Yazarlar personeli sitometresi tesisi (Cytocell) ve Üniversite Hastanesi hayvan tesis (UTE) Nantes hayvan yetiştirme ve bakım, hücresel ve tissular çekirdek tesis Nantes Üniversitesi (MicroPICell) görüntüleme için görüntüleme için Nantes teşekkür uzman teknik yardım. Bu eser INSERM, CNRS, Université de Nantes, Institut National du kanser (Inca #PLBio2014-155), Ligue Nationale contre le kanser (AO Bölgelerarası 2017) ve Avrupa konsorsiyumu dönemi-Net Transcan2 tarafından finanse edildi (Immunoglio). Takım Fondation pour la Recherche Medicale (DEQ20170839118) tarafından finanse edilmektedir. Bu eser IGO LabEX bağlamında gerçekleşmiştir ve IHU Cesti programları, desteklenen Ulusal Araştırma Ajansı Investissements d'Avenir yolu ile tarafından programları ANR-11-LABX-0016-01 ve ANR-10-IBHU-005, anılan sıraya göre. IHU Cesti projesi de Nantes Metropole ve Pays de la Loire bölgesi tarafından desteklenmektedir. Yazarlar Chirine Rafia el yazması düzeltmek yardım sağlamak için teşekkür ederiz.

Aşağıdaki yordam içeren hayvan konular (anlaşma #00186.02; Pays de la Loire [Fransa] bölgesel Etik Komitesi) Kurumsal kurallarına göre gerçekleştirilen. İnsan PBMCs bilinçli sağlıklı bağış (Etablissement Français du Sang Nantes, Fransa) toplanan kan gelen izole edildi. Tüm adımlar steril koşullarda gerçekleştirilir.
1. non-spesifik sitotoksik efektör T lenfositler genişlemesi
<ol><li>Hazırlamak ve besleyici hücreler, 35 Gy ışınlatayım. 2 x 105 - 4 x 105 efektör hücreleri, uyarılması için 10 x 106 PBMCs ve 1 x 106 BLCLs üç farklı ve sağlıklı bağışçılardan hazırlayın.</li>
	<li>Besleyici hücreler ve % 10 FCS ısı inaktive, 2 mM L-glutamin, penisilin (100 IU/mL) ve streptomisin (0.1 µg/mL) ve 300 IU/mL rekombinant IL-2 takıma RPMI 15 mL efektör hücrelere resuspend.</li>
	<li>PHA-L 1 µg/mL nihai bir konsantrasyon eklemek, dikkatlice karıştırın ve hücre süspansiyon 96-şey U popolu plakaları bir kuyu başına 150 µL dağıtmak.</li>
	<li>37 ° C'de ve oksijen bir atmosferde % 5 CO2 kuluçkaya.</li>
	<li>Büyük hücreli kültür wells formunda kümeler kadar günlük plaka kontrol (~ 7 gün).</li>
	<li>Hücreleri 1 x 106 hücre/mL taze kültür ortamında, bir kültür şişesi içine aktarın.</li>
	<li>(2 bir hafta x) sayarak toplam cep numarasını belirlemek ve taze kültür ortamında 1 x 106 hücre/mL proje. Not: Efektör bağışıklık hücreleri dinlenme State (genellikle 3 hafta sonra ilk amplifikasyon uyarıcı) tedavi yönetim için hazır olmalıdır. Saflık ve reaktivite bu efektör hücreler in vivo enjeksiyonları (Örneğin, vitro deneyleri ile) önce kontrol edilmelidir.</li>
</ol>2. pre-operative efektör hücreleri hazırlık
<ol><li>Efektör hücre sayısı kontrol ettikten sonra 50 mL tüp efektör hücrelerde Santrifüjü (300 x g 5 min için) tarafından toplamak. Not: aşırı hücre (Örneğin, 50 x 106) için herhangi bir kaybı telafi etmek için hazır olun.</li>
	<li>Dikkatle süpernatant kaldırmak ve 15 mL steril PBS ve 300 x g de 5 dk santrifüj yıkama gerçekleştirmek için hücrelerde resuspend.</li>
	<li>Dikkatli bir şekilde ve tamamen süpernatant kaldırın ve sonra hücre pelet 1 mL steril PBS resuspend.</li>
	<li>Santrifüjü 300 x g 5 min için de için 1.5 mL microtube resuspended hücrelerde aktarın.</li>
	<li>Yavaş yavaş pipetting tarafından dikkatli bir şekilde ve tamamen süpernatant kaldırın.</li>
	<li>Hücre Pelet fare başına steril PBS 8 µL resuspend. Not: Bu kritik bir adımdır.</li>
	<li>Hücre süspansiyon hacmi bir micropipette kullanarak ölçün. Gerekirse, steril PBS (PBS 15 µL doz başına 20 x 106 hücreler) ve dikkatlice karıştırın.</li>
	<li>, 15 ve 20 μL (imperatively < 20 µL) arasında fare başına son birimdir micropipette, kullanarak kontrol edin.</li>
	<li>Buz hücrelerdeyse stereotaksik enjeksiyon kadar tutun. Not: daha 3 h timepoints test değil.</li>
</ol>3. stereotaksik enjeksiyon
<ol><li>
Ekipman kurulumu
	<ol>
<li>Bir araya getiren ve küçük bir hayvan stereotaksik kare kafa içi enjeksiyonları (Örneğin, şırınga boyutu, istenen birim ve enjeksiyon oranı) doğruluğunu sağlamak için üreticinin yönergelerine göre kalibre. Not: Yavaş infüzyon hızı (Örneğin, 2-3 µL/dak) önerilir.</li>
		<li>Mikrobiyal emanet dolabı (MSC) kısırlık araçlarının bakımını ve fareler korumak için altında malzeme bulaşan yükleyin. Not: yer "izotermal blok" 37 ° C'de bir su banyosunda Bu sistem, ameliyat sırasında fareler hipotermi sınırlar. Yastıkları, sonrası yordam bakımı için gerekli olan Isıtma sürekli sıcaklık izleme sırasında kullanılmalıdır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Pre-operative hayvan hazırlık
	<ol>
<li>Bir fare ketamin (10 mg/mL) ve xylazine (0.1 mg/mL) 10 µL/g fare vücut ağırlığının, mayi enjeksiyonu ile anestezi.</li>
		<li>Tam anestezi ve analjezi Hayvan emin olmak için bir ayak çimdik testi gerçekleştirin. Not: Herhangi bir hareket derin olmayan analjezi bir göstergesidir ve bu durum ortaya çıkarsa, bir kaç dakika daha işlem tekrarlanmadan önce gereklidir.</li>
		<li>Sonra fare düzgün anestezi, makas (arasında iki kulak, burun kadar) cerrahi sitesinden kürk kaldırmak için kullanabilirsiniz.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Pre-operative hücre hazırlık
	<ol>
<li>Dikkatli bir pipet hücrelerle topaklanma herhangi bir hücreyi önlemek için önce her iğne (birkaç kez) resuspend.</li>
		<li>Dikkatle gerekli hücre süspansiyon birim (15-20 µL) kabarcıklar aspirasyon önlemek için 22-G microsyringe çizin. Not: Bu hücre-yükleme adım içine microsyringe enjekte birimleri'deki en aza indirmek önemlidir. Hücreler arasında yordamlar topaklanma herhangi bir hücreyi engellemek ve efektör hücreleri yönetim kohort çift sayıda sağlamak için tek tek her enjeksiyon için yeniden yükleyin.</li>
		<li>O zaman, belgili tanımlık tenkıye adapte şırınga pompa yerleştirin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Yordam bakım
	<ol>
<li>Cerrahi sitesi povidone-iyot %5 çözüm en az 3 batırılmış temizleme bezi ile dezenfekte x.</li>
		<li>Yağlama oftalmik merhem herhangi bir kornealar kurutma önlemek için fareyi'nın gözlerinin içine yerleştirin.</li>
		<li>Pozisyon stereotaksik karede sıcak izotermal blok imzalat fare fare ısısını ameliyat sırasında korumak ve mortalite sınırlamak için steril bir plastik film ile kaplı. Not: Fare burun ve diş uygun şekilde işlem sırasında yeterli solunum akışını sağlamak için diş çubuğunun üzerinde konumlandırılmış olmalıdır.</li>
		<li>Fare diş çubuğunun üzerinde konumlandırılmış bir kez sıkıca fare kulaklar kafa hareketsiz altında kulak çubuklarını sıkın. Not: kulak zarı zarar vermemeye veya solunum uzlaşmaya dikkat et.</li>
		<li>1-2 cm ensizyon sagittal cilt kafatası kafatası ortaya çıkarmak için posterior anterior üst kısmı boyunca steril makasla olun.</li>
		<li>Sagittal ve koronal sütür (Bregma) ( Şekil 1' de gösterilen) enjeksiyon önce stereotaksik yerelleştirme için simge olarak hizmet verecek kesişimi tanımlayın.</li>
		<li>Bu noktada yukarıda microsyringe bir yer.</li>
		<li>2 mm sağ yanal ve 0,5 mm Bregma ön microsyringe taşıyın.</li>
		<li>Bir microdrill kullanarak, önceden belirlenen koordinatları steril bir matkap ile kafatası içinde küçük bir delik açmak. Beynin herhangi bir travmatik yaralanmayı önlemek için yüzeysel kalması için dikkatli olun. Not: Bu protokol için kurulan bir tümör (bir hafta sonra tümör hücre enjeksiyon) içinde bağışıklık hücreleri enjekte edildi. Deri yeniden (skar) ve enjeksiyon olmalıdır (delik genellikle hala enjeksiyon sonra 2 hafta kadar mevcut) tümör hücre implantasyonu için kullanılan aynı koordinatlarda gerçekleştirilir. Koordinatları beyin parankimi13,14tümör ve efektör hücrelere enjekte için seçildi.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Enjeksiyon bağışıklık efektör hücrelerin
	<ol>
<li>Dikkatle microsyringe delinmiş deliğe yerleştirin ve yavaş hareket, beyin zarı içinde aşağı 3 mm ve sonra geriye doğru 0,5 mm son derinliğe kadar efektör hücreleri enjekte önce 2.5 mm iğne iletmek.</li>
		<li>2-3 µL/dak efektör hücre enjeksiyon çalıştırın ve enjeksiyon süresi boyunca fareler izleme.</li>
		<li>Enjeksiyon işlemi tamamlandıktan sonra yalnızca 1 mm için iğne geri çekilin ve yavaş yavaş tamamen çekilmesi infüzyon sitesinden herhangi bir sızıntı önlemek için microsyringe, önce bir dakika için microsyringe tutmak. Not: hayvan stereotaksik aygıttan kaldırılmasını, hemen enjeksiyon donanımları yaklaşan deneyler için temiz.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Ameliyat sonrası bakım ve takip fare
	<ol>
<li>Hayvan stereotaksik çerçevesinden kaldırın ve hemen povidone-iyot %5 çözüm kesi sitede uygulamak ve uygun bir cerrahi sütür ile cildi kapatmak.</li>
		<li>%2 lidokain jel doğrudan yaraya uygulayın ve buprenorfin 0.15 µg/g tarafından Subkutan Enjeksiyon sonrası yordam analjezi için yönetmek.</li>
		<li>Yer geri onun kafes bir ısıtma yastığı yukarıda imzalat fare 37 ° C için uygun fare vücut ısısını korumak için ve herhangi bir hipotermi önlemek için ayarlayın. Not: Ayrı konut gerekli değildir.</li>
		<li>Anesteziden tamamen iyileşti kadar fareyi izlemek ve konut odasına aktar. Not: birkaç beklenmedik komplikasyonlar (< %5 enjekte farelerin) meydana gelmiş gibi bugüne kadar bu protokolü de desteklenir.</li>
		<li>Her gün fareler izlemek ve azalan herhangi bir sağlık işaretleri (Örneğin, Kambur duruş, hareketliliğin, secde veya önemli vücut kilo kaybı [≥ % 15]) gözlendiğinde onları ötenazi.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Stupp, R., Roila, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malignant+glioma:+ESMO+clinical+recommendations+for+diagnosis,+treatment+and+follow-up.">Malignant glioma: ESMO clinical recommendations for diagnosis, treatment and follow-up.</a> Annals of Oncology. 20 Suppl 4, 126-128 (2009).</li><li>Weller, M., Cloughesy, T., Perry, J. R., Wick, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standards+of+care+for+treatment+of+recurrent+glioblastoma--are+we+there+yet?.">Standards of care for treatment of recurrent glioblastoma--are we there yet?.</a> Neuro-Oncology. 15 (1), 4-27 (2013).</li><li>Chen, S. H., Shine, H. D., Goodman, J. C., Grossman, R. G., Woo, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+for+brain+tumors:+regression+of+experimental+gliomas+by+adenovirus-mediated+gene+transfer+in+vivo.">Gene therapy for brain tumors: regression of experimental gliomas by adenovirus-mediated gene transfer in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (8), 3054-3057 (1994).</li><li>Choi, P. J., Tubbs, R. S., Oskouian, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+Cellular+Therapies+for+Glioblastoma+Multiforme.">Emerging Cellular Therapies for Glioblastoma Multiforme.</a> Cureus. 10 (3), e2305 (2018).</li><li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+and+Therapy+of+Glioblastoma+in+a+Mouse+Model+Using+Exosomes+Derived+From+Natural+Killer+Cells.">Targeting and Therapy of Glioblastoma in a Mouse Model Using Exosomes Derived From Natural Killer Cells.</a> Frontiers in Immunology. 9, 824 (2018).</li><li>Chung, D. S., Shin, H. J., Hong, Y. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+hope+in+immunotherapy+for+malignant+gliomas:+adoptive+T+cell+transfer+therapy.">A new hope in immunotherapy for malignant gliomas: adoptive T cell transfer therapy.</a> Journal of Immunology Research. 2014, 326545 (2014).</li><li>Vauleon, E., Avril, T., Collet, B., Mosser, J., Quillien, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+cellular+immunotherapy+for+patients+with+glioblastoma.">Overview of cellular immunotherapy for patients with glioblastoma.</a> Clinical and Developmental Immunology. 2010, (2010).</li><li>Brown, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regression+of+Glioblastoma+after+Chimeric+Antigen+Receptor+T-Cell+Therapy.">Regression of Glioblastoma after Chimeric Antigen Receptor T-Cell Therapy.</a> The New England of Journal of Medicine. 375 (26), 2561-2569 (2016).</li><li>Jarry, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereotaxic+administrations+of+allogeneic+human+Vgamma9Vdelta2+T+cells+efficiently+control+the+development+of+human+glioblastoma+brain+tumors.">Stereotaxic administrations of allogeneic human Vgamma9Vdelta2 T cells efficiently control the development of human glioblastoma brain tumors.</a> Oncoimmunology. 5 (6), e1168554 (2016).</li><li>Dutoit, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploiting+the+glioblastoma+peptidome+to+discover+novel+tumour-associated+antigens+for+immunotherapy.">Exploiting the glioblastoma peptidome to discover novel tumour-associated antigens for immunotherapy.</a> Brain. 135 (Pt 4), 1042-1054 (2012).</li><li>Joalland, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-21+Increases+the+Reactivity+of+Allogeneic+Human+Vgamma9Vdelta2+T+Cells+Against+Primary+Glioblastoma+Tumors.">IL-21 Increases the Reactivity of Allogeneic Human Vgamma9Vdelta2 T Cells Against Primary Glioblastoma Tumors.</a> Journal of Immunotherapy. 41 (5), 224-231 (2018).</li><li>Clemenceau, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effector+memory+alphabeta+T+lymphocytes+can+express+FcgammaRIIIa+and+mediate+antibody-dependent+cellular+cytotoxicity.">Effector memory alphabeta T lymphocytes can express FcgammaRIIIa and mediate antibody-dependent cellular cytotoxicity.</a> The Journal of Immunology. 180 (8), 5327-5334 (2008).</li><li>Abdelwahab, M. G., Sankar, T., Preul, M. C., Scheck, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracranial+implantation+with+subsequent+3D+in+vivo+bioluminescent+imaging+of+murine+gliomas.">Intracranial implantation with subsequent 3D in vivo bioluminescent imaging of murine gliomas.</a> Journal of Visualized Experiments. (57), e3403 (2011).</li><li>Jarry, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treg+depletion+followed+by+intracerebral+CpG-ODN+injection+induce+brain+tumor+rejection.">Treg depletion followed by intracerebral CpG-ODN injection induce brain tumor rejection.</a> Journal of Neuroimmunology. 267 (1-2), 35-42 (2014).</li><li>June, C. H., O'Connor, R. S., Kawalekar, O. U., Ghassemi, S., Milone, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAR+T+cell+immunotherapy+for+human+cancer.">CAR T cell immunotherapy for human cancer.</a> Science. 359 (6382), 1361-1365 (2018).</li><li>Baruch, E. N., Berg, A. L., Besser, M. J., Schachter, J., Markel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptive+T+cell+therapy:+An+overview+of+obstacles+and+opportunities.">Adoptive T cell therapy: An overview of obstacles and opportunities.</a> Cancer. 123 (S11), 2154-2162 (2017).</li><li>Bryant, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+immunotherapeutic+potential+of+gammadelta+T-cells+in+patients+with+glioblastoma.">Characterization and immunotherapeutic potential of gammadelta T-cells in patients with glioblastoma.</a> Neuro-Oncology. 11 (4), 357-367 (2009).</li><li>Pereboeva, L., Harkins, L., Wong, S., Lamb, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+safety+of+allogeneic+innate+lymphocyte+therapy+for+glioma+patients+with+prior+cranial+irradiation.">The safety of allogeneic innate lymphocyte therapy for glioma patients with prior cranial irradiation.</a> Cancer Immunology, Immunotherapy. 64 (5), 551-562 (2015).</li><li>Bailey, S. L., Carpentier, P. A., McMahon, E. J., Begolka, W. S., Miller, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+and+adaptive+immune+responses+of+the+central+nervous+system.">Innate and adaptive immune responses of the central nervous system.</a> Critical Reviews in Immunology. 26 (2), 149-188 (2006).</li><li>Louveau, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+features+of+central+nervous+system+lymphatic+vessels.">Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels.</a> Nature. 523 (7560), 337-341 (2015).</li><li>Menei, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+and+sustained+delivery+of+5-fluorouracil+from+biodegradable+microspheres+for+the+radiosensitization+of+glioblastoma:+a+pilot+study.">Local and sustained delivery of 5-fluorouracil from biodegradable microspheres for the radiosensitization of glioblastoma: a pilot study.</a> Cancer. 86 (2), 325-330 (1999).</li><li>Menei, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereotaxic+implantation+of+5-fluorouracil-releasing+microspheres+in+malignant+glioma.">Stereotaxic implantation of 5-fluorouracil-releasing microspheres in malignant glioma.</a> Cancer. 100 (2), 405-410 (2004).</li><li>Salot, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+scale+expansion+of+gamma+9+delta+2+T+lymphocytes:+Innacell+gamma+delta+cell+therapy+product.">Large scale expansion of gamma 9 delta 2 T lymphocytes: Innacell gamma delta cell therapy product.</a> Journal of Immunological Methods. 326 (1-2), 63-75 (2007).</li><li>Bennouna, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase-I+study+of+Innacell+gammadelta,+an+autologous+cell-therapy+product+highly+enriched+in+gamma9delta2+T+lymphocytes,+in+combination+with+IL-2,+in+patients+with+metastatic+renal+cell+carcinoma.">Phase-I study of Innacell gammadelta, an autologous cell-therapy product highly enriched in gamma9delta2 T lymphocytes, in combination with IL-2, in patients with metastatic renal cell carcinoma.</a> Cancer Immunology, Immunotherapy. 57 (11), 1599-1609 (2008).</li><li>Singh, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+human+brain+tumour+initiating+cells.">Identification of human brain tumour initiating cells.</a> Nature. 432 (7015), 396-401 (2004).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bir evlat edinen transferini yerli seçilen veya mühendislik bağışıklık efektör hücreleri temsil eden verimli tümör hücreleri dönüştürülmüş15karşı ayrıntıları sınırlayıcı dikkat çekici infiltrative beyin kanser gibi tedavisi için umut verici bir yaklaşım, 16,17,18. Ancak, beyin oluşur, merkezi sinir sistemi, kan - beyin bariyerini varlığını ve klasik lenfatik drenaj sistemi19,20eksikliği nedeniyle özellikle özel bir bağışıklık durumu olduğunu. Bu fizyolojik özellikleri doku ticareti etkileyen ve sistemik bağışıklık hücreleri enjeksiyonlari tehlikeye atabilir. Bu engelleri aşmak için intraparenchymal enjeksiyonları antitümör hücreler yerine yerel olarak, yakından farmakolojik bileşikler21, içeren mikroküreler gelince tümör site teslim edilir ve prensip olarak araştırılmalıdır 22. bir yandan organ içinde lenfositlerin sınırlı seyreltme antitümör onların verimliliği artırmak, ama aynı zamanda zararlı mekanik veya tümör adaptasyon gibi efektler beyin geliştirme tissular sıkıştırma yükseltmek tümör büyüme. Bu Bu yordam küçük hacimli immunotherapeutic enjeksiyonu gerekir anlamına gelir. Hangi beyinde tümör cerrahi olarak eksize olamaz hayvan deneysel modellerinde daha kritik bir konudur. Bu makalede bir tedavi yaklaşımı hazırlık ve beyin tümörü özgü hücresel effectors, allojeneik insan T lenfositler stereotaktik injection(s) üzerinde tabanlı yerel teslimat için.
Bu çalışmada hazırlık ve allojenik insan Vϒ9Vδ2 T lenfositler stereotaksik teslimini insan GBM xenografts taşıyan immünyetmezligi NSG farelerde gösterir. Bu iletişim kuralı ilk aşaması allojeneik T lenfositler PBMCs sağlıklı donör dan yükseltecek, büyük miktarlarda saf efektör T lenfositleri üretir standart bir nonspesifik PHA-besleyiciler-IL2 stimülasyon kullanılarak, izin için basit bir yordam açıklanır onların kullanımı kullanımı23,24. Bu makalenin ikinci aşama hazırlık T lenfosit süspansiyonlar stereotaksik yönetim gün istirahat odaklanır. Belirli bir odak canlılığı ve seçili efektör T lenfosit fonksiyon etkilememelidir yüksek hücresel yoğunluk gerektirir bu önemli bir adım yerleştirildi. Son olarak, in vivo deneyler ile ilgili efektör T lenfositler ve onların enjeksiyon tümör çekirdek içinde hazırlanması sadece vurgulayarak aynı zamanda çevre beyin dokular, tümör içinde onların yayılması ile ilişkili onların belirli yetenek devriye ve invaziv tümör hücreleri izlemek için. Önemlisi, bu hazırlık ve enjeksiyon yöntemleri bu T lenfositler beyin beyin tümör hücreleri belirli bir tanıma üzerine içinde etkinleştirilmesi yeteneğini korumak. Özet olarak, bu çekici özellikleri özellikle T lenfositler için yetenek sağlamak ve verimli bir şekilde hedef ve GBM25damgasını olan derin infiltrative Beyin tümör hücreleri ortadan kaldırmak. Notun, efektör hücre sızıntıları veya enjeksiyon ve microsyringe kaldırılması sırasında herhangi bir beyin lezyon en aza indirmek için alınması gereken özel bir bakım vardır.
Sonuç olarak, bu makalede insan Vϒ9Vδ2T lenfositler, beyin tümörleri çevresinde içinde dinlenme gibi allojeneik insan anti-tümör lenfositler, büyük miktarda teslim etmek için verimli bir yordam açıklanır. Önemlisi, tedavi bu yordamın yan etkileri (Örneğin, canlılığı, reaktivite) aktarılan T lenfositler veya beyin dokuları ile eşlik değil. Son çalışmalar, birincil insan GBM, fare orthotopic modelleri alan Vϒ9Vδ2T lenfosit verimli GBM hücreleri derin beyin parankimi9,11sızdığı tümör hücreleri de dahil olmak üzere, hedef gösterdi. Bu öğeleri orthotopic beyin tümörü taşıyan fareler ve sonra GBM hastalarda klinik çalışmalarda ilk etapta uygulanan olabilir roman evlat edinen T lenfositler transfer yordamlar gelişimi için fırsatlar açık.

(Kim IV tümörü grade) GBM erişkinlerde en sık ve agresif birincil beyin kanseri var. Cerrahi ve radyo-kemoterapi birleştirir agresif tedaviler rağmen GBM son derece kötü prognoz (medyan sağkalım 14.6 ay ve % 2-yılı-ölüm > 73)1ile ilişkili olarak kalır. Bu kaç etkili tedavi gelişmeler üzerinde son on yılda2doğrulandıktan kanıtlamaktadır. Daha etkili tedavi stratejileri3,4,5tasarımı için adaylar arasında immunotherapies6 Şu anda incelenmiştir izlemek ve son derece invaziv ve radyo/kemoterapi dayanıklı tümör ortadan kaldırmak için hücreleri, hızlı ve ölümcül tümörün nüks7anahtar katkılarından dolayı şüpheli. Çeşitli potansiyel immünolojik hedefleri belirlendi ve için önerilen immunotherapies, doğal içeren veya değiştirilmiş αβ veya ϒδ T lenfositler GBM özgü tümör antijenleri veya stres kaynaklı molekülleri8,9gibi olduğunu, 10. Seçili GBM reaktif bağışıklık hücre effectors yönetmek için olasılık efektör lenfositler yüksek miktarlarda kalıntı malignite siteye doğrudan sunmak için eşsiz bir fırsat temsil eder. Bu strateji desteklemek için biz son zamanlarda orthotopic birincil insan GBM xenografts sadakatle taşıyan immünyetmezligi fareler üzerinde temel modelleri beyin tümörleri GBM hastaların9,11' deki gelişimi özetlemek göstermiştir. Ayrıca, bu modeller adoptively transfer edilen allojeneik insan Vϒ9Vδ2T lenfosit güçlü antitümör etkinliğini göstermek için kullanılmıştır.
Bu iletişim kuralı GBM, allojeneik T lenfositler evlat edinen transferinde dayalı gibi beyin tümörlerinin stereotaktik immunotherapies ulaşmak için kritik deneysel adımları açıklar. Makale gösterir: (i) gibi insan Vϒ9Vδ2T lenfosit; tedavi allojeneik bağışıklık efektör T lenfositler amplifikasyon (ii) enjeksiyon için bu efektör T lenfositler hazırlanması; (iii) içinde beyin tümörü yakınındaki stereotaksik yönetim için yordam. Bu makalede ayrıca bu hücresel effectors davranışını içgörü sonra stereotaksik enjeksiyon sağlar.
Burada sunulan tedavi yaklaşımı 20 x 106 efektör hücreleri başına doz her beyin tümörü taşıyan immünyetmezligi fare için enjeksiyon temel alır. Bağışıklık hücreleri büyük miktarlarda üretmek için bir ilk vitro genişleme adım gereklidir. Bu nedenle, belirsiz hücre açılımları phytohemagglutinin (PHA-L) kullanarak gerçekleştirilir ve allojenik besleyici hücreler ışınlanmış: periferik kan mononükleer hücreler (PBMCs) sağlıklı bağış ve Epstein Barr virüsü EBV dönüştürülmüş B-lymphoblastoid hücre vitro enfeksiyon EBV içeren kültür Marmoset B95-8 hücre satırından 1 µg/mL cyclosporin-A. huzurunda süpernatant ile PBMCs elde satırları (BLCLs),
GBM reaktif efektör bağışıklık hücreleri karşılaştırılır ve vitro deneyleri9' dan seçilmiş. Bu efektör hücreler aktif hale gelir ve standart iletişim kuralları kullanarak kendi doğası göre (Örneğin, insan Vγ9Vδ2 T lenfositler9 veya insan anti-herpes virüsü αβ T lenfositler12) > %80, rutin olarak en az bir saflığı ile güçlendirilmiş sitometrik analiz tarafından kontrol. Aşağıda verilen hücre genişletme yordam çeşitli insan lenfosit alt kümeleri için geçerlidir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:825px;" width="825">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">PBMCs</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:232px;">from 3 different healthy donors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">BLCLs</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>from 3 different donors</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:339px;">Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI)</td>
			<td style="width:136px;">Gibco</td>
			<td>31870-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:339px;">FCS</td>
			<td style="width:136px;">Dutscher</td>
			<td style="width:119px;">S1810-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:136px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">penicillin/streptomycin</td>
			<td style="width:136px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">IL-2</td>
			<td style="width:136px;">Novartis</td>
			<td style="width:119px;">proleukin</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">PHA-L</td>
			<td style="width:136px;">Sigma</td>
			<td>L4144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Stereotaxic frame</td>
			<td>Stoelting Co.</td>
			<td align="right">51600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Mouse adaptator for stereotaxic frame&#160;&#160;</td>
			<td>Stoelting Co.</td>
			<td align="right">51624</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">microsyringe pump injector&#160;</td>
			<td style="width:136px;">WPI</td>
			<td style="width:119px;">UMP3-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NanoFil Syringe</td>
			<td style="width:136px;">WPI</td>
			<td style="width:119px;">NF34BV-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">NSG mice</td>
			<td style="width:136px;">Charles River</td>
			<td style="width:119px;">NSGSSFE07S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Ketamine</td>
			<td style="width:136px;">Merial</td>
			<td style="width:119px;">Imalg&#232;ne 1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Xylazine</td>
			<td style="width:136px;">Bayer</td>
			<td style="width:119px;">Rompur 2%</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Scissors</td>
			<td style="width:136px;">WPI</td>
			<td style="width:119px;">201758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Forceps</td>
			<td style="width:136px;">WPI</td>
			<td style="width:119px;">501215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">OmniDrill 115/230V</td>
			<td style="width:136px;">WPI</td>
			<td align="right">503598</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Vicryl 4-0</td>
			<td style="width:136px;">Ethicon</td>
			<td>VCP397H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Xylocaine</td>
			<td style="width:136px;">Astrazeneca</td>
			<td>3634461</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stereotactic adoptive transfer of cytotoxic immune cells in murine models of orthotopic human glioblastoma multiforme xenografts

Glioblastoma multiforme (GBM), Yetişkin, en sık ve agresif birincil beyin kanseri genellikle kötü prognoz ile ilişkilidir ve kıt etkili tedaviler son on yılda önerilmiştir. Roman tedavi edici stratejiler tasarlamak için umut verici adaylar arasında hücresel immunotherapies son derece invaziv ortadan kaldırmak için hedef almış ve kemoterapi-olup tümör hücreleri, büyük olasılıkla bu kanser bir hızlı ve ölümcül nüks dahil. Böylece, tümör çevresinde insan Vϒ9Vδ2 T lenfositler gibi allojeneik GBM reaktif bağışıklık hücre effectors administration(s) verimli sunmak için eşsiz bir fırsat temsil eder ve son derece konsantre doğrudan içine terapötik ajanlar beyin maligniteler sitesi. Burada, orthotopic insan birincil beyin tümörü taşıyan immünyetmezligi farelerde hazırlık ve allojenik insan lenfosit stereotaksik yönetim için bir iletişim kuralı mevcut. Bu çalışmada fizibilite ve allojenik insan lenfosit intrabrain tümör yataklar içinde stereotaksik enjeksiyonları itimat bu hücresel immunotherapies antitümör etkinliğini preklinik bir kanıtı-of-concept sağlar.

Bu çalışma içinde beyin tümörü taşıyan fareler stereotaksik enjeksiyonları tümör yatağın içinde gerçekleştirilen temel hücresel bağışıklık efektör hücrelerin evlat edinen transferlerin strateji açıklar.
Herhangi bir büyük enjeksiyon birimle ilişkili beyin hasarı riskini en aza indirmek için efektör hücre süspansiyon (15-20 µL PBS, 20 x 106 hücreler) konsantre gerekir. Bu hücre toplama adımı efektör hücrelerin canlılık etkileyebilecek olup olmadığını denetlemek için bu hücreleri açıklanan protokole göre kurumlara ve microsyringe yüklü. Efektör hücreleri hemen veya 10 dk microsyringe yükledikten sonra toplanmıştır. Hücreleri propidium iyodür (PI), hücrelerin yaşamak için permeant ve akış sitometresi farklı timepoints (0, 24 ila 72 saat), tarafından analiz değil bir floresan DNA intercalating Ajan ile lekeli. Sonuçları göster: hazırlık ve microsyringe içine belgili tanımlık yük önemli ölçüde efektör hücreleri canlılığı en az 24 saat (Şekil 2A ve 2B) etkilemez. 72 saat bir küçük ama önemli olmayan-artış PIpozitif hücrelerinin (boş hücreler için % 11 karşılaştırıldığında % 14) gözlenmiştir. Benzer şekilde, kurumlara ve 3 saat boyunca buzda muhafaza efektör hücrelerin antitümör reaktivite analiz edildi. Efektör hücreleri Beyin tümör hücreleri ile 4 saat için bir anti-CD107a mAb huzurunda cocultured. Harekete geçirmek işaret CD107a, benzer Denetim koşullarında alınan değeri upregulation reaktivite efektör hücrelerin hazırlanması ve microsyringe (Şekil 2C) içine yükleme tarafından etkilenmez gösterir.
Efektör hücreleri hayatta kalmak ve takip onların içi tumoral implantasyonu, 20 x 106 efektör beyin parankimi içinde hareket olup olmadığını değerlendirmek için hücreleri bir beyin tümörü (GBM-111) taşıyan farelerde tümör siteye enjekte edildi. Bir hafta sonra sabit, kesitli ve lekeli hematoksilen eozin ve safran rengi (HES) ve anti-insan CD3 mAb (IHC) için beyin toplanmıştır. HES renklendirme beyin tümörleri (Şekil 3, Sol panelde) yapısını belirledi. CD3 boyama tespit ve bağışıklık T lenfositler efektör lokalize (burada, insan Vϒ9Vδ2 T hücreleri) (Şekil 3, doğru kapı aynası). İlginçtir, efektör T lenfositler (Şekil 3, üst doğru kapı aynası), tümör tümör çekirdek (Şekil 3, Orta doğru kapı aynası), ama aynı zamanda (Şekil 3, kontralateral yarımkürede algılandı alt doğru kapı aynası). Ayrıca, 48 saat sonra onların enjeksiyon (4 x 106 αβ T hücreleri), beyin hücrelerinin % 2 temsil, fare beyninden izole insan T lenfosit fonksiyon analiz edildi. Sonuçlar allojeneik αβ T hücreleri toplanan beyin enjekte efektör genişletin ve IL-2 (Şekil 4) huzurunda gerçekleştirilen bir non-spesifik PHA-besleyici hücreler etkinleştirme üzerine çoğalırlar gösterir.
Birlikte, bu sonuçlar hazırlanmış ve bu prosedürleri altında idare efektör T hücreleri saat için beyinde hayatta ve tümör ve sağlıklı beyin doku içinde devriye göster. Bu yordamları allojeneik insan istirahat Vϒ9Vδ2 T hücreleri tedavi stereotaksik yönetimleri antitümör verimliliğini değerlendirmek için insan GBM beyin tümörleri9,11gelişimi denetlemek için kullanılmıştır. Bu çalışmalar kanıt enjeksiyonları tümör yatakta allojeneik insan efektör T lenfositlerin beyin tümörü taşıyan fareler yaşama önemli ölçüde artırır. İlginçtir, fareler hayatta tespit tümör hücreleri, bu nedenle bir tam tümör ret gösteren taşıdın değil.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57870/57870fig1.jpg"> Resim 1 : Resim ana anatomik yerlerinden fare kafatasındaki. Bu sagittal (kırmızı çizgi) ve koronal (mavi çizgi) dikiş ve Enjeksiyon Makinası yönlendirmek için kullanılan kendi kesişim (Bregma) içerir. Ölçek çubuğu gösterilir. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57870/57870fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a> 
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57870/57870fig2.jpg"> Resim 2 : Hayatta kalma ve harekete geçirmek-in hazırlanan efektör T lenfositler. Efektör hücreleri (burada, insan periferik Vϒ9Vδ2 T hücreleri dinlenme) açıklanan yordamı göre hazırlanan ve güçlendirilmiş. Lenfosit propidium iyodür (PI) ile boyama, canlı hücreler ve fonksiyonel aktivasyon permeant değil floresan bileşik enterkalasyon bir DNA gerçekleştirilen. İleri (FSC-H) karşı tarafın (SSC-H) temsil eden bir çizim dağılım efektör lenfositler (paneli yaptı) geçişi (A) Bu panel gösterir. Histogram PI gated denetim lenfositler (doğru kapı aynası) boyama gösterir. PIolumlu lenfositler yüzdesi gösterilir. (B) Bu panel gösterir hemen toplanan yüzdesini ölü lenfositler (PIpozitif) (ışık mavi çizgi) ya da 10 dakika sonra (koyu mavi bir çizgi) microsyringe içinde ölçülen belirtilen timepoints. Denetimi gibi boş hazırlanan hücreler kullanıldı (gri çizgi). (n = 3; ± SD; yani ns = önemli değil.) (C) CD107a yüzey seferberlik tarafından akış sitometresi ya Vδ2pozitif kontrol hücreleri (hazırlıksız) üzerinde ölçülen veya hazırlanan lenfositler hedef insan birincil Beyin tümör hücreleri ile bir coculture takip buz (hazır + 3 h) yapılmaktadır. Lenfositler yüzdesi her sitometrik çeyreği'nde belirtilir. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57870/57870fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57870/57870fig3.jpg"> Şekil 3 : Algılama ve yerelleştirme beyin tümörü taşıyan fareler içinde efektör T lenfositlerin. Bir hafta sonra glioblastoma beyin tümörü implantasyonu, efektör bağışıklık hücreleri (burada, insan periferik Vϒ9Vδ2 T hücreleri dinlenme) farelerin beyinlerinin enjekte edildi. Bir hafta sonra immunotherapeutic tedavi, beyin toplanan, Sabit kesitli ve. Beyin bölümleri immünhistokimya analiz için (hematoksilen eozin ve safran [HES] renklendirme) renkli (sol kapı aynası) veya anti-insan CD3 antikor (doğru kapı aynası) lekeli. Gösterilen üç bağımsız deneyler temsilcisi sonuçlarıdır. Ölçek çubuğu gösterilir.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57870/57870fig4.jpg"> Şekil 4 : Efektör T lenfosit aktivasyonu toplanan tedavi fare beyninden. Dinlenme insan T lenfositler (burada, 4 x 106 insan αβ T lenfositler) NSG farelerin beyinlerinin enjekte edildi. 48 saat sonra zeki toplanan ve ayrışmış. İnsan beyin infiltre T lenfositler yüzdesi bir anti-insan CD3 antikor (alt paneli) kullanarak akış sitometresi tarafından ölçüldü. Kendine hakim hücre (10 hücreler/de) 96-şey U popolu plakaları ve uyarılmış (PHA-besleyici hücreler ve IL-2) 20 gün (16 döngüleri iki katına) numaralı seribaşı. Dikkat, günde 10, 13,3 x 106 insan T lenfositler (doğru kapı aynası) elde.

Watch this Scientific Journal Video about Stereotactic Adoptive Transfer of Cytotoxic Immune Cells in Murine Models of Orthotopic Human Glioblastoma Multiforme Xenografts at JoVE.com

Stereotactic Adoptive Transfer of Cytotoxic Immune Cells in Murine Models of Orthotopic Human Glioblastoma Multiforme Xenografts

Orthotopic insan Glioblastoma Multiforme Xenografts fare modelleri sitotoksik bağışıklık hücrelerinin stereotaksik evlat edinen Transfer

Burada, orthotopic insan birincil beyin tümörü taşıyan immünyetmezligi farelerde hazırlık ve allojenik insan lenfosit stereotaksik yönetim için bir iletişim kuralı mevcut. Bu çalışmada bir kanıtı-of-concept fizibilite ve hücresel immunotherapies intrabrain teslim antitümör etkinliği için sağlar.

Glioblastoma multiforme (GBM), the most frequent and aggressive primary brain cancer in adults, is generally associated with a poor prognosis, and scarce ...

stereotactic-adoptive-transfer-cytotoxic-immune-cells-murine-models

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

7.8K Görüntüleme.  CRCINA. Burada, orthotopic insan birincil beyin tümörü taşıyan immünyetmezligi farelerde hazırlık ve allojenik insan lenfosit stereotaksik yönetim için bir iletişim kuralı mevcut. Bu çalışmada bir kanıtı-of-concept fizibilite ve hücresel immunotherapies intrabrain teslim antitümör etkinliği için sağlar.

Video: Stereotactic Adoptive Transfer of Cytotoxic Immune Cells in Murine Models of Orthotopic Human Glioblastoma Multiforme Xenografts

Experimental Metastasis and CTL Adoptive Transfer Immunotherapy Mouse Model

Experimental metastasis mouse model is a simple and yet physiologically relevant metastasis model. The tumor cells are injected intravenously (i.v) into mouse tail veins and colonize in the lungs, thereby, resembling the last steps of tumor cell spontaneous metastasis: survival in the circulation, extravasation and colonization in the distal organs. From a therapeutic point of view, the experimental metastasis model is the simplest and ideal model since the target of therapies is often the end point of metastasis: established metastatic tumor in the distal organ. In this model, tumor cells are injected i.v into mouse tail veins and allowed to colonize and grow in the lungs. Tumor-specific CTLs are then injected i.v into the metastases-bearing mouse. The number and size of the lung metastases can be controlled by the number of tumor cells to be injected and the time of tumor growth. Therefore, various stages of metastasis, from minimal metastasis to extensive metastasis, can be modeled. Lung metastases are analyzed by inflation with ink, thus allowing easier visual observation and quantification.

An experimental lung metastasis and CTL immunotherapy mouse model for analysis of tumor cells-T cell interaction in vivo.

Deneysel metastaz ve CTL Kabul edilmiş Transfer İmmünoterapi Fare Modeli

Experimental metastasis mouse model is a simple and yet physiologically relevant metastasis model. The tumor cells are injected intravenously (i.v) into ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Seven Steps to Stellate Cells

Hepatic stellate cells are liver-resident cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between liver sinusoidal endothelial cells and hepatocytes1,2. Stellate cells are derived from bone marrow precursors and store up to 80% of the total body vitamin A1, 2. Upon activation, stellate cells differentiate into myofibroblasts to produce extracellular matrix, thus contributing to liver fibrosis3. Based on their ability to contract, myofibroblastic stellate cells can regulate the vascular tone associated with portal hypertension4. Recently, we demonstrated that hepatic stellate cells are potent antigen presenting cells and can activate NKT cells as well as conventional T lymphocytes5. 

 Here we present a method for the efficient preparation of hepatic stellate cells from mouse liver. Due to their perisinusoidal localization, the isolation of hepatic stellate cells is a multi-step process. In order to render stellate cells accessible to isolation from the space of Disse, mouse livers are perfused in situ with the digestive enzymes Pronase E and Collagenase P. Following perfusion, the liver tissue is subjected to additional enzymatic treatment with Pronase E and Collagenase P in vitro. Subsequently, the method takes advantage of the massive amount of vitamin A-storing lipid droplets in hepatic stellate cells. This feature allows the separation of stellate cells from other hepatic cell types by centrifugation on an 8% Nycodenz gradient. The protocol described here yields a highly pure and homogenous population of stellate cells. Purity of preparations can be assessed by staining for the marker molecule glial fibrillary acidic protein (GFAP), prior to analysis by fluorescence microscopy or flow cytometry. Further, light microscopy reveals the unique appearance of star-shaped hepatic stellate cells that harbor high amounts of lipid droplets. 


 Taken together, we present a detailed protocol for the efficient isolation of hepatic stellate cells, including representative images of their morphological appearance and GFAP expression that help to define the stellate cell entity.

Here we describe a method for the isolation of hepatic stellate cells from mouse liver. For stellate cell purification, mouse livers are digested in situ and in vitro by pronase-collagenase treatment prior to density gradient centrifugation. This technique yields highly pure hepatic stellate cells.

Hücreler stellat Yedi Adımda

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam cells, immune cells, vascular endothelial and smooth muscle cells, platelets, extracellular matrix, and a lipid-rich core with extensive necrosis and fibrosis of surrounding tissues.1 The innate and adaptive arms of the immune response are involved in the initiation, development and persistence of atherosclerosis.2, 3 There is a significant body of evidence that different subsets of the immune cells, such as macrophages, dendritic cells, T and B lymphocytes, are present within the aortas of healthy and atherosclerosis-prone mice4. Additionally, immune cells are found in the surrounding aortic adventitia which suggests an important role of this tissue in atherogenesis.2
For some time, the quantitative detection of different types of immune cells, their activation status, and the cellular composition within the aortic wall was limited by RT-PCR and immunohistochemical methods for the study of atherosclerosis. Few attempts were made to perform flow cytometry using human aortas, and a number of problems, such as a high autofluorescence, have been reported5,6. Human atherosclerotic plaques were digested with collagenase 1, and free cells were collected and stained for CD14+/CD11c+ to highlight macrophage-derived foam cells. In this study, a "mock" channel was used to avoid false-positive staining.6 Necrotic materials accumulating during the digestion process give rise in a large amount of debris that generates a high autofluorescence in aortic samples. To resolve this problem, a panel of negative and positive controls has been proposed, but only double staining could be applied in these samples. We have developed a new flow cytometry-based method7 to analyze the immune cell composition and characterize the activation, proliferation, differentiation of immune cells in healthy and atherosclerosis-prone aorta. This method allows the investigation of the immune cell composition of the aortic wall and opens possibilities to use a broad spectrum of immunological methods for investigations of immune aspects of this disease.

This paper presents a flow cytometry-based method to investigate the immune composition of aortas. The paper also illustrates an additional technique that allows examining surrounding adventitia and vessel wall separately. This method opens possibilities to perform phenotypical analyses of aortic leukocytes and apply several immunological assays for atherosclerosis studies.

Bağışıklık Hücreleri murin aorta içinde Sitometrisi Analizi

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

Throughout the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII) to various aspects of immune regulation in the lung has been increasingly recognized. AECII have been shown to participate in cytokine production in inflamed airways and to even act as antigen-presenting cells in both infection and T-cell mediated autoimmunity 1-8. Therefore, they are especially interesting also in clinical contexts such as airway hyper-reactivity to foreign and self-antigens as well as infections that directly or indirectly target AECII. However, our understanding of the detailed immunologic functions served by alveolar type II epithelial cells in the healthy lung as well as in inflammation remains fragmentary. Many studies regarding AECII function are performed using mouse or human alveolar epithelial cell lines 9-12. Working with cell lines certainly offers a range of benefits, such as the availability of large numbers of cells for extensive analyses. However, we believe the use of primary murine AECII allows a better understanding of the role of this cell type in complex processes like infection or autoimmune inflammation. Primary murine AECII can be isolated directly from animals suffering from such respiratory conditions, meaning they have been subject to all additional extrinsic factors playing a role in the analyzed setting. As an example, viable AECII can be isolated from mice intranasally infected with influenza A virus, which primarily targets these cells for replication 13. Importantly, through ex vivo infection of AECII isolated from healthy mice, studies of the cellular responses mounted upon infection can be further extended.
Our protocol for the isolation of primary murine AECII is based on enzymatic digestion of the mouse lung followed by labeling of the resulting cell suspension with antibodies specific for CD11c, CD11b, F4/80, CD19, CD45 and CD16/CD32. Granular AECII are then identified as the unlabeled and sideward scatter high (SSChigh) cell population and are separated by fluorescence activated cell sorting 3.
In comparison to alternative methods of isolating primary epithelial cells from mouse lungs, our protocol for flow cytometric isolation of AECII by negative selection yields untouched, highly viable and pure AECII in relatively short time. Additionally, and in contrast to conventional methods of isolation by panning and depletion of lymphocytes via binding of antibody-coupled magnetic beads 14, 15, flow cytometric cell-sorting allows discrimination by means of cell size and granularity. Given that instrumentation for flow cytometric cell sorting is available, the described procedure can be applied at relatively low costs. Next to standard antibodies and enzymes for lung disintegration, no additional reagents such as magnetic beads are required. The isolated cells are suitable for a wide range of functional and molecular studies, which include in vitro culture and T-cell stimulation assays as well as transcriptome, proteome or secretome analyses 3, 4.

We describe the rapid isolation of primary murine type II alveolar epithelial cells (AECII) by flow cytometric negative selection. These AECII show high viability and purity and are suitable for a wide range of functional and molecular studies regarding their role in respiratory conditions such as autoimmune or infectious diseases.

Fonksiyonel ve Moleküler Çalışmalar Birincil murin Tip II alveol epitel hücrelerinde akım sitometri İzolasyonu

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

Accelerated Type 1 Diabetes Induction in Mice by Adoptive Transfer of Diabetogenic CD4+ T Cells

The nonobese diabetic (NOD) mouse spontaneously develops autoimmune diabetes after 12 weeks of age and is the most extensively studied animal model of human Type 1 diabetes (T1D). Cell transfer studies in irradiated recipient mice have established that T cells are pivotal in T1D pathogenesis in this model. We describe herein a simple method to rapidly induce T1D by adoptive transfer of purified, primary CD4+ T cells from pre-diabetic NOD mice transgenic for the islet-specific T cell receptor (TCR) BDC2.5 into NOD.SCID recipient mice. The major advantages of this technique are that isolation and adoptive transfer of diabetogenic T cells can be completed within the same day, irradiation of the recipients is not required, and a high incidence of T1D is elicited within 2 weeks after T cell transfer. Thus, studies of pathogenesis and therapeutic interventions in T1D can proceed at a faster rate than with methods that rely on heterogenous T cell populations or clones derived from diabetic NOD mice.

We provide a reproducible method to induce type 1 diabetes (T1D) in mice within two weeks by the adoptive transfer of islet antigen-specific, primary CD4+ T cells.

Diyabetojenik CD4 Kabul edilmiş Transfer ile Farelerde Hızlandırılmış Tip 1 Diyabet İndüksiyon + T Hücreleri

The nonobese diabetic (NOD) mouse spontaneously develops autoimmune diabetes after 12 weeks of age and is the most extensively studied animal model of ...

Assessing the Development of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells in Peyer's Patches Using Adoptive Transfer of Hematopoietic Progenitors

This protocol details a method to analyze the ability of purified hematopoietic progenitors to generate plasmacytoid dendritic cells (pDC) in intestinal Peyer&#39;s patch (PP). Common dendritic cell progenitors (CDPs, lin- c-kitlo CD115+ Flt3+) were purified from the bone marrow of C57BL6 mice by FACS and transferred to recipient mice that lack a significant pDC population in PP; in this case, Ifnar-/- mice were used as the transfer recipients. In some mice, overexpression of the dendritic cell growth factor Flt3 ligand (Flt3L) was enforced prior to adoptive transfer of CDPs, using hydrodynamic gene transfer (HGT) of Flt3L-encoding plasmid. Flt3L overexpression expands DC populations originating from transferred (or endogenous) hematopoietic progenitors. At 7-10 days after progenitor transfer, pDCs that arise from the adoptively transferred progenitors were distinguished from recipient cells on the basis of CD45 marker expression, with pDCs from transferred CDPs being CD45.1+ and recipients being CD45.2+. The ability of transferred CDPs to contribute to the pDC population in PP and to respond to Flt3L was evaluated by flow cytometry of PP single cell suspensions from recipient mice. This method may be used to test whether other progenitor populations are capable of generating PP pDCs. In addition, this approach could be used to examine the role of factors that are predicted to affect pDC development in PP, by transferring progenitor subsets with an appropriate knockdown, knockout or overexpression of the putative developmental factor and/or by manipulating circulating cytokines via HGT. This method may also allow analysis of how PP pDCs affect the frequency or function of other immune subsets in PPs. A unique feature of this method is the use of Ifnar-/- mice, which show severely depleted PP pDCs relative to wild type animals, thus allowing reconstitution of PP pDCs in the absence of confounding effects from lethal irradiation.

This protocol describes experimental procedures to assess the differentiation of plasmacytoid dendritic cells in Peyer&#8217;s patch from common dendritic cell progenitors, using techniques involving FACS-mediated cell isolation, hydrodynamic gene transfer, and flow analysis of immune subsets in Peyer&#8217;s patch.

Hematopoetik progenitörlerin Evlatlık Transferi kullanarak Peter Parçacıklannda Murin plazmasitoid dendritik hücreleri Gelişimini değerlendirilmesi

This protocol details a method to analyze the ability of purified hematopoietic progenitors to generate plasmacytoid dendritic cells (pDC) in intestinal ...

Generation of CAR T Cells for Adoptive Therapy in the Context of Glioblastoma Standard of Care

Adoptive T cell immunotherapy offers a promising strategy for specifically targeting and eliminating malignant gliomas. T cells can be engineered ex vivo to express chimeric antigen receptors specific for glioma antigens (CAR T cells). The expansion and function of adoptively transferred CAR T cells can be potentiated by the lymphodepletive and tumoricidal effects of standard of care chemotherapy and radiotherapy. We describe a method for generating CAR T cells targeting EGFRvIII, a glioma-specific antigen, and evaluating their efficacy when combined with a murine model of glioblastoma standard of care. T cells are engineered by transduction with a retroviral vector containing the anti-EGFRvIII CAR gene. Tumor-bearing animals are subjected to host conditioning by a course of temozolomide and whole brain irradiation at dose regimens designed to model clinical standard of care. CAR T cells are then delivered intravenously to primed hosts. This method can be used to evaluate the antitumor efficacy of CAR T cells in the context of standard of care.

The lymphodepletive and immunomodulatory effects of chemotherapy and radiation standard of care can be leveraged to enhance the antitumor efficacy of T cell immunotherapy. We outline a method for generating EGFRvIII-specific chimeric antigen receptor (CAR) T cells and administering them in the context of glioblastoma standard of care.

Bakım Glioblastoma Standardı Kapsamında Adoptif Tedavisi için CAR T hücrelerinin üretilmesi

Adoptive T cell immunotherapy offers a promising strategy for specifically targeting and eliminating malignant gliomas. T cells can be engineered ex vivo ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages and disadvantages. We describe here an experimental colitis model that is initiated by adoptive transfer of syngeneic splenic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipient mice. The CD4+CD45RBhigh T cell population that largely consists of na&#239;ve effector cells is capable of inducing chronic intestinal inflammation, closely resembling key aspects of human IBD. This method can be manipulated to study aspects of disease onset and progression. Additionally it can be used to study the function of innate, adaptive, and regulatory immune cell populations, and the role of environmental exposures, i.e., the microbiota, in intestinal inflammation. In this article we illustrate the methodology for inducing colitis with a step-by-step protocol. This includes a video demonstration of key technical aspects required to successfully develop this murine model of experimental colitis for research purposes.

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Here, we present a protocol to induce colonic inflammation in mice by adoptive transfer of syngeneic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipients. Clinical and histopathological features mimic human inflammatory bowel diseases. This method allows the study of the initiation of colonic inflammation and progression of disease.

Efektör CD4 Evlatlık transferi ile Kemirgen Bağırsak Enflamasyon indüksiyonu<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Yüksek</sup&gt; Bağışık yetmezliği olan farelere içine T Hücreleri

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Assessment of the Cytotoxic and Immunomodulatory Effects of Substances in Human Precision-cut Lung Slices

Respiratory diseases in their broad diversity need appropriate model systems to understand the underlying mechanisms and enable development of new therapeutics. Additionally, registration of new substances requires appropriate risk assessment with adequate testing systems to avoid the risk of individuals being harmed, for example, in the working environment. Such risk assessments are usually conducted in animal studies. In view of the 3Rs principle and public skepticism against animal experiments, human alternative methods, such as precision-cut lung slices (PCLS), have been evolving. The present paper describes the ex vivo technique of human PCLS to study the immunomodulatory potential of low-molecular-weight substances, such as ammonium hexachloroplatinate (HClPt). Measured endpoints include viability and local respiratory inflammation, marked by altered secretion of cytokines and chemokines. Pro-inflammatory cytokines, tumor necrosis factor alpha (TNF-&#945;), and interleukin 1 alpha (IL-1&#945;) were significantly increased in human PCLS after exposure to a sub-toxic concentration of HClPt. Even though the technique of PCLS has been substantially optimized over the past decades, its applicability for the testing of immunomodulation is still in development. Therefore, the results presented here are preliminary, even though they show the potential of human PCLS as a valuable tool in respiratory research.

In view of the 3Rs principle, respiratory models as alternatives to animal studies are evolving. Especially for risk assessment of respiratory substances, there is a lack of appropriate assays. Here, we describe the use of human precision-cut lung slices for the assessment of airborne substances.

Sitotoksik değerlendirilmesi ve insan hassas kesim akciğer dilimleri maddelerin etkileri Immunomodulatory

Respiratory diseases in their broad diversity need appropriate model systems to understand the underlying mechanisms and enable development of new ...

Light-sheet Microscopy for Three-dimensional Visualization of Human Immune Cells

In vivo, activation, proliferation, and function of immune cells all occur in a three-dimensional (3D) environment, for instance in lymph nodes or tissues. Up to date, most in vitro systems rely on two-dimensional (2D) surfaces, such as cell-culture plates or coverslips. To optimally mimic physiological conditions in vitro, we utilize a simple 3D collagen matrix. Collagen is one of the major components of extracellular matrix (ECM) and has been widely used to constitute 3D matrices. For 3D imaging, the recently developed light-sheet microscopy technology (also referred to as single plane illumination microscopy) is featured with high acquisition speed, large penetration depth, low bleaching, and photocytotoxicity. Furthermore, light-sheet microscopy is particularly advantageous for long-term measurement. Here we describe an optimized protocol how to set up and handle human immune cells, e.g. primary human cytotoxic T lymphocytes (CTL) and natural killer (NK) cells in the 3D collagen matrix for usage with the light-sheet microscopy for live cell imaging and fixed samples. The procedure for image acquisition and analysis of cell migration are presented. A particular focus is given to highlight critical steps and factors for sample preparation and data analysis. This protocol can be employed for other types of suspension cells in a 3D collagen matrix and is not limited to immune cells.

Here, we present a protocol to visualize immune cells embedded in a three-dimensional (3D) collagen matrix using light-sheet microscopy. This protocol also elaborates how to track cell migration in 3D. This protocol can be employed for other types of suspension cells in the 3D matrix.