Yazarlar personeli sitometresi tesisi (Cytocell) ve Üniversite Hastanesi hayvan tesis (UTE) Nantes hayvan yetiştirme ve bakım, hücresel ve tissular çekirdek tesis Nantes Üniversitesi (MicroPICell) görüntüleme için görüntüleme için Nantes teşekkür uzman teknik yardım. Bu eser INSERM, CNRS, Université de Nantes, Institut National du kanser (Inca #PLBio2014-155), Ligue Nationale contre le kanser (AO Bölgelerarası 2017) ve Avrupa konsorsiyumu dönemi-Net Transcan2 tarafından finanse edildi (Immunoglio). Takım Fondation pour la Recherche Medicale (DEQ20170839118) tarafından finanse edilmektedir. Bu eser IGO LabEX bağlamında gerçekleşmiştir ve IHU Cesti programları, desteklenen Ulusal Araştırma Ajansı Investissements d'Avenir yolu ile tarafından programları ANR-11-LABX-0016-01 ve ANR-10-IBHU-005, anılan sıraya göre. IHU Cesti projesi de Nantes Metropole ve Pays de la Loire bölgesi tarafından desteklenmektedir. Yazarlar Chirine Rafia el yazması düzeltmek yardım sağlamak için teşekkür ederiz.

Aşağıdaki yordam içeren hayvan konular (anlaşma #00186.02; Pays de la Loire [Fransa] bölgesel Etik Komitesi) Kurumsal kurallarına göre gerçekleştirilen. İnsan PBMCs bilinçli sağlıklı bağış (Etablissement Français du Sang Nantes, Fransa) toplanan kan gelen izole edildi. Tüm adımlar steril koşullarda gerçekleştirilir.
1. non-spesifik sitotoksik efektör T lenfositler genişlemesi
<ol><li>Hazırlamak ve besleyici hücreler, 35 Gy ışınlatayım. 2 x 105 - 4 x 105 efektör hücreleri, uyarılması için 10 x 106 PBMCs ve 1 x 106 BLCLs üç farklı ve sağlıklı bağışçılardan hazırlayın.</li>
	<li>Besleyici hücreler ve % 10 FCS ısı inaktive, 2 mM L-glutamin, penisilin (100 IU/mL) ve streptomisin (0.1 µg/mL) ve 300 IU/mL rekombinant IL-2 takıma RPMI 15 mL efektör hücrelere resuspend.</li>
	<li>PHA-L 1 µg/mL nihai bir konsantrasyon eklemek, dikkatlice karıştırın ve hücre süspansiyon 96-şey U popolu plakaları bir kuyu başına 150 µL dağıtmak.</li>
	<li>37 ° C'de ve oksijen bir atmosferde % 5 CO2 kuluçkaya.</li>
	<li>Büyük hücreli kültür wells formunda kümeler kadar günlük plaka kontrol (~ 7 gün).</li>
	<li>Hücreleri 1 x 106 hücre/mL taze kültür ortamında, bir kültür şişesi içine aktarın.</li>
	<li>(2 bir hafta x) sayarak toplam cep numarasını belirlemek ve taze kültür ortamında 1 x 106 hücre/mL proje. Not: Efektör bağışıklık hücreleri dinlenme State (genellikle 3 hafta sonra ilk amplifikasyon uyarıcı) tedavi yönetim için hazır olmalıdır. Saflık ve reaktivite bu efektör hücreler in vivo enjeksiyonları (Örneğin, vitro deneyleri ile) önce kontrol edilmelidir.</li>
</ol>2. pre-operative efektör hücreleri hazırlık
<ol><li>Efektör hücre sayısı kontrol ettikten sonra 50 mL tüp efektör hücrelerde Santrifüjü (300 x g 5 min için) tarafından toplamak. Not: aşırı hücre (Örneğin, 50 x 106) için herhangi bir kaybı telafi etmek için hazır olun.</li>
	<li>Dikkatle süpernatant kaldırmak ve 15 mL steril PBS ve 300 x g de 5 dk santrifüj yıkama gerçekleştirmek için hücrelerde resuspend.</li>
	<li>Dikkatli bir şekilde ve tamamen süpernatant kaldırın ve sonra hücre pelet 1 mL steril PBS resuspend.</li>
	<li>Santrifüjü 300 x g 5 min için de için 1.5 mL microtube resuspended hücrelerde aktarın.</li>
	<li>Yavaş yavaş pipetting tarafından dikkatli bir şekilde ve tamamen süpernatant kaldırın.</li>
	<li>Hücre Pelet fare başına steril PBS 8 µL resuspend. Not: Bu kritik bir adımdır.</li>
	<li>Hücre süspansiyon hacmi bir micropipette kullanarak ölçün. Gerekirse, steril PBS (PBS 15 µL doz başına 20 x 106 hücreler) ve dikkatlice karıştırın.</li>
	<li>, 15 ve 20 μL (imperatively < 20 µL) arasında fare başına son birimdir micropipette, kullanarak kontrol edin.</li>
	<li>Buz hücrelerdeyse stereotaksik enjeksiyon kadar tutun. Not: daha 3 h timepoints test değil.</li>
</ol>3. stereotaksik enjeksiyon
<ol><li>
Ekipman kurulumu
	<ol>
<li>Bir araya getiren ve küçük bir hayvan stereotaksik kare kafa içi enjeksiyonları (Örneğin, şırınga boyutu, istenen birim ve enjeksiyon oranı) doğruluğunu sağlamak için üreticinin yönergelerine göre kalibre. Not: Yavaş infüzyon hızı (Örneğin, 2-3 µL/dak) önerilir.</li>
		<li>Mikrobiyal emanet dolabı (MSC) kısırlık araçlarının bakımını ve fareler korumak için altında malzeme bulaşan yükleyin. Not: yer "izotermal blok" 37 ° C'de bir su banyosunda Bu sistem, ameliyat sırasında fareler hipotermi sınırlar. Yastıkları, sonrası yordam bakımı için gerekli olan Isıtma sürekli sıcaklık izleme sırasında kullanılmalıdır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Pre-operative hayvan hazırlık
	<ol>
<li>Bir fare ketamin (10 mg/mL) ve xylazine (0.1 mg/mL) 10 µL/g fare vücut ağırlığının, mayi enjeksiyonu ile anestezi.</li>
		<li>Tam anestezi ve analjezi Hayvan emin olmak için bir ayak çimdik testi gerçekleştirin. Not: Herhangi bir hareket derin olmayan analjezi bir göstergesidir ve bu durum ortaya çıkarsa, bir kaç dakika daha işlem tekrarlanmadan önce gereklidir.</li>
		<li>Sonra fare düzgün anestezi, makas (arasında iki kulak, burun kadar) cerrahi sitesinden kürk kaldırmak için kullanabilirsiniz.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Pre-operative hücre hazırlık
	<ol>
<li>Dikkatli bir pipet hücrelerle topaklanma herhangi bir hücreyi önlemek için önce her iğne (birkaç kez) resuspend.</li>
		<li>Dikkatle gerekli hücre süspansiyon birim (15-20 µL) kabarcıklar aspirasyon önlemek için 22-G microsyringe çizin. Not: Bu hücre-yükleme adım içine microsyringe enjekte birimleri'deki en aza indirmek önemlidir. Hücreler arasında yordamlar topaklanma herhangi bir hücreyi engellemek ve efektör hücreleri yönetim kohort çift sayıda sağlamak için tek tek her enjeksiyon için yeniden yükleyin.</li>
		<li>O zaman, belgili tanımlık tenkıye adapte şırınga pompa yerleştirin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Yordam bakım
	<ol>
<li>Cerrahi sitesi povidone-iyot %5 çözüm en az 3 batırılmış temizleme bezi ile dezenfekte x.</li>
		<li>Yağlama oftalmik merhem herhangi bir kornealar kurutma önlemek için fareyi'nın gözlerinin içine yerleştirin.</li>
		<li>Pozisyon stereotaksik karede sıcak izotermal blok imzalat fare fare ısısını ameliyat sırasında korumak ve mortalite sınırlamak için steril bir plastik film ile kaplı. Not: Fare burun ve diş uygun şekilde işlem sırasında yeterli solunum akışını sağlamak için diş çubuğunun üzerinde konumlandırılmış olmalıdır.</li>
		<li>Fare diş çubuğunun üzerinde konumlandırılmış bir kez sıkıca fare kulaklar kafa hareketsiz altında kulak çubuklarını sıkın. Not: kulak zarı zarar vermemeye veya solunum uzlaşmaya dikkat et.</li>
		<li>1-2 cm ensizyon sagittal cilt kafatası kafatası ortaya çıkarmak için posterior anterior üst kısmı boyunca steril makasla olun.</li>
		<li>Sagittal ve koronal sütür (Bregma) ( Şekil 1' de gösterilen) enjeksiyon önce stereotaksik yerelleştirme için simge olarak hizmet verecek kesişimi tanımlayın.</li>
		<li>Bu noktada yukarıda microsyringe bir yer.</li>
		<li>2 mm sağ yanal ve 0,5 mm Bregma ön microsyringe taşıyın.</li>
		<li>Bir microdrill kullanarak, önceden belirlenen koordinatları steril bir matkap ile kafatası içinde küçük bir delik açmak. Beynin herhangi bir travmatik yaralanmayı önlemek için yüzeysel kalması için dikkatli olun. Not: Bu protokol için kurulan bir tümör (bir hafta sonra tümör hücre enjeksiyon) içinde bağışıklık hücreleri enjekte edildi. Deri yeniden (skar) ve enjeksiyon olmalıdır (delik genellikle hala enjeksiyon sonra 2 hafta kadar mevcut) tümör hücre implantasyonu için kullanılan aynı koordinatlarda gerçekleştirilir. Koordinatları beyin parankimi13,14tümör ve efektör hücrelere enjekte için seçildi.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Enjeksiyon bağışıklık efektör hücrelerin
	<ol>
<li>Dikkatle microsyringe delinmiş deliğe yerleştirin ve yavaş hareket, beyin zarı içinde aşağı 3 mm ve sonra geriye doğru 0,5 mm son derinliğe kadar efektör hücreleri enjekte önce 2.5 mm iğne iletmek.</li>
		<li>2-3 µL/dak efektör hücre enjeksiyon çalıştırın ve enjeksiyon süresi boyunca fareler izleme.</li>
		<li>Enjeksiyon işlemi tamamlandıktan sonra yalnızca 1 mm için iğne geri çekilin ve yavaş yavaş tamamen çekilmesi infüzyon sitesinden herhangi bir sızıntı önlemek için microsyringe, önce bir dakika için microsyringe tutmak. Not: hayvan stereotaksik aygıttan kaldırılmasını, hemen enjeksiyon donanımları yaklaşan deneyler için temiz.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Ameliyat sonrası bakım ve takip fare
	<ol>
<li>Hayvan stereotaksik çerçevesinden kaldırın ve hemen povidone-iyot %5 çözüm kesi sitede uygulamak ve uygun bir cerrahi sütür ile cildi kapatmak.</li>
		<li>%2 lidokain jel doğrudan yaraya uygulayın ve buprenorfin 0.15 µg/g tarafından Subkutan Enjeksiyon sonrası yordam analjezi için yönetmek.</li>
		<li>Yer geri onun kafes bir ısıtma yastığı yukarıda imzalat fare 37 ° C için uygun fare vücut ısısını korumak için ve herhangi bir hipotermi önlemek için ayarlayın. Not: Ayrı konut gerekli değildir.</li>
		<li>Anesteziden tamamen iyileşti kadar fareyi izlemek ve konut odasına aktar. Not: birkaç beklenmedik komplikasyonlar (< %5 enjekte farelerin) meydana gelmiş gibi bugüne kadar bu protokolü de desteklenir.</li>
		<li>Her gün fareler izlemek ve azalan herhangi bir sağlık işaretleri (Örneğin, Kambur duruş, hareketliliğin, secde veya önemli vücut kilo kaybı [≥ % 15]) gözlendiğinde onları ötenazi.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Stupp, R., Roila, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malignant+glioma:+ESMO+clinical+recommendations+for+diagnosis,+treatment+and+follow-up.">Malignant glioma: ESMO clinical recommendations for diagnosis, treatment and follow-up.</a> Annals of Oncology. 20 Suppl 4, 126-128 (2009).</li><li>Weller, M., Cloughesy, T., Perry, J. R., Wick, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standards+of+care+for+treatment+of+recurrent+glioblastoma--are+we+there+yet?.">Standards of care for treatment of recurrent glioblastoma--are we there yet?.</a> Neuro-Oncology. 15 (1), 4-27 (2013).</li><li>Chen, S. H., Shine, H. D., Goodman, J. C., Grossman, R. G., Woo, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+for+brain+tumors:+regression+of+experimental+gliomas+by+adenovirus-mediated+gene+transfer+in+vivo.">Gene therapy for brain tumors: regression of experimental gliomas by adenovirus-mediated gene transfer in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (8), 3054-3057 (1994).</li><li>Choi, P. J., Tubbs, R. S., Oskouian, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+Cellular+Therapies+for+Glioblastoma+Multiforme.">Emerging Cellular Therapies for Glioblastoma Multiforme.</a> Cureus. 10 (3), e2305 (2018).</li><li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+and+Therapy+of+Glioblastoma+in+a+Mouse+Model+Using+Exosomes+Derived+From+Natural+Killer+Cells.">Targeting and Therapy of Glioblastoma in a Mouse Model Using Exosomes Derived From Natural Killer Cells.</a> Frontiers in Immunology. 9, 824 (2018).</li><li>Chung, D. S., Shin, H. J., Hong, Y. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+hope+in+immunotherapy+for+malignant+gliomas:+adoptive+T+cell+transfer+therapy.">A new hope in immunotherapy for malignant gliomas: adoptive T cell transfer therapy.</a> Journal of Immunology Research. 2014, 326545 (2014).</li><li>Vauleon, E., Avril, T., Collet, B., Mosser, J., Quillien, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+cellular+immunotherapy+for+patients+with+glioblastoma.">Overview of cellular immunotherapy for patients with glioblastoma.</a> Clinical and Developmental Immunology. 2010, (2010).</li><li>Brown, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regression+of+Glioblastoma+after+Chimeric+Antigen+Receptor+T-Cell+Therapy.">Regression of Glioblastoma after Chimeric Antigen Receptor T-Cell Therapy.</a> The New England of Journal of Medicine. 375 (26), 2561-2569 (2016).</li><li>Jarry, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereotaxic+administrations+of+allogeneic+human+Vgamma9Vdelta2+T+cells+efficiently+control+the+development+of+human+glioblastoma+brain+tumors.">Stereotaxic administrations of allogeneic human Vgamma9Vdelta2 T cells efficiently control the development of human glioblastoma brain tumors.</a> Oncoimmunology. 5 (6), e1168554 (2016).</li><li>Dutoit, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploiting+the+glioblastoma+peptidome+to+discover+novel+tumour-associated+antigens+for+immunotherapy.">Exploiting the glioblastoma peptidome to discover novel tumour-associated antigens for immunotherapy.</a> Brain. 135 (Pt 4), 1042-1054 (2012).</li><li>Joalland, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-21+Increases+the+Reactivity+of+Allogeneic+Human+Vgamma9Vdelta2+T+Cells+Against+Primary+Glioblastoma+Tumors.">IL-21 Increases the Reactivity of Allogeneic Human Vgamma9Vdelta2 T Cells Against Primary Glioblastoma Tumors.</a> Journal of Immunotherapy. 41 (5), 224-231 (2018).</li><li>Clemenceau, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effector+memory+alphabeta+T+lymphocytes+can+express+FcgammaRIIIa+and+mediate+antibody-dependent+cellular+cytotoxicity.">Effector memory alphabeta T lymphocytes can express FcgammaRIIIa and mediate antibody-dependent cellular cytotoxicity.</a> The Journal of Immunology. 180 (8), 5327-5334 (2008).</li><li>Abdelwahab, M. G., Sankar, T., Preul, M. C., Scheck, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracranial+implantation+with+subsequent+3D+in+vivo+bioluminescent+imaging+of+murine+gliomas.">Intracranial implantation with subsequent 3D in vivo bioluminescent imaging of murine gliomas.</a> Journal of Visualized Experiments. (57), e3403 (2011).</li><li>Jarry, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treg+depletion+followed+by+intracerebral+CpG-ODN+injection+induce+brain+tumor+rejection.">Treg depletion followed by intracerebral CpG-ODN injection induce brain tumor rejection.</a> Journal of Neuroimmunology. 267 (1-2), 35-42 (2014).</li><li>June, C. H., O'Connor, R. S., Kawalekar, O. U., Ghassemi, S., Milone, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAR+T+cell+immunotherapy+for+human+cancer.">CAR T cell immunotherapy for human cancer.</a> Science. 359 (6382), 1361-1365 (2018).</li><li>Baruch, E. N., Berg, A. L., Besser, M. J., Schachter, J., Markel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptive+T+cell+therapy:+An+overview+of+obstacles+and+opportunities.">Adoptive T cell therapy: An overview of obstacles and opportunities.</a> Cancer. 123 (S11), 2154-2162 (2017).</li><li>Bryant, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+immunotherapeutic+potential+of+gammadelta+T-cells+in+patients+with+glioblastoma.">Characterization and immunotherapeutic potential of gammadelta T-cells in patients with glioblastoma.</a> Neuro-Oncology. 11 (4), 357-367 (2009).</li><li>Pereboeva, L., Harkins, L., Wong, S., Lamb, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+safety+of+allogeneic+innate+lymphocyte+therapy+for+glioma+patients+with+prior+cranial+irradiation.">The safety of allogeneic innate lymphocyte therapy for glioma patients with prior cranial irradiation.</a> Cancer Immunology, Immunotherapy. 64 (5), 551-562 (2015).</li><li>Bailey, S. L., Carpentier, P. A., McMahon, E. J., Begolka, W. S., Miller, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+and+adaptive+immune+responses+of+the+central+nervous+system.">Innate and adaptive immune responses of the central nervous system.</a> Critical Reviews in Immunology. 26 (2), 149-188 (2006).</li><li>Louveau, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+features+of+central+nervous+system+lymphatic+vessels.">Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels.</a> Nature. 523 (7560), 337-341 (2015).</li><li>Menei, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+and+sustained+delivery+of+5-fluorouracil+from+biodegradable+microspheres+for+the+radiosensitization+of+glioblastoma:+a+pilot+study.">Local and sustained delivery of 5-fluorouracil from biodegradable microspheres for the radiosensitization of glioblastoma: a pilot study.</a> Cancer. 86 (2), 325-330 (1999).</li><li>Menei, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereotaxic+implantation+of+5-fluorouracil-releasing+microspheres+in+malignant+glioma.">Stereotaxic implantation of 5-fluorouracil-releasing microspheres in malignant glioma.</a> Cancer. 100 (2), 405-410 (2004).</li><li>Salot, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+scale+expansion+of+gamma+9+delta+2+T+lymphocytes:+Innacell+gamma+delta+cell+therapy+product.">Large scale expansion of gamma 9 delta 2 T lymphocytes: Innacell gamma delta cell therapy product.</a> Journal of Immunological Methods. 326 (1-2), 63-75 (2007).</li><li>Bennouna, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase-I+study+of+Innacell+gammadelta,+an+autologous+cell-therapy+product+highly+enriched+in+gamma9delta2+T+lymphocytes,+in+combination+with+IL-2,+in+patients+with+metastatic+renal+cell+carcinoma.">Phase-I study of Innacell gammadelta, an autologous cell-therapy product highly enriched in gamma9delta2 T lymphocytes, in combination with IL-2, in patients with metastatic renal cell carcinoma.</a> Cancer Immunology, Immunotherapy. 57 (11), 1599-1609 (2008).</li><li>Singh, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+human+brain+tumour+initiating+cells.">Identification of human brain tumour initiating cells.</a> Nature. 432 (7015), 396-401 (2004).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bir evlat edinen transferini yerli seçilen veya mühendislik bağışıklık efektör hücreleri temsil eden verimli tümör hücreleri dönüştürülmüş15karşı ayrıntıları sınırlayıcı dikkat çekici infiltrative beyin kanser gibi tedavisi için umut verici bir yaklaşım, 16,17,18. Ancak, beyin oluşur, merkezi sinir sistemi, kan - beyin bariyerini varlığını ve klasik lenfatik drenaj sistemi19,20eksikliği nedeniyle özellikle özel bir bağışıklık durumu olduğunu. Bu fizyolojik özellikleri doku ticareti etkileyen ve sistemik bağışıklık hücreleri enjeksiyonlari tehlikeye atabilir. Bu engelleri aşmak için intraparenchymal enjeksiyonları antitümör hücreler yerine yerel olarak, yakından farmakolojik bileşikler21, içeren mikroküreler gelince tümör site teslim edilir ve prensip olarak araştırılmalıdır 22. bir yandan organ içinde lenfositlerin sınırlı seyreltme antitümör onların verimliliği artırmak, ama aynı zamanda zararlı mekanik veya tümör adaptasyon gibi efektler beyin geliştirme tissular sıkıştırma yükseltmek tümör büyüme. Bu Bu yordam küçük hacimli immunotherapeutic enjeksiyonu gerekir anlamına gelir. Hangi beyinde tümör cerrahi olarak eksize olamaz hayvan deneysel modellerinde daha kritik bir konudur. Bu makalede bir tedavi yaklaşımı hazırlık ve beyin tümörü özgü hücresel effectors, allojeneik insan T lenfositler stereotaktik injection(s) üzerinde tabanlı yerel teslimat için.
Bu çalışmada hazırlık ve allojenik insan Vϒ9Vδ2 T lenfositler stereotaksik teslimini insan GBM xenografts taşıyan immünyetmezligi NSG farelerde gösterir. Bu iletişim kuralı ilk aşaması allojeneik T lenfositler PBMCs sağlıklı donör dan yükseltecek, büyük miktarlarda saf efektör T lenfositleri üretir standart bir nonspesifik PHA-besleyiciler-IL2 stimülasyon kullanılarak, izin için basit bir yordam açıklanır onların kullanımı kullanımı23,24. Bu makalenin ikinci aşama hazırlık T lenfosit süspansiyonlar stereotaksik yönetim gün istirahat odaklanır. Belirli bir odak canlılığı ve seçili efektör T lenfosit fonksiyon etkilememelidir yüksek hücresel yoğunluk gerektirir bu önemli bir adım yerleştirildi. Son olarak, in vivo deneyler ile ilgili efektör T lenfositler ve onların enjeksiyon tümör çekirdek içinde hazırlanması sadece vurgulayarak aynı zamanda çevre beyin dokular, tümör içinde onların yayılması ile ilişkili onların belirli yetenek devriye ve invaziv tümör hücreleri izlemek için. Önemlisi, bu hazırlık ve enjeksiyon yöntemleri bu T lenfositler beyin beyin tümör hücreleri belirli bir tanıma üzerine içinde etkinleştirilmesi yeteneğini korumak. Özet olarak, bu çekici özellikleri özellikle T lenfositler için yetenek sağlamak ve verimli bir şekilde hedef ve GBM25damgasını olan derin infiltrative Beyin tümör hücreleri ortadan kaldırmak. Notun, efektör hücre sızıntıları veya enjeksiyon ve microsyringe kaldırılması sırasında herhangi bir beyin lezyon en aza indirmek için alınması gereken özel bir bakım vardır.
Sonuç olarak, bu makalede insan Vϒ9Vδ2T lenfositler, beyin tümörleri çevresinde içinde dinlenme gibi allojeneik insan anti-tümör lenfositler, büyük miktarda teslim etmek için verimli bir yordam açıklanır. Önemlisi, tedavi bu yordamın yan etkileri (Örneğin, canlılığı, reaktivite) aktarılan T lenfositler veya beyin dokuları ile eşlik değil. Son çalışmalar, birincil insan GBM, fare orthotopic modelleri alan Vϒ9Vδ2T lenfosit verimli GBM hücreleri derin beyin parankimi9,11sızdığı tümör hücreleri de dahil olmak üzere, hedef gösterdi. Bu öğeleri orthotopic beyin tümörü taşıyan fareler ve sonra GBM hastalarda klinik çalışmalarda ilk etapta uygulanan olabilir roman evlat edinen T lenfositler transfer yordamlar gelişimi için fırsatlar açık.

(Kim IV tümörü grade) GBM erişkinlerde en sık ve agresif birincil beyin kanseri var. Cerrahi ve radyo-kemoterapi birleştirir agresif tedaviler rağmen GBM son derece kötü prognoz (medyan sağkalım 14.6 ay ve % 2-yılı-ölüm > 73)1ile ilişkili olarak kalır. Bu kaç etkili tedavi gelişmeler üzerinde son on yılda2doğrulandıktan kanıtlamaktadır. Daha etkili tedavi stratejileri3,4,5tasarımı için adaylar arasında immunotherapies6 Şu anda incelenmiştir izlemek ve son derece invaziv ve radyo/kemoterapi dayanıklı tümör ortadan kaldırmak için hücreleri, hızlı ve ölümcül tümörün nüks7anahtar katkılarından dolayı şüpheli. Çeşitli potansiyel immünolojik hedefleri belirlendi ve için önerilen immunotherapies, doğal içeren veya değiştirilmiş αβ veya ϒδ T lenfositler GBM özgü tümör antijenleri veya stres kaynaklı molekülleri8,9gibi olduğunu, 10. Seçili GBM reaktif bağışıklık hücre effectors yönetmek için olasılık efektör lenfositler yüksek miktarlarda kalıntı malignite siteye doğrudan sunmak için eşsiz bir fırsat temsil eder. Bu strateji desteklemek için biz son zamanlarda orthotopic birincil insan GBM xenografts sadakatle taşıyan immünyetmezligi fareler üzerinde temel modelleri beyin tümörleri GBM hastaların9,11' deki gelişimi özetlemek göstermiştir. Ayrıca, bu modeller adoptively transfer edilen allojeneik insan Vϒ9Vδ2T lenfosit güçlü antitümör etkinliğini göstermek için kullanılmıştır.
Bu iletişim kuralı GBM, allojeneik T lenfositler evlat edinen transferinde dayalı gibi beyin tümörlerinin stereotaktik immunotherapies ulaşmak için kritik deneysel adımları açıklar. Makale gösterir: (i) gibi insan Vϒ9Vδ2T lenfosit; tedavi allojeneik bağışıklık efektör T lenfositler amplifikasyon (ii) enjeksiyon için bu efektör T lenfositler hazırlanması; (iii) içinde beyin tümörü yakınındaki stereotaksik yönetim için yordam. Bu makalede ayrıca bu hücresel effectors davranışını içgörü sonra stereotaksik enjeksiyon sağlar.
Burada sunulan tedavi yaklaşımı 20 x 106 efektör hücreleri başına doz her beyin tümörü taşıyan immünyetmezligi fare için enjeksiyon temel alır. Bağışıklık hücreleri büyük miktarlarda üretmek için bir ilk vitro genişleme adım gereklidir. Bu nedenle, belirsiz hücre açılımları phytohemagglutinin (PHA-L) kullanarak gerçekleştirilir ve allojenik besleyici hücreler ışınlanmış: periferik kan mononükleer hücreler (PBMCs) sağlıklı bağış ve Epstein Barr virüsü EBV dönüştürülmüş B-lymphoblastoid hücre vitro enfeksiyon EBV içeren kültür Marmoset B95-8 hücre satırından 1 µg/mL cyclosporin-A. huzurunda süpernatant ile PBMCs elde satırları (BLCLs),
GBM reaktif efektör bağışıklık hücreleri karşılaştırılır ve vitro deneyleri9' dan seçilmiş. Bu efektör hücreler aktif hale gelir ve standart iletişim kuralları kullanarak kendi doğası göre (Örneğin, insan Vγ9Vδ2 T lenfositler9 veya insan anti-herpes virüsü αβ T lenfositler12) > %80, rutin olarak en az bir saflığı ile güçlendirilmiş sitometrik analiz tarafından kontrol. Aşağıda verilen hücre genişletme yordam çeşitli insan lenfosit alt kümeleri için geçerlidir.

<table><tbody><tr><td>PBMCs</td><td></td><td></td><td>from 3 different healthy donors</td></tr><tr><td>BLCLs</td><td></td><td></td><td>from 3 different donors</td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI)</td><td>Gibco</td><td>31870-025</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Dutscher</td><td>S1810-500</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Gibco</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>penicillin/streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>IL-2</td><td>Novartis</td><td>proleukin</td><td></td></tr><tr><td>PHA-L</td><td>Sigma</td><td>L4144</td><td></td></tr><tr><td>Stereotaxic frame</td><td>Stoelting Co.</td><td>51600</td><td></td></tr><tr><td>Mouse adaptator for stereotaxic frame&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Stoelting Co.</td><td>51624</td><td></td></tr><tr><td>microsyringe pump injector&amp;nbsp;</td><td>WPI</td><td>UMP3-4</td><td></td></tr><tr><td>NanoFil Syringe</td><td>WPI</td><td>NF34BV-2</td><td></td></tr><tr><td>NSG mice</td><td>Charles River</td><td>NSGSSFE07S</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>Merial</td><td>Imalg&amp;egrave;ne 1000</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Bayer</td><td>Rompur 2%</td><td></td></tr><tr><td>Scissors</td><td>WPI</td><td>201758</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>WPI</td><td>501215</td><td></td></tr><tr><td>OmniDrill 115/230V</td><td>WPI</td><td>503598</td><td></td></tr><tr><td>Vicryl 4-0</td><td>Ethicon</td><td>VCP397H</td><td></td></tr><tr><td>Xylocaine</td><td>Astrazeneca</td><td>3634461</td><td></td></tr></tbody></table>

stereotactic adoptive transfer of cytotoxic immune cells in murine models of orthotopic human glioblastoma multiforme xenografts

Glioblastoma multiforme (GBM), Yetişkin, en sık ve agresif birincil beyin kanseri genellikle kötü prognoz ile ilişkilidir ve kıt etkili tedaviler son on yılda önerilmiştir. Roman tedavi edici stratejiler tasarlamak için umut verici adaylar arasında hücresel immunotherapies son derece invaziv ortadan kaldırmak için hedef almış ve kemoterapi-olup tümör hücreleri, büyük olasılıkla bu kanser bir hızlı ve ölümcül nüks dahil. Böylece, tümör çevresinde insan Vϒ9Vδ2 T lenfositler gibi allojeneik GBM reaktif bağışıklık hücre effectors administration(s) verimli sunmak için eşsiz bir fırsat temsil eder ve son derece konsantre doğrudan içine terapötik ajanlar beyin maligniteler sitesi. Burada, orthotopic insan birincil beyin tümörü taşıyan immünyetmezligi farelerde hazırlık ve allojenik insan lenfosit stereotaksik yönetim için bir iletişim kuralı mevcut. Bu çalışmada fizibilite ve allojenik insan lenfosit intrabrain tümör yataklar içinde stereotaksik enjeksiyonları itimat bu hücresel immunotherapies antitümör etkinliğini preklinik bir kanıtı-of-concept sağlar.

Bu çalışma içinde beyin tümörü taşıyan fareler stereotaksik enjeksiyonları tümör yatağın içinde gerçekleştirilen temel hücresel bağışıklık efektör hücrelerin evlat edinen transferlerin strateji açıklar.
Herhangi bir büyük enjeksiyon birimle ilişkili beyin hasarı riskini en aza indirmek için efektör hücre süspansiyon (15-20 µL PBS, 20 x 106 hücreler) konsantre gerekir. Bu hücre toplama adımı efektör hücrelerin canlılık etkileyebilecek olup olmadığını denetlemek için bu hücreleri açıklanan protokole göre kurumlara ve microsyringe yüklü. Efektör hücreleri hemen veya 10 dk microsyringe yükledikten sonra toplanmıştır. Hücreleri propidium iyodür (PI), hücrelerin yaşamak için permeant ve akış sitometresi farklı timepoints (0, 24 ila 72 saat), tarafından analiz değil bir floresan DNA intercalating Ajan ile lekeli. Sonuçları göster: hazırlık ve microsyringe içine belgili tanımlık yük önemli ölçüde efektör hücreleri canlılığı en az 24 saat (Şekil 2A ve 2B) etkilemez. 72 saat bir küçük ama önemli olmayan-artış PIpozitif hücrelerinin (boş hücreler için % 11 karşılaştırıldığında % 14) gözlenmiştir. Benzer şekilde, kurumlara ve 3 saat boyunca buzda muhafaza efektör hücrelerin antitümör reaktivite analiz edildi. Efektör hücreleri Beyin tümör hücreleri ile 4 saat için bir anti-CD107a mAb huzurunda cocultured. Harekete geçirmek işaret CD107a, benzer Denetim koşullarında alınan değeri upregulation reaktivite efektör hücrelerin hazırlanması ve microsyringe (Şekil 2C) içine yükleme tarafından etkilenmez gösterir.
Efektör hücreleri hayatta kalmak ve takip onların içi tumoral implantasyonu, 20 x 106 efektör beyin parankimi içinde hareket olup olmadığını değerlendirmek için hücreleri bir beyin tümörü (GBM-111) taşıyan farelerde tümör siteye enjekte edildi. Bir hafta sonra sabit, kesitli ve lekeli hematoksilen eozin ve safran rengi (HES) ve anti-insan CD3 mAb (IHC) için beyin toplanmıştır. HES renklendirme beyin tümörleri (Şekil 3, Sol panelde) yapısını belirledi. CD3 boyama tespit ve bağışıklık T lenfositler efektör lokalize (burada, insan Vϒ9Vδ2 T hücreleri) (Şekil 3, doğru kapı aynası). İlginçtir, efektör T lenfositler (Şekil 3, üst doğru kapı aynası), tümör tümör çekirdek (Şekil 3, Orta doğru kapı aynası), ama aynı zamanda (Şekil 3, kontralateral yarımkürede algılandı alt doğru kapı aynası). Ayrıca, 48 saat sonra onların enjeksiyon (4 x 106 αβ T hücreleri), beyin hücrelerinin % 2 temsil, fare beyninden izole insan T lenfosit fonksiyon analiz edildi. Sonuçlar allojeneik αβ T hücreleri toplanan beyin enjekte efektör genişletin ve IL-2 (Şekil 4) huzurunda gerçekleştirilen bir non-spesifik PHA-besleyici hücreler etkinleştirme üzerine çoğalırlar gösterir.
Birlikte, bu sonuçlar hazırlanmış ve bu prosedürleri altında idare efektör T hücreleri saat için beyinde hayatta ve tümör ve sağlıklı beyin doku içinde devriye göster. Bu yordamları allojeneik insan istirahat Vϒ9Vδ2 T hücreleri tedavi stereotaksik yönetimleri antitümör verimliliğini değerlendirmek için insan GBM beyin tümörleri9,11gelişimi denetlemek için kullanılmıştır. Bu çalışmalar kanıt enjeksiyonları tümör yatakta allojeneik insan efektör T lenfositlerin beyin tümörü taşıyan fareler yaşama önemli ölçüde artırır. İlginçtir, fareler hayatta tespit tümör hücreleri, bu nedenle bir tam tümör ret gösteren taşıdın değil.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57870/57870fig1.jpg"> Resim 1 : Resim ana anatomik yerlerinden fare kafatasındaki. Bu sagittal (kırmızı çizgi) ve koronal (mavi çizgi) dikiş ve Enjeksiyon Makinası yönlendirmek için kullanılan kendi kesişim (Bregma) içerir. Ölçek çubuğu gösterilir. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57870/57870fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a> 
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57870/57870fig2.jpg"> Resim 2 : Hayatta kalma ve harekete geçirmek-in hazırlanan efektör T lenfositler. Efektör hücreleri (burada, insan periferik Vϒ9Vδ2 T hücreleri dinlenme) açıklanan yordamı göre hazırlanan ve güçlendirilmiş. Lenfosit propidium iyodür (PI) ile boyama, canlı hücreler ve fonksiyonel aktivasyon permeant değil floresan bileşik enterkalasyon bir DNA gerçekleştirilen. İleri (FSC-H) karşı tarafın (SSC-H) temsil eden bir çizim dağılım efektör lenfositler (paneli yaptı) geçişi (A) Bu panel gösterir. Histogram PI gated denetim lenfositler (doğru kapı aynası) boyama gösterir. PIolumlu lenfositler yüzdesi gösterilir. (B) Bu panel gösterir hemen toplanan yüzdesini ölü lenfositler (PIpozitif) (ışık mavi çizgi) ya da 10 dakika sonra (koyu mavi bir çizgi) microsyringe içinde ölçülen belirtilen timepoints. Denetimi gibi boş hazırlanan hücreler kullanıldı (gri çizgi). (n = 3; ± SD; yani ns = önemli değil.) (C) CD107a yüzey seferberlik tarafından akış sitometresi ya Vδ2pozitif kontrol hücreleri (hazırlıksız) üzerinde ölçülen veya hazırlanan lenfositler hedef insan birincil Beyin tümör hücreleri ile bir coculture takip buz (hazır + 3 h) yapılmaktadır. Lenfositler yüzdesi her sitometrik çeyreği'nde belirtilir. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57870/57870fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57870/57870fig3.jpg"> Şekil 3 : Algılama ve yerelleştirme beyin tümörü taşıyan fareler içinde efektör T lenfositlerin. Bir hafta sonra glioblastoma beyin tümörü implantasyonu, efektör bağışıklık hücreleri (burada, insan periferik Vϒ9Vδ2 T hücreleri dinlenme) farelerin beyinlerinin enjekte edildi. Bir hafta sonra immunotherapeutic tedavi, beyin toplanan, Sabit kesitli ve. Beyin bölümleri immünhistokimya analiz için (hematoksilen eozin ve safran [HES] renklendirme) renkli (sol kapı aynası) veya anti-insan CD3 antikor (doğru kapı aynası) lekeli. Gösterilen üç bağımsız deneyler temsilcisi sonuçlarıdır. Ölçek çubuğu gösterilir.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57870/57870fig4.jpg"> Şekil 4 : Efektör T lenfosit aktivasyonu toplanan tedavi fare beyninden. Dinlenme insan T lenfositler (burada, 4 x 106 insan αβ T lenfositler) NSG farelerin beyinlerinin enjekte edildi. 48 saat sonra zeki toplanan ve ayrışmış. İnsan beyin infiltre T lenfositler yüzdesi bir anti-insan CD3 antikor (alt paneli) kullanarak akış sitometresi tarafından ölçüldü. Kendine hakim hücre (10 hücreler/de) 96-şey U popolu plakaları ve uyarılmış (PHA-besleyici hücreler ve IL-2) 20 gün (16 döngüleri iki katına) numaralı seribaşı. Dikkat, günde 10, 13,3 x 106 insan T lenfositler (doğru kapı aynası) elde.

Watch this Scientific Journal Video about Stereotactic Adoptive Transfer of Cytotoxic Immune Cells in Murine Models of Orthotopic Human Glioblastoma Multiforme Xenografts at JoVE.com

Stereotactic Adoptive Transfer of Cytotoxic Immune Cells in Murine Models of Orthotopic Human Glioblastoma Multiforme Xenografts

Orthotopic insan Glioblastoma Multiforme Xenografts fare modelleri sitotoksik bağışıklık hücrelerinin stereotaksik evlat edinen Transfer

Burada, orthotopic insan birincil beyin tümörü taşıyan immünyetmezligi farelerde hazırlık ve allojenik insan lenfosit stereotaksik yönetim için bir iletişim kuralı mevcut. Bu çalışmada bir kanıtı-of-concept fizibilite ve hücresel immunotherapies intrabrain teslim antitümör etkinliği için sağlar.

Glioblastoma multiforme (GBM), the most frequent and aggressive primary brain cancer in adults, is generally associated with a poor prognosis, and scarce ...

stereotactic-adoptive-transfer-cytotoxic-immune-cells-murine-models

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

7.8K Görüntüleme.  CRCINA. Burada, orthotopic insan birincil beyin tümörü taşıyan immünyetmezligi farelerde hazırlık ve allojenik insan lenfosit stereotaksik yönetim için bir iletişim kuralı mevcut. Bu çalışmada bir kanıtı-of-concept fizibilite ve hücresel immunotherapies intrabrain teslim antitümör etkinliği için sağlar.

Video: Stereotactic Adoptive Transfer of Cytotoxic Immune Cells in Murine Models of Orthotopic Human Glioblastoma Multiforme Xenografts

A Simple Guide Screw Method for Intracranial Xenograft Studies in Mice

The grafting of human tumor cells into the brain of immunosuppressed mice is an established method for the study of brain cancers including glioblastoma (glioma) and medulloblastoma. The widely used stereotactic approach only allows for the injection of a single animal at a time, is labor intensive and requires highly specialized equipment. The guide screw method, initially developed by Lal et al.,1 was developed to eliminate cumbersome stereotactic procedures. We now describe a modified guide screw approach that is rapid and exceptionally safe; both of which are critical ethical considerations. Notably, our procedure now incorporates an infusion pump that allows up to 10 animals to be simultaneously injected with tumor cells.
To demonstrate the utility of this procedure, we established human U87MG glioma cells as intracranial xenografts in mice, which were then treated with AMG102; a fully human antibody directed to HGF/scatter factor currently undergoing clinical evaluation2-5. Systemic injection of AMG102 significantly prolonged the survival of all mice with intracranial U87MG xenografts and resulted in a number of complete cures. 
This study demonstrates that the guide screw method is an inexpensive, highly reproducible approach for establishing intracranial xenografts. Furthermore, it provides a relevant physiological model for validating novel therapeutic strategies for the treatment of brain cancers.

In order to evaluate novel therapeutic paradigms for the treatment of glioma, physiological relevant models are essential. We utilize an implantable guide screw procedure for establishment of intracranial xenograft models that is more rapid and safer than stereotactic approaches.

Basit Fare İntrakranial Xenograftlarında Çalışmaları Kılavuzu Vida Yöntemi

The grafting of human tumor cells into the brain of immunosuppressed mice is an established method for the study of brain cancers including glioblastoma ...

Tıp

Combination Radiotherapy in an Orthotopic Mouse Brain Tumor Model

Glioblastoma multiforme (GBM) are the most common and aggressive adult primary brain tumors1. In recent years there has been substantial progress in the understanding of the mechanics of tumor invasion, and direct intracerebral inoculation of tumor provides the opportunity of observing the invasive process in a physiologically appropriate environment2. As far as human brain tumors are concerned, the orthotopic models currently available are established either by stereotaxic injection of cell suspensions or implantation of a solid piece of tumor through a complicated craniotomy procedure3. In our technique we harvest cells from tissue culture to create a cell suspension used to implant directly into the brain. The duration of the surgery is approximately 30 minutes, and as the mouse needs to be in a constant surgical plane, an injectable anesthetic is used. The mouse is placed in a stereotaxic jig made by Stoetling (figure 1). After the surgical area is cleaned and prepared, an incision is made; and the bregma is located to determine the location of the craniotomy. The location of the craniotomy is 2 mm to the right and 1 mm rostral to the bregma. The depth is 3 mm from the surface of the skull, and cells are injected at a rate of 2 &mu;l every 2 minutes. The skin is sutured with 5-0 PDS, and the mouse is allowed to wake up on a heating pad. From our experience, depending on the cell line, treatment can take place from 7-10 days after surgery. Drug delivery is dependent on the drug composition. For radiation treatment the mice are anesthetized, and put into a custom made jig. Lead covers the mouse's body and exposes only the brain of the mouse. The study of tumorigenesis and the evaluation of new therapies for GBM require accurate and reproducible brain tumor animal models. Thus we use this orthotopic brain model to study the interaction of the microenvironment of the brain and the tumor, to test the effectiveness of different therapeutic agents with and without radiation.

The purpose of this article is to describe the use of an orthotopic glioblastoma model for chemoradiation studies. This article will go though cell processing, implanting, and radiotherapy of the mouse using an intracranial model.

Bir Ortotopik Fare Beyin Tümörü Modelinde Kombinasyon Radyoterapi

Glioblastoma multiforme (GBM) are the most common and aggressive adult primary brain tumors1. In recent years there has been substantial progress in the ...

Stereotactic Intracranial Implantation and In vivo Bioluminescent Imaging of Tumor Xenografts in a Mouse Model System of Glioblastoma Multiforme

Glioblastoma multiforme (GBM) is a high-grade primary brain cancer with a median survival of only 14.6 months in humans despite standard tri-modality treatment consisting of surgical resection, post-operative radiation therapy and temozolomide chemotherapy 1. New therapeutic approaches are clearly needed to improve patient survival and quality of life. The development of more effective treatment strategies would be aided by animal models of GBM that recapitulate human disease yet allow serial imaging to monitor tumor growth and treatment response. In this paper, we describe our technique for the precise stereotactic implantation of bio-imageable GBM cancer cells into the brains of nude mice resulting in tumor xenografts that recapitulate key clinical features of GBM 2. This method yields tumors that are reproducible and are located in precise anatomic locations while allowing in vivo bioluminescent imaging to serially monitor intracranial xenograft growth and response to treatments 3-5. This method is also well-tolerated by the animals with low perioperative morbidity and mortality.

Stereotactic Intracranial Implantation and In vivo Bioluminescent Imaging of Tumor Xenografts in a Mouse Model System of Glioblastoma Multiforme

We describe an integrated method for the precise, stereotactic implantation of human glioblastoma multiforme cells into the brains of nude mice and subsequent serial in vivo imaging to monitor growth and response to treatment of the resultant xenografts.

Stereotaktik intrakranial implantasyon ve<em&gt; In vivo</emGlioblastoma Multiforme bir Mouse Model Sistemde Tümör Xenografts arasında&gt; Bioluminescent Görüntüleme

Glioblastoma multiforme (GBM) is a high-grade primary brain cancer with a median survival of only 14.6 months in humans despite standard tri-modality ...

Primary Orthotopic Glioma Xenografts Recapitulate Infiltrative Growth and Isocitrate Dehydrogenase I Mutation

Malignant gliomas constitute a heterogeneous group of highly infiltrative glial neoplasms with distinct clinical and molecular features. Primary orthotopic xenografts recapitulate the histopathological and molecular features of malignant glioma subtypes in preclinical animal models. To model WHO grades III and IV malignant gliomas in transplantation assays, human tumor cells are xenografted into an orthotopic site, the brain, of immunocompromised mice. In contrast to secondary xenografts that utilize cultured tumor cells, human glioma cells are dissociated from resected specimens and transplanted without prior passage in tissue culture to generate primary xenografts. The procedure in this report details tumor sample preparation, intracranial transplantation into immunocompromised mice, monitoring for tumor engraftment and tumor harvesting for subsequent passage into recipient animals or analysis. Tumor cell preparation requires 2 hr and surgical procedure requires 20 min/animal.

Malignant gliomas constitute a heterogeneous group of highly infiltrative glial neoplasms with distinct clinical and molecular features. Primary orthotopic xenografts recapitulate the histopathological and molecular features of malignant glioma subtypes in preclinical animal models.

Primer Ortotopik Glioma Xenografts Infiltratif Büyüme ve İsocitrat Dehidrogenaz I Mutasyonu Rekapitulate

Malignant gliomas constitute a heterogeneous group of highly infiltrative glial neoplasms with distinct clinical and molecular features. Primary ...

Generation of CAR T Cells for Adoptive Therapy in the Context of Glioblastoma Standard of Care

Adoptive T cell immunotherapy offers a promising strategy for specifically targeting and eliminating malignant gliomas. T cells can be engineered ex vivo to express chimeric antigen receptors specific for glioma antigens (CAR T cells). The expansion and function of adoptively transferred CAR T cells can be potentiated by the lymphodepletive and tumoricidal effects of standard of care chemotherapy and radiotherapy. We describe a method for generating CAR T cells targeting EGFRvIII, a glioma-specific antigen, and evaluating their efficacy when combined with a murine model of glioblastoma standard of care. T cells are engineered by transduction with a retroviral vector containing the anti-EGFRvIII CAR gene. Tumor-bearing animals are subjected to host conditioning by a course of temozolomide and whole brain irradiation at dose regimens designed to model clinical standard of care. CAR T cells are then delivered intravenously to primed hosts. This method can be used to evaluate the antitumor efficacy of CAR T cells in the context of standard of care.

The lymphodepletive and immunomodulatory effects of chemotherapy and radiation standard of care can be leveraged to enhance the antitumor efficacy of T cell immunotherapy. We outline a method for generating EGFRvIII-specific chimeric antigen receptor (CAR) T cells and administering them in the context of glioblastoma standard of care.

Bakım Glioblastoma Standardı Kapsamında Adoptif Tedavisi için CAR T hücrelerinin üretilmesi

Adoptive T cell immunotherapy offers a promising strategy for specifically targeting and eliminating malignant gliomas. T cells can be engineered ex vivo ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Translational Orthotopic Models of Glioblastoma Multiforme

Genetically engineered mouse (GEM) models for human glioblastoma multiforme (GBM) are critical to understanding the development and progression of brain tumors. Unlike xenograft tumors, in GEMs, tumors arise in the native microenvironment in an immunocompetent mouse. However, the use of GBM GEMs in preclinical treatment studies is challenging due to long tumor latencies, heterogeneity in neoplasm frequency, and the timing of advanced grade tumor development. Mice induced via intracranial orthotopic injection are more tractable for preclinical studies, and retain features of the GEM tumors. We generated an orthotopic brain tumor model derived from a GEM model with Rb, Kras, and p53 aberrations (TRP), which develops GBM tumors&#160;displaying linear foci of necrosis by neoplastic cells, and dense vascularization analogous to human GBM. Cells derived from GEM GBM tumors are injected intracranially into wild-type, strain-matched recipient mice and reproduce grade IV tumors, therefore bypassing the long tumor latency period in GEM mice and allowing for the creation of large and reproducible cohorts for preclinical studies. The highly proliferative, invasive, and vascular features of the TRP GEM model for GBM are recapitulated in the orthotopic tumors, and histopathology markers reflect human GBM subgroups. Tumor growth is monitored by serial MRI scans. Due to the invasive nature of the intracranial tumors in immunocompetent models, carefully following the injection procedure outlined here is essential to prevent extracranial tumor growth.

Here, we describe a preclinical orthotopic mouse model for GBM, established by intracranial injection of cells derived from genetically engineered mouse model tumors. This model displays the disease hallmarks of human GBM. For translational studies, the mouse brain tumor is tracked by in vivo MRI and histopathology.

Glioblastoma multiforme'un Translasyonel Ortotopik Modelleri

Genetically engineered mouse (GEM) models for human glioblastoma multiforme (GBM) are critical to understanding the development and progression of brain ...

Kanser Araştırmaları

Creating Anatomically Accurate and Reproducible Intracranial Xenografts of Human Brain Tumors

Orthotopic tumor models are currently the best way to study the characteristics of a tumor type, with and without intervention, in the context of a live animal &#8211;&#160;particularly in sites with unique physiological and architectural qualities such as the brain. In vitro and ectopic models cannot account for features such as vasculature, blood brain barrier, metabolism, drug delivery and toxicity, and a host of other relevant factors. Orthotopic models have their limitations too, but with proper technique tumor cells of interest can be accurately engrafted into tissue that most closely mimics conditions in the human brain. By employing methods that deliver precisely measured volumes to accurately defined locations at a consistent rate and pressure, mouse models of human brain tumors with predictable growth rates can be reproducibly created and are suitable for reliable analysis of various interventions. The protocol described here focuses on the technical details of designing and preparing for an intracranial injection, performing the surgery, and ensuring successful and reproducible tumor growth and provides starting points for a variety of conditions that can be customized for a range of different brain tumor models.

The brain is a unique site with qualities that are not well represented by in vitro or ectopic analyses. Orthotopic mouse models with reproducible location and growth characteristics can be reliably created with intracranial injections using a stereotaxic fixation instrument and a low pressure syringe pump.

Oluşturma Anatomik Doğru ve İnsan Beyin Tümörleri Reproducible İntrakraniyal Ksenograftlar

Orthotopic tumor models are currently the best way to study the characteristics of a tumor type, with and without intervention, in the context of a live ...

An Immunocompetent Murine Model for Laser Interstitial Thermal Therapy of Glioblastoma

Glioblastoma (GB), the most aggressive form of primary brain cancer, accounts for approximately half of all high-grade primary brain tumors in adults and has no cure. Laser interstitial thermal therapy (LITT) is a Food and Drug Administration (FDA)-approved treatment for GB and is used in patients who may not be candidates for conventional surgical resection. While the clinical efficacy of LITT has been established, research beyond clinical case studies and case series is limited and hindered by the lack of an established animal model. This protocol uses C57BL/6 mice and syngeneic CT2A glioma cancer cell line to closely recapitulate human GB&#160;while also using a 1064 nm Neodymium-doped Yttrium Aluminum Garnet (Nd:YAG) laser, such as is used in one of the two FDA-approved LITT systems, providing excellent pre-clinical relevance. The successful establishment of this LITT murine model will provide a valuable platform for investigating the unique features of LITT ablation and its effects on the tumor microenvironment, potentially leading to improved therapeutic strategies.

Glioblastoma is a devastating form of primary brain cancer, and laser interstitial thermal therapy is emerging as a promising alternative to conventional surgical resection for inoperable glioblastoma. This protocol describes an optimized pre-clinical mouse model that can be used to study treatment effects or adjuvant and combinatorial treatments.

Glioblastoma (GB), the most aggressive form of primary brain cancer, accounts for approximately half of all high-grade primary brain tumors in adults and ...

Intranasal Delivery of Therapeutic Stem Cells to Glioblastoma in a Mouse Model

The intrinsic tropism towards brain malignancies renders stem cells as promising carriers of therapeutic agents against malignant tumors. The delivery of therapeutic stem cells via the intranasal route is a recently discovered alternative strategy, with strong potential for clinical translation, due to its non-invasive nature compared to intracranial implantation or delivery via systemic routes. The lack of blood brain barrier further strengthens the therapeutic potential of stem cells undergoing intranasal brain entry. This article summarizes the essential techniques utilized in our studies and outlines the basic principles of intranasal strategy for stem cell delivery using a mouse model of intracranial glioma xenografts. We demonstrate the optimized procedures that generate consistent and reproducible results with specific predetermined experimental parameters and offer guidelines for streamlined work flow that ensure efficient execution and reliable experimental outcome. The article is designed to serve as a baseline for further experimental customization based on hypothesis, stem cell types, or tumor specifics.

Stem cells are promising therapeutic carriers to treat brain tumors due to their intrinsic tumor tropism. Non-invasive intranasal stem cell delivery bypasses the blood brain barrier and demonstrates strong potential for clinical translation. This article summarizes the basic principles of intranasal stem cell delivery in a mouse model of glioma.

Bir Fare Modelinde Tedavi Edici Kök Hücrelerin Glioblastomaya İntranazal Dağıtımı

The intrinsic tropism towards brain malignancies renders stem cells as promising carriers of therapeutic agents against malignant tumors. The delivery of ...

Image-Guided Resection of Glioblastoma and Intracranial Implantation of Therapeutic Stem Cell-seeded Scaffolds

Glioblastoma (GBM), the most common and aggressive primary brain cancer, carries a life expectancy of 12-15 months. The short life expectancy is due in part to the inability of the current treatment, consisting of surgical resection followed by radiation and chemotherapy, to eliminate invasive tumor foci. Treatment of these foci may be improved with tumoricidal human mesenchymal stem cells (MSCs). MSCs exhibit potent tumor tropism and can be engineered to express therapeutic proteins that kill tumor cells. Advancements in preclinical models indicate that surgical resection induces premature MSC loss and reduces therapeutic efficacy. Efficacy of MSC treatment can be improved by seeding MSCs on a biodegradable poly(lactic acid) (PLA) scaffold. MSC delivery into the surgical resection cavity on a PLA scaffold restores cell retention, persistence, and tumor killing. To study the effects of MSC-seeded PLA implantation on GBM, an accurate preclinical model is needed. Here we provide a preclinical surgical protocol for image-guided tumor resection of GBM in immune-deficient mice followed by MSC-seeded scaffold implantation. MSCs are engineered with lentiviral constructs to constitutively express and secrete therapeutic TNF&#945;-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) as well as green fluorescent protein (GFP) to allow fluorescent tracking. Similarly, the U87 tumor cells are engineered to express mCherry and firefly luciferase, providing dual fluorescent/luminescent tracking. While currently used for investigating stem cell mediated delivery of therapeutics, this protocol could be modified to investigate the impact of surgical resection on other GBM interventions.

Tumor-seeking therapeutic mesenchymal stem cells (MSCs) show promise as a treatment for invasive glioblastoma. Optimal transplantation involves delivery of MSCs into the tumor resection cavity on scaffolds. Here, preclinical techniques to study MSC treatment of glioblastoma are provided including: image-guided tumor resection; implantation of MSC-seeded scaffolds; and postoperative therapy tracking.

Görüntü güdümlü rezeksiyon Glioblastoma ve kafa içi tedavi kök hücre numaralı seribaşı iskele implantasyonu

Glioblastoma (GBM), the most common and aggressive primary brain cancer, carries a life expectancy of 12-15 months. The short life expectancy is due in ...