing background, increasing the signal to noise ratio, and enhancing resolution. The excitation volume in TIRFM encompasses the plasma membrane and nearby organelles such as the peripheral ER. Superecliptic pHluorin (SEP) is a pH sensitive version of GFP. Genetically encoding SEP into the extracellular domain of a membrane protein of interest positions the fluorophore on the luminal side of the ER and in the extracellular region of the cell. SEP is fluorescent when the pH is greater than 6, but remains in an off state at lower pH values. Therefore, receptors tagged with SEP fluoresce when residing in the endoplasmic reticulum (ER) or upon insertion in the plasma membrane (PM) but not when confined to a trafficking vesicle or other organelles such as the Golgi. The extracellular pH can be adjusted to dictate the fluorescence of receptors on the plasma membrane. The difference in fluorescence between TIRF images at neutral and acidic extracellular pH for the same cell corresponds to a relative number of receptors on the plasma membrane. This allows a simultaneous measurement of intracellular and plasma membrane resident receptors. Single vesicle insertion events can also be measured when the extracellular pH is neutral, corresponding to a low pH trafficking vesicle fusing with the plasma membrane and transitioning into a fluorescent state. This versatile technique can be exploited to study localization, expression, and trafficking of membrane proteins.

Labeling the extracellular domain of a membrane protein with a pH sensitive fluorophore, superecliptic pHluorin (SEP), allows subcellular localization, expression, and trafficking to be determined. Imaging SEP-labeled proteins with total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM) enables the quantification of protein levels in the peripheral ER and plasma membrane.

pHluorin 태그가 수용체를 활용하여하는 세포 현지화 및 인신 매매를 모니터링하기

Understanding membrane protein trafficking, assembly, and expression requires an approach that differentiates between those residing in intracellular ...

Measuring Endoreduplication by Flow Cytometry of Isolated Tuber Protoplasts

Endoreduplication, the replication of a cell's nuclear genome without subsequent cytokinesis, yields cells with increased DNA content and is associated with specialization, development and increase in cellular size. In plants, endoreduplication seems to facilitate the growth and expansion of certain tissues and organs. Among them is the tuber of potato (Solanum tuberosum), which undergoes considerable cellular expansion in fulfilling its function of carbohydrate storage. Thus, endoreduplication may play an important role in how tubers are able to accommodate this abundance of carbon. However, the cellular debris resulting from crude nuclear isolation methods of tubers, methods that can be used effectively with leaves, precludes the estimation of the tuber endoreduplication index (EI). This article presents a technique for assessing tuber endoreduplication through the isolation of protoplasts while demonstrating representative results obtained from different genotypes and compartmentalized tuber tissues. The major limitations of the protocol are the time and reagent costs required for sample preparation as well as relatively short lifespan of samples after lysis of protoplasts. While the protocol is sensitive to technical variation, it represents an improvement over traditional methods of nuclear isolation from these large specialized cells. Possibilities for improvements to the protocol such as recycling enzyme, the use of fixatives, and other alterations are proposed.

The protocol described herein is a method for measuring endoreduplication within tubers of potato (Solanum tuberosum). It includes plasmolysis and protoplast extraction steps to decrease the noise and debris in downstream flow cytometric analysis.

격리 된 괴 경 Protoplasts의 Cytometry에 의해 측정 Endoreduplication

Endoreduplication, the replication of a cell's nuclear genome without subsequent cytokinesis, yields cells with increased DNA content and is associated ...

A Simple Method for Isolation of Soybean Protoplasts and Application to Transient Gene Expression Analyses

Soybean (Glycine max (L.) Merr.) is an important crop species and has become a legume model for the studies of genetic and biochemical pathways. Therefore, it is important to establish an efficient transient gene expression system in soybean. Here, we report a simple protocol for the preparation of soybean protoplasts and its application for transient functional analyses. We found that young unifoliate leaves from soybean seedlings resulted in large quantities of high quality protoplasts. By optimizing a PEG-calcium-mediated transformation method, we achieved high transformation efficiency using soybean unifoliate protoplasts. This system provides an efficient and versatile model for examination of complex regulatory and signaling mechanisms in live soybean cells and may help to better understand diverse cellular, developmental and physiological processes of legumes.

We developed a simple and efficient protocol for the preparation of large quantities of soybean protoplasts to study complex regulatory and signaling mechanisms in live cells.

콩 Protoplasts 및 변이 유전자 표정 분석 응용 프로그램의 격리에 대 한 간단한 방법

Soybean (Glycine max (L.) Merr.) is an important crop species and has become a legume model for the studies of genetic and biochemical pathways. ...

Assessment of Zebrafish Lens Nucleus Localization and Sutural Integrity

The zebrafish is uniquely suited to genetic manipulation and in vivo imaging, making it an increasingly popular model for reverse genetic studies and for generation of transgenics for in vivo imaging. These unique capabilities make the zebrafish an ideal platform to study ocular lens development and physiology. Our recent findings that an Aquaporin-0, Aqp0a, is required for stability of the anterior lens suture, as well as for the shift of the lens nucleus to the lens center with age led us to develop tools especially suited to analyzing the properties of zebrafish lenses. Here we outline detailed methods for lens dissection that can be applied to both larval and adult lenses, to prepare them for histological analysis, immunohistochemistry and imaging. We focus on analysis of lens suture integrity and cortical cell morphology and compare data generated from dissected lenses with data obtained from in vivo imaging of lens morphology made possible by a novel transgenic zebrafish line with a genetically encoded fluorescent marker. Analysis of dissected lenses perpendicular to their optical axis allows quantification of the relative position of the lens nucleus along the anterior-posterior axis. Movement of the lens nucleus from an initial anterior position to the center is required for normal lens optics in adult zebrafish. Thus, a quantitative measure of lens nuclear position directly correlates with its optical properties.

These protocols were developed to analyze cortical lens morphology, structural integrity of the zebrafish lens sutures in fixed and live lenses and to measure the position of the zebrafish lens nucleus along the anterior-posterior axis.

제 브라 피쉬 렌즈의 평가 핵 현지화 및 조직 무결성

The zebrafish is uniquely suited to genetic manipulation and in vivo imaging, making it an increasingly popular model for reverse genetic studies and for ...