Name: in vivo nanovector delivery of a heart-specific microrna-sponge
Uploaded: 2018-06-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Nanovector Delivery of a Heart-specific MicroRNA-sponge at JoVE.com

Anthony K. L. Leung Bölümü Biyokimya ve moleküler biyoloji teşekkür ediyoruz, Bloomberg Halk Sağlığı Okulu, Johns Hopkins Üniversitesi onun teknik için miR-181-sünger yapı tasarlama konusunda yardım et. Biz de Polina Sysa-Şah ve Kathleen Gabrielson moleküler bölümü ve karşılaştırmalı Pathobiology, miRNA-sünger teslimat Johns Hopkins Tıp Kurumları yanında vivo içinde düşsel teknik yardım için teşekkür ederiz.
Bu eser NIH HL39752 (Charles Steenbergen için) gelen hibe ve Amerikan Kalp Derneği 14SDG18890049 bir bilim adamı kalkınma hibe (için tolga Das) tarafından desteklenmiştir. Sıçan kardiyo özgü organizatörü cömertçe Jeffery ö Molkentin Cincinnati çocuk hastanesinde tarafından sağlandı.

Tüm deneysel prosedürler kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi Johns Hopkins Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.
1. sünger tasarım
<ol><li>
MikroRNA 3' UTR bağlama Not: A miRNA işlevleri belirli temel eşleştirme etkileşimlerin 3' çevrilmeyen bölgesi (UTR) kısmen tamamlayıcı siteleri ile onun hedef mRNA'ların aracılığıyla (kapsamlı bir inceleme için bkz: Bartel)15.<ol>
<li>MiRNA ifade olarak önemli tamamlayıcılık miRNA sıra içeren oligonucleotides inhibitörleri tasarlayın. Bir oligonükleotid miRNA işlevini engellemek için karmaşık geniş baz eşleşmesi yoluyla içinde miRNA çekilmek.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
MiRNA sünger tasarım
	<ol>
<li>Tasarım tandemly bir çıkıntı normalde Argonaute 2 tarafından i ciddi konumundaki dahil etmek için kısmen tamamlayıcı miRNA dizileri serilir. Çıkıntı herhangi bir RNA parazit türü bölünme ve sünger bozulma önlemek için olgun miRNA sırasının nükleotit 9-12 yer alıyor.</li>
		<li>İsterseniz, tüm miR-181 aile üyelerine bağlamak için yem hedef sıra tasarlayın. Üzerine bir inceleme ve karşılaştırma miR-181 aile miRNA sıralarının, ortak bir dizi de 5'-tarafından 8 ardışık nükleotit içeren Bulge, ya da bir sıra tüm 4 miR-181 aile üyeleri için ortak 3'-tarafındaki Ek 8 çıkıntı bul. ardışık nükleotit. 2 bu dizilere sırasıyla sol ve sağ yarım bağlayıcı siteleri temsil eder. Not: Yem sıra GGA ayırıcı tarafından ayrılmış sağ ve sol yarım bağlayıcı siteleri bir tandem dizisidir. Birlikte 5' uç sıra ve (1.2.2. adımda açıklanan) 3' yanı sıra ne zaman (1.2.1 adımda anlatıldığı gibi) bir miRNA komplementer çıkıntı oluşturmak için tasarlanmış GGA rondela ile bağlantı. Bu 1 miRNA bağlama sitesi 10 x son miR-sünger seçenekli.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
MiRNA sünger ile ilgili diğer konular Not: alıcı ifade vektör içine Sünger sıra klon için kısıtlama nükleaz tanıma siteleri dizisinin her iki uçta dahil edilmelidir. Bir silico sindirim analiz sünger sırası belirsiz bölünme onaylamak için seçilen enzimleri ve aşağı akım klonlama uygulamalarında kullanılan diğer enzimleri tarafından kullanılmalıdır.<ol>
<li>MiR-181-sünger Serisi Gelişmiş bir yeşil flüoresan protein (EGFP) için kodlama sırasına değildir öyle ki Çift Kişilik kodonu (TAA TAA) 5'-sonunda, sentetik 3' UTR, ekleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Klonlama için sünger DNA sentezi
	<ol>
<li>Bir DNA synthesizer kullanın veya son miRNA sünger sıra ile kısıtlama nükleaz tanıma yer yerde klonlama için sentezlemek için piyasada bulunan bir kaynağı kullanır. Sünger bakterilerde bir amplifikasyon için seçilebilir işaretleri içeren bir plazmid sevk edilir. Ayrıca, sünger bir polimeraz zincir tepkimesi (PCR) tarafından klonlama için güçlendirilmiş olabilir veya sadece 1.3. adımda anlatılan kısıtlama sites'ı kullanarak bağış vektör bıraktı (Ayrıca, bkz: adım 3.1).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. bir doku özgü organizatörü dahil etmek için alıcı vektör klonlama
Not: pEGFP-C1 vektör miRNA sünger ifade kaset için alıcı vektör olarak kullanın. PEGFP-C1 vektör sitomegalovirüs (CMV) düzenleyici tarafından yönlendirilen bir EGFP için bir okuma çerçevesi içerir. CMV organizatörü memeli hücrelerinde yapısal etkindir. Bir doku özgü organizatörü gerekiyorsa, CMV organizatörü (bkz. Adım 2.1) AseI ve NheI enzimler sindirimi tarafından kaldırılabilir. Plazmid geniş bir birden çok klonlama sitesi (MCS) yanı sıra sefaloridin (Kan) ve paromisin (G418) işaretleri bakteri seçimde ve memeli hücrelerinde istikrarlı bir ifade için sırasıyla içerir.
<ol><li>
CMV organizatörü pEGFP-C1--dan kaldırma
	<ol>
<li>1 x kullanılan enzimleri üretimi tarafından önerilen piyasada bulunan Özet arabellek içeren sindirim tepki 50 μL, 5 μg plazmid DNA (su)'in ve AseI ve NheI enzimlerin her 5 μL olun. Tüm bileşenleri bir microcentrifuge tüp ve nazikçe onları flicking tarafından karıştırın. Tüpü 10 için spin tepki alt toplamak için bir microcentrifuge s. 15 dakika 37 ° C su banyosunda tepki kuluçkaya.</li>
		<li>Sindirilir Doğrusallaştırılmış plazmid arındırmak. 5 sütun bağlama arabellek (kullanılan DNA arıtma sütunları imalatı için uygun bağlama önbellek özel bir karışımı) tepki hacmi x ekleyin ve üretici tarafından açıklandığı gibi bir DNA arıtma sütun ile reaksiyonu arındırmak. 25 μL elüsyon arabelleği sütun ortasına doğru dikkatle eklendi (su) ile elute.</li>
		<li>Jel arındırmak sindirilir plazmid % 0.5 özel jel üzerinde aşağıdaki gibi: eluted plazmid tampon (% 50 gliserol-boya yükleme x 3) yükleme 5 μL ekleyin. Tüm örnek 1 su kuyusu üstünde % 0.5 özel jel içine yükleyin. Ayrı bir yol, 500 dahil kesilmemiş vektör ng. Çalıştırmak için 30-40 dk kadar kesilmiş ve işlenmemiş plazmid yeterli bir ayrılması sağlanır.</li>
		<li>Aşağıdaki gibi Doğrusallaştırılmış plazmid arındırmak: UV ışık kutusu üzerinde özel jel DNA'da görselleştirmek. Temiz bir tıraş bıçağı ile dikkatli bir şekilde Doğrusal plazmid karşılık gelen grup tüketim. Not: Doğrusal plazmid kesilmemiş plazmid düşük çalıştırmalısınız ve tek bir bant yaklaşık 4,2 KB olarak görünür. Eksize CMV organizatörü yaklaşık 500 nükleotit (nt), hafif bir grup olarak görünür.</li>
		<li>Piyasada bulunan bir seti kullanarak jel dilimden DNA ayıklamak ve su 25 μL sütunla DNA'dan elute.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
PEGFP-C1 bir kalp özgü organizatörü klonlama Not: Alfa-myosin ağır zincir (α-MHC) Organizatörü önceden karakterize ve sağlam düzeyleri kalp tarafından kısıtlanmış ifade aşağıdaki Molkentin, Jobe, Markham ve16içinde açıklandığı gibi yönlendirmek için gösterdi. Sonraki bölümlerde klonlama için vektör organizatörü yükseltmek nasıl açıklanmaktadır.<ol>
<li>Öğeleri + 420 p40 plazmid16 transkripsiyon başlangıç siteye göre-2934 için ilk tarafından arasında α-MHC organizatörü klon bu bölge ve ardından plazmid PCR için şablon olarak kanattan PCR astar tasarlama. PCR astar yukarıda açıklanan5kullanarak organizatörü bölgenin yükseltmek. İleriye ve geriye doğru PCR astar sıraları örtüşme sindirilir uçlarına pEGFP-Fusion-yönetmen klonlama izin vermek için C1'in (adım 2.1) içerir. Astar tasarım inç-Fusion klonlama için kapsamlı bir açıklama için inç-Fusion kullanım kılavuzuna bakın. Astar dizileri Tablo 1' de bulunur.</li>
		<li>Her astar ve 10 1 mikron içeren bir 50 μL PCR reaksiyon hazırlamak ng şablonunun DNA. PCR enzim ve dNTPs bağlı olarak seçilen PCR reaktif imalatı uygun bir miktarda ekleyin. PCR bir standart DNA Bisiklete binme blokta gerçekleştirin. 3 dk 98 ° C adım, denaturing, tavlama ve uzantısı 35 devredir 5, 30 ve 120 ardından denaturing gerçekleştirmek s her, anılan sıraya göre. 72 ° C'de 10 dakika son bir uzantısına ekle</li>
		<li>PCR ve jel çıkarma kadar temiz. PCR döngüsü tamamlandığında, üretici tarafından açıklandığı gibi bir DNA arıtma sütunla arındırmak ve PCR reaksiyon 5 sütun bağlama arabellek tepki hacmi x ekleyin. Karışımı 25 μL elüsyon arabelleği sütun ortasına doğru dikkatle eklendi (su) ile elute.<ol>
<li>Arabellek [% 50 gliserol (3 x) boya yükleme] için eluted plazmid yükleme 5 μL ekleyin. Tüm örnek 1 de ' % 1'özel jel içine yükleyin. 30-40 dk için koşmak; görselleştirmek ve PCR ürünü (yukarıdaki adım 2.1.5) açıklandığı gibi tüketim.</li>
		</ol>
</li>
		<li>α-MHC organizatörü pEGFP C1 ile aşağıdaki gibi ligate: 1 x piyasada bulunan tüp ligasyonu arabellek, saflaştırılmış PCR 2 μL ve Doğrusallaştırılmış vektör 1 μL içeren 10 μL ligasyonu tepki ekleyin. 50 ° c ligasyonu 15dk için gerçekleştirmek ve sonra buz üzerinde cool.</li>
		<li>Bakteriyel bir dönüşüm aşağıdaki gibi yapın: 2.5 μL Fusion tüp ligasyonu karışımı ile yetkili hücrelerinin 50 μL bileşenleri ekleyerek transfect. Eppendorf dinlenmek için 20 dk 42 ° C su banyosu 40 s ve sonra yere koydum, buzda buz 2 min için tüp tüp.<ol>
<li>Dönüşümün, SOC kitle 350 μL eklemek ve 45 dk. plaka 200 μL akıbet çözüm LB plakaları ile Kan. gerçekleştirmek için 37 ° C'de hücreler bir koloni α-MHC organizatörü ligasyonu içeren Kan dayanıklı hücreleri tanımlamak için PCR büyümek. Not: Tarama astar ligasyonu kavşak PCR için dizayn edilmiştir.</li>
		</ol>
</li>
		<li>PCR olumlu klonlar LB-Kan suyu ve üretici tarafından açıklandığı gibi standart mini hazırlık plazmid arıtma protokolleri kullanarak saf plazmid genişletin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. sünger klonlama
<ol><li>
Alıcı vektör sindirmek
	<ol>
<li>α-MHC-pEGFP plazmid doğrusal EcoRI ve KpnI ile klonlama için yapmak ve jel (yukarıdaki adım 2.1) açıklandığı gibi arındırmak.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
PCR yükseltmek ve sünger DNA sindirmek
	<ol>
<li>Vektörel çizimler PCR için şablon olarak nakliye miR-181-sünger ve karşılık gelen 284-nt-uzun kapış kullanın. Yukarıda açıklanan PCR astar5kullanarak sünger bölgenin yükseltmek. İleriye ve geriye doğru PCR astar ligasyonu α-MHC-pEGFP-C1 içine izin vermek için Restriksiyon enzimi sıraları içerir unutmayın. PCR (yukarıdaki adım 2.2.2) açıklandığı gibi gerçekleştirin. PCR ürünleri (adım 2.2.3) açıklanan ve sindirim için su ile eluted sindirim önce arındırmak. Astar dizileri için bkz: Tablo 1.
</li>
		<li>Tüp ligasyonu için sünger DNA sindirmek. Bir 50 μL sindirim tepki 1 x Özet arabellek, adım 3.2.1 jel saf PCR reaksiyon ve 5 μL hem EcoRI hem de KpnI enzim içerir. Tüm bileşenleri bir microcentrifuge tüp ve nazikçe onları flicking tarafından karıştırın. Tüpü 10 için spin tepki alt toplamak için bir microcentrifuge s. 15 dakika 37 ° C su banyosunda tepki kuluçkaya.</li>
		<li>Daha önce açıklandığı gibi bir PCR temizlik sütun kullanarak sindirilir PCR sünger (adım 2.2.1) arındırmak.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
MiR-181-sünger α-MHC-pEGFP-C1 vektör ligate
	<ol>
<li>1 x ligasyonu arabellek içeren bir 21 μL ligasyonu reaksiyonu, 3 μL sindirmek ve miR-181-sünger PCR, 1 μL Doğrusallaştırılmış α-MHC-pEGFP-C1 vektörünün, 1 x DNA arabellek ve DNA ligaz 1 μL saf. Ligasyonu oda sıcaklığında 5 min için gerçekleştirmek ve buza koyun.</li>
		<li>XL1-mavi yetkili hücreleri 50 μL ligasyonu Mix 2 μL ile dönüşümü. Dönüşümün ve protokolleri kaplama (yukarıdaki adım 2.2.5) açıklandığı gibi kullanın. Bir koloni PCR doğru α-MHC-pEGFP-miR-181-sponge sırada içeren Kan dirençli bakteri tanımlamak için gerçekleştirin. Tarama astar PCR için ligasyonu Kavşağı tasarım. Astar dizileri bkz. Tablo 1 .</li>
		<li>Vektör sıra ve yükseltmek. PCR olumlu klonlar LB-Kan suyu ve standart mini hazırlık plazmid arıtma protokolleri kullanarak saf plazmid genişletin. İstenen DNA dizileri ifade plazmid doğrulamak için bir DNA sıralama gerçekleştirir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. nesil istikrarlı H9c2 miR-181-sünger ifade hücreleri
<ol><li>
Büyüme ve bakım H9c2 hücre
	<ol>
<li>Kültür H9c2 hücreleri içinde Dulbecco'nın modifiye kartal Orta (fetal Sığır serum (FBS) % 10 son bir konsantrasyon içeren DMEM). Standart protokolleri kullanarak hücreleri alt kültür ve onları % 5 karbon dioksit 37 ° C'de büyümek.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Transfection ve H9c2 hücreleri ifade α-MHC-pEGFP-C1-miR-181-sponge seçimi
	<ol>
<li>Bir adım H9c2 hücrelerinin en iyi sonuç için gerçekleştirin. Scramble sünger (miR-181-sünger-sıra yerini alan 284-nt-uzun kapış dizisi) ya da bir electroporator sahip α-MHC-pEGFP-miR-181-sponge yapı ile sıçan myoblasts (H9c2) transfect.<ol>
<li>Kısaca, 4 x 10-5 hücreleri 2 μg plazmid DNA (içinde 5 µL H2O) ile transfect ve Elektroporasyon aygıtla uyumlu bir çözeltinin 100 µL. H9c2 hücre transfect için DS-120 bir adım programını kullanın.</li>
			<li>Oda sıcaklığında 10 dakika için küvet transfected hücrelerde kuluçkaya. DMEM 500 µL doğrudan küvet için ekleyin. Yavaşça toplam küvet içeriği 6-şey plaka bir kuyu için aktarın.</li>
		</ol>
</li>
		<li>48 saat sonrası transfection FACs tarafından sonra GFP olumlu hücrelerini seçer. Yalnızca GFP ifade hücreleri paromisin (G418) bir ek ile bir 6-şey plaka plaka (400ng/mL) tam büyüme basına. Not: G418 seçimi öncesinde bir kill eğrisi paromisin seçim için gerekli miktarını belirlemek için kurulmalıdır. H9c2 hücreler için 400 ng/mL G418 sonuçlanan bir plazmid sigara yaklaşık % 80'i ölüm oranı H9c2 hücreleri 24 saat sonra transfected ve G418 istenen çalışma konsantrasyonu bu hücreler için olarak kabul edildi. Büyüme G418 içinde 16 gün boyunca devam edildi sonra hücre istikrarlı olarak kabul edildi.</li>
		<li>Bir sünger pozitif seçim için bir işaretleyici olarak GFP ifade kullanarak G418 istikrarlı hücreleri FACs sıralanması gerçekleştirin. Her şey bir 96-şey plaka 5-10 hücrelere akışı sıralayarak tohum. 24-şey plakaları monoklonal hücrelere 96-şey plaka üzerinde çeşitli pasajlar genişletin. Kullanım dondurucu stokları hücre sonraki deneyler için başlangıç noktası olarak 3 (P3) hücreleri geçiş.</li>
		<li>P5 ve P10 arasında düşük geçiş hücreleri ile tüm hücre-satır-tabanlı deneyler yapmak.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. sentez ve sünger-nano tanecikleri (miR-181-sünger nano tanecikleri) arıtma
<ol><li>Liposomal nano tanecikleri katyonik Amfifil (DOTAP) ve Co lipidler, kolesterol ve DSPE-PEG-OMe, 5:5:0.1 mM oranı sırasıyla, kloroform ve metanol bir cam şişe içinde bir karışımı çözülerek hazırlayın.</li>
	<li>44-45 ° c, organik çözücü nem-Alerjik azot nazik bir akış tarafından takip bir rotary evaporatör kullanarak bir vakum altında kaldırın. Lipid kalan Kuru film 8 h için yüksek vakum altında tutun.</li>
	<li>Vakum Kurutulmuş lipit filmin %5 glikoz ekleyerek bir karışım hazırlayın. Gecede film hidrat bu karışım izin verin bırakın. Girdap şişeyi bir ara sıra bir 45 ° C su banyosunda sallayarak ile multilamellar veziküller üretmek için oda sıcaklığında 2-3 dk için.<ol>
<li>Küçük unilamellar veziküller içinde bir buz banyosu hazırlamak için 3-4 kadar açıklık görülebilmektedir min, % 100 iş hacmi ve 25 W çıkıș gücü için multilamellar veziküller solüsyon içeren temizleyicide.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Scramble sıra ya da pEGFP(α-MHC) vektörler ve lipozom 1:3 ücret oranı olarak nanovector4oluşturmak için içine klonlanmış bir miR-181-sünger sırası karıştırın. Not: Olumlu tahsil liposomal nano tanecikleri ve olumsuz ücret plazmid DNA elektrostatik bir kompleks bir nanovector bilinir.</li>
</ol>6. sistemik teslimini sünger-nano tanecikleri ve in Vivo sonuç doğrulama
<ol><li>
Sünger-nano tanecikleri sıçanlarda sistemik teslim
	<ol>
<li>Sprague-Dawley (SD) fareler kullanın. Fareler intravenöz miR-181-sünger nanovector veya kapış nanovector kuyruk ven yoluyla enjekte et. Vücut ağırlığı yaklaşık 200 g olan SD erkek rats, kullanın.</li>
		<li>Nanovector/kg vücut ağırlığı 4 mg doz kullanarak kuyruk ven enjeksiyon gerçekleştirmek ve bu 2 hafta içinde 6 kuyruk ven enjeksiyonları rejimi kullanarak yineleyin. Tekrarlanan nanovector teslim bir 1 haftalık süre (gün 15-21) vektör içinde vivoifade için izin.</li>
		<li>Optimizasyon öncesinde, sırasında ve sonra nanovector teslim GFP sinyal Imaging onaylayın. GFP sinyal yarı nicel veri üreten tomografik görüntüleme yazılımı tarafından analiz.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Vivo miR-181 inhibisyon miR-181-sünger tarafından doğrulanması
	<ol>
<li>Ifade işlev miR-181-sünger kalp dokusunda göstermek için Batı leke gerçekleştirin. Not: Bu çalışma için mt-COX1 ifade incelenmiştir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Vivo miR-181-sünger ifade kalbinde fonksiyonel sonuçları
	<ol>
<li>İki boyutlu, M-modu ve Doppler ekokardiyografi ile değerlendirilmesi sırasında ve kardiyak fonksiyon ve morfolojik değişiklikler çözümlemek için nanovector teslim sonra gerçekleştirin. İçin daha iyi tarama kapasitesi kemirgen kalplerinde bir 15 MHz doğrusal dizi çevirici ile donatılmış bir ultrason sistemi kullanın.</li>
		<li>Anestezi kardiyak contractility etkileyebilir; Bu nedenle, miR-181-sünger nanovector veya kapış nanovector ekokardiyografi işlemi sırasında bilinçli ve herhangi bir anestezik reaktif hayvanlar için teslim gerçekleştirin. Das, görebilir ve ark. daha fazla açıklama için 4 .</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hammond, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=microRNA+detection+comes+of+age.">microRNA detection comes of age.</a> Nat Methods. 3 (1), 12-13 (2006).</li><li>van Rooij, E., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs:+powerful+new+regulators+of+heart+disease+and+provocative+therapeutic+targets.">MicroRNAs: powerful new regulators of heart disease and provocative therapeutic targets.</a> The Journal of Clinical Investigation. 117 (9), 2369-2376 (2007).</li><li>Das, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+miRNA+regulates+the+mitochondrial+genome+in+the+heart.">Nuclear miRNA regulates the mitochondrial genome in the heart.</a> Circulation Research. 110 (12), 1596-1603 (2012).</li><li>Das, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-181c+regulates+the+mitochondrial+genome,+bioenergetics,+and+propensity+for+heart+failure+in+vivo.">miR-181c regulates the mitochondrial genome, bioenergetics, and propensity for heart failure in vivo.</a> PLoS One. 9 (5), e96820 (2014).</li><li>Das, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Divergent+effects+of+miR-181+family+members+on+myocardial+function+through+protective+cytosolic+and+detrimental+mitochondrial+microRNA+targets.">Divergent effects of miR-181 family members on myocardial function through protective cytosolic and detrimental mitochondrial microRNA targets.</a> Journal of the American Heart Association. 6 (3), e004694 (2017).</li><li>Sicard, F., Gayral, M., Lulka, H., Buscail, L., Cordelier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+miR-21+for+the+therapy+of+pancreatic+cancer.">Targeting miR-21 for the therapy of pancreatic cancer.</a> Molecular Therapy. 21 (5), 986-994 (2013).</li><li>Jopling, C. L., Yi, M., Lancaster, A. M., Lemon, S. M., Sarnow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+hepatitis+C+virus+RNA+abundance+by+a+liver-specific+microRNA.">Modulation of hepatitis C virus RNA abundance by a liver-specific microRNA.</a> Science. 309 (5740), 1577-1581 (2005).</li><li>Lanford, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+silencing+of+microRNA-122+in+primates+with+chronic+hepatitis+C+virus+infection.">Therapeutic silencing of microRNA-122 in primates with chronic hepatitis C virus infection.</a> Science. 327 (5962), 198-201 (2010).</li><li>Ucar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+miRNA-212/132+family+regulates+both+cardiac+hypertrophy+and+cardiomyocyte+autophagy.">The miRNA-212/132 family regulates both cardiac hypertrophy and cardiomyocyte autophagy.</a> Nature Communications. 3, 1078 (2012).</li><li>Zhu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+micro-RNA+networks+in+end-stage+heart+failure+because+of+dilated+cardiomyopathy.">Identification of micro-RNA networks in end-stage heart failure because of dilated cardiomyopathy.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 17 (9), 1173-1187 (2013).</li><li>Bandiera, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+outsourcing+of+RNA+interference+components+to+human+mitochondria.">Nuclear outsourcing of RNA interference components to human mitochondria.</a> PLoS One. 6 (6), e20746 (2011).</li><li>Barrey, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-microRNA+and+mature+microRNA+in+human+mitochondria.">Pre-microRNA and mature microRNA in human mitochondria.</a> PLoS One. 6 (5), e20220 (2011).</li><li>Bian, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+mouse+liver+mitochondria-associated+miRNAs+and+their+potential+biological+functions.">Identification of mouse liver mitochondria-associated miRNAs and their potential biological functions.</a> Cell Research. 20 (9), 1076-1078 (2010).</li><li>Kren, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+identified+in+highly+purified+liver-derived+mitochondria+may+play+a+role+in+apoptosis.">MicroRNAs identified in highly purified liver-derived mitochondria may play a role in apoptosis.</a> RNA Biology. 6 (1), 65-72 (2009).</li><li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs:+genomics,+biogenesis,+mechanism,+and+function.">MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function.</a> Cell. 116 (2), 281-297 (2004).</li><li>Molkentin, J. D., Jobe, S. M., Markham, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha-myosin+heavy+chain+gene+regulation:+delineation+and+characterization+of+the+cardiac+muscle-specific+enhancer+and+muscle-specific+promoter.">Alpha-myosin heavy chain gene regulation: delineation and characterization of the cardiac muscle-specific enhancer and muscle-specific promoter.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 28 (6), 1211-1225 (1996).</li><li>Poliseno, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+coding-independent+function+of+gene+and+pseudogene+mRNAs+regulates+tumour+biology.">A coding-independent function of gene and pseudogene mRNAs regulates tumour biology.</a> Nature. 465 (7301), 1033-1038 (2010).</li><li>Henao-Mejia, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microRNA+miR-181+is+a+critical+cellular+metabolic+rheostat+essential+for+NKT+cell+ontogenesis+and+lymphocyte+development+and+homeostasis.">The microRNA miR-181 is a critical cellular metabolic rheostat essential for NKT cell ontogenesis and lymphocyte development and homeostasis.</a> Immunity. 38 (5), 984-997 (2013).</li><li>Williams, A., Henao-Mejia, J., Harman, C. C., Flavell, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-181+and+metabolic+regulation+in+the+immune+system.">miR-181 and metabolic regulation in the immune system.</a> Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 78, 223-230 (2013).</li><li>Hori, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-181b+regulates+vascular+stiffness+age+dependently+in+part+by+regulating+TGF-beta+signaling.">miR-181b regulates vascular stiffness age dependently in part by regulating TGF-beta signaling.</a> PLoS One. 12 (3), e0174108 (2017).</li><li>Ebert, M. S., Sharp, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+sponges:+progress+and+possibilities.">MicroRNA sponges: progress and possibilities.</a> RNA. 16 (11), 2043-2050 (2010).</li><li>Ma, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+silencing+of+miR-10b+inhibits+metastasis+in+a+mouse+mammary+tumor+model.">Therapeutic silencing of miR-10b inhibits metastasis in a mouse mammary tumor model.</a> Nature Biotechnology. 28 (4), 341-347 (2010).</li><li>Davis, S., Lollo, B., Freier, S., Esau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+targeting+of+miRNA+with+antisense+oligonucleotides.">Improved targeting of miRNA with antisense oligonucleotides.</a> Nucleic Acids Research. 34 (8), 2294-2304 (2006).</li><li>Davis, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+inhibition+of+microRNA+in+vivo+without+degradation.">Potent inhibition of microRNA in vivo without degradation.</a> Nucleic Acids Research. 37 (1), 70-77 (2009).</li><li>Elmen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LNA-mediated+microRNA+silencing+in+non-human+primates.">LNA-mediated microRNA silencing in non-human primates.</a> Nature. 452 (7189), 896-899 (2008).</li><li>Esau, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+microRNA+with+antisense+oligonucleotides.">Inhibition of microRNA with antisense oligonucleotides.</a> Methods. 44 (1), 55-60 (2008).</li><li>Stenvang, J., Kauppinen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+as+targets+for+antisense-based+therapeutics.">MicroRNAs as targets for antisense-based therapeutics.</a> Expert Opinion on Biological Therapy. 8 (1), 59-81 (2008).</li><li>Lennox, K. A., Behlke, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+direct+comparison+of+anti-microRNA+oligonucleotide+potency.">A direct comparison of anti-microRNA oligonucleotide potency.</a> Pharmaceutical Research. 27 (9), 1788-1799 (2010).</li><li>Lennox, K. A., Behlke, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+modification+and+design+of+anti-miRNA+oligonucleotides.">Chemical modification and design of anti-miRNA oligonucleotides.</a> Gene Therapy. 18 (12), 1111-1120 (2011).</li><li>van Rooij, E., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+therapeutics+for+cardiovascular+disease:+opportunities+and+obstacles.">MicroRNA therapeutics for cardiovascular disease: opportunities and obstacles.</a> Nature Reviews. Drug Discovery. 11 (11), 860-872 (2012).</li><li>Stenvang, J., Petri, A., Lindow, M., Obad, S., Kauppinen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+microRNA+function+by+antimiR+oligonucleotides.">Inhibition of microRNA function by antimiR oligonucleotides.</a> Silence. 3 (1), 1 (2012).</li><li>Levin, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+the+issues+in+the+pharmacokinetics+and+toxicology+of+phosphorothioate+antisense+oligonucleotides.">A review of the issues in the pharmacokinetics and toxicology of phosphorothioate antisense oligonucleotides.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1489 (1), 69-84 (1999).</li><li>Flynt, A. S., Li, N., Thatcher, E. J., Solnica-Krezel, L., Patton, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+miR-214+modulates+Hedgehog+signaling+to+specify+muscle+cell+fate.">Zebrafish miR-214 modulates Hedgehog signaling to specify muscle cell fate.</a> Nature Genetics. 39 (2), 259-263 (2007).</li><li>Kloosterman, W. P., Lagendijk, A. K., Ketting, R. F., Moulton, J. D., Plasterk, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+inhibition+of+miRNA+maturation+with+morpholinos+reveals+a+role+for+miR-375+in+pancreatic+islet+development.">Targeted inhibition of miRNA maturation with morpholinos reveals a role for miR-375 in pancreatic islet development.</a> PLoS Biology. 5 (8), e203 (2007).</li><li>Martello, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+control+of+Nodal+signalling.">MicroRNA control of Nodal signalling.</a> Nature. 449 (7159), 183-188 (2007).</li><li>Fabani, M. M., Gait, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-122+targeting+with+LNA/2'-O-methyl+oligonucleotide+mixmers,+peptide+nucleic+acids+(PNA),+and+PNA-peptide+conjugates.">miR-122 targeting with LNA/2'-O-methyl oligonucleotide mixmers, peptide nucleic acids (PNA), and PNA-peptide conjugates.</a> RNA. 14 (2), 336-346 (2008).</li><li>Fabani, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+inhibition+of+miR-155+function+in+vivo+by+peptide+nucleic+acids.">Efficient inhibition of miR-155 function in vivo by peptide nucleic acids.</a> Nucleic Acids Research. 38 (13), 4466-4475 (2010).</li><li>Babar, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle-based+therapy+in+an+in+vivo+microRNA-155+(miR-155)-dependent+mouse+model+of+lymphoma.">Nanoparticle-based therapy in an in vivo microRNA-155 (miR-155)-dependent mouse model of lymphoma.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (26), E1695-E1704 (2012).</li><li>Torres, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+structure+requirements+and+cellular+targeting+of+microRNA-122+by+peptide+nucleic+acids+anti-miRs.">Chemical structure requirements and cellular targeting of microRNA-122 by peptide nucleic acids anti-miRs.</a> Nucleic Acids Research. 40 (5), 2152-2167 (2012).</li><li>Kent, O. A., McCall, M. N., Cornish, T. C., Halushka, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lessons+from+miR-143/145:+the+importance+of+cell-type+localization+of+miRNAs.">Lessons from miR-143/145: the importance of cell-type localization of miRNAs.</a> Nucleic Acids Research. 42 (12), 7528-7538 (2014).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu makalede açıklanan tasarım ve sentez miRNA-sünger ve nasıl sünger doku özgü ifade doku özgü miRNA aile ifade etkisizleştirmek için güçlü bir araçtır gösterdi.
Sünger hedefleme miR-181 aile bir ifade plazmid ile bir kalp özgü organizatörü klonlanmış göstermiştir. Plazmid verimli bir şekilde nanovector parçacık'dır içine paketlenmiş vitro ve in vivo (Şekil 1) Elektroporasyon veya kuyruk ven enjeksiyon sırasıyla kullanarak. MiR-181 sünger miR-181 ailesinin bir kalp özgü ifade inhibe olabilir ve miR-181 hedef genlerin (Şekil 2) ifade etkileyebilir. Plazmid GFP teslim ve nanovector ifade profil hayvanlar ödün vermeden görselleştirebilirsiniz ilave bir avantajdır.
Kısaca, bir miRNA-sünger miRNA antianlamlı dizileri bir yem miRNA görevi görür mRNA hedef bir muhabir gen sonra yerleştirilen bir dizi oluşur. Doğal olarak meydana gelen miRNA-sünger endogenously bitki ve hayvan hücreleri uzun kodlamayan RNA'ların (lncRNAs)17olarak ifade edilecek bulundu. Bu da çalışmanın, bir sünger yaklaşım tüm miR-181 aile kalbinde etkisizleştirmek için kullanılan. MiR-181-sünger yaklaşım tümleyici miR-181 aile kültürlü hücrelerdeki fizyolojik ilgili bir yöntem olsa da, miR-181-sünger vivo içinde uygulanması zararlı olabilir. Örneğin, çeşitli çalışmalarda bir koruyucu rolü miR-181b farklı hücre/doku türleri18,19,20ve miR-181a göstermiştir. Bu nedenle, miR-181-sünger ifade özellikle kalp dokusu ile hedef olmalıdır.
Küçük oligonucleotides olgun miRNA Kılavuzu strand tavlama aracılığıyla miRNA işlevini engellemek için göstermiştir ve RNA-induced silencing kompleksi (RISC) uygun bir yükleme önlemek. Bu yaklaşım ile ilişkili bir sorun oligonucleotides doyurarak doz olgun miRNAs hücresel takımlık engellemek için yeterli teslim edilecek olması. Oligonucleotides Ayrıca hücresel zarları ve genel kararlılığını molekül arasında taşıma ilgili sorunları muzdarip. Dahiyane, bir exogenously sağlanan miRNA hedef onun soydaş miRNA21tuzak olarak hareket edebilir gösterilmiştir. Birlikte bir sözde 3' UTR gergin birden çok bağlayıcı siteleri sayesinde inşa, yem hedef veya miRNA-sünger, stabil, hedef miRNAs ile etkileşim ve miRNA microribonucleoprotein kompleksleri (miRNPs), böylece etkili çekilmek mümkün miRNA işlevi engelliyor. Hangi verimli tümleyici miRNA olabilir etkili bir anti-sense teknolojisi, sözde "miRNA-sünger" olduğunu vitro ve içinde vivo. Bu nedenle, uygulama miRNA-sünger miRNA işlev kaybı fenotipleri eğitim için kullanılabilir.
RNA müdahale (RNAi) tedavi yeni bir sınıf için neden olabilir fikri yakında onun bulma sonra birçok müfettişler dikkatini çekti. Uygulamalı RNAi tedavi alanında çok hızlı bir şekilde yatağının laboratuardan taşındı. Halen, miRNA therapeutics Onkoloji içinde hızla büyüyen tedavi müdahaleler biridir ve şu anda 1 klinik deneme aşamasındadır. Antianlamlı oligonucleotides veya antagomirs, en çok kullanılan miRNA inhibitör yaklaşımlar biridir. Ma vd. 22 kullanılan miR-10b antagomir, vitro ve in vivoupregulated miR-10b solid tümör susturmak için.
Vivo, upregulated miRNAs verimli susturulması bağlama benzeşme, biostability ve farmakokinetik özellikleri geliştirmek için antagomirs kimyasal bir değişiklik gerektirir. Sıcaklık (Tm) erime Dubleks artırmak ve antagomirs nükleaz dayanıklılığını artırmak için kimyasal değişimleri, 2 '-O-metil (2 '-O-Me), 2 '-O-metoksietil (2 '-MOE) 2 '-fluoro ve kilitli bicyclic nükleik asit (gibi yapılabilir LNA)23,24,25,26,27,28,29,30,31. Vivo teslim daha iyi verimlilik için antagomir nükleaz direnç28artmıştır phosphorothioate (PS) bağlantıları tarafından değiştirilebilir. Buna ek olarak, PS omurga değişiklikler da plazma proteinlerinin idrar atılımı azaltılması için bağlama arttırmak. Böylece, PS-modified antagomirs farmakokinetik özellikleri onların sistemik teslim32kolaylaştırılması, önemli bir gelişme gösterir. Peptit nükleik asit (PNA) veya morpholino reaksiyonlar, belirli bir miRNA hedeflemek için tasarlanmış kullanarak miRNA işlev kaybı fenotipleri33,34,35, eğitim için kullanılabileceğini de gösterilmiştir 36 , 37 , 38 , 39. Polylysine Birleşik ve nanoparçacık complexed PNA antagomirs verimli bir şekilde inhibe miRNA vitro ve in vivo36,37,38, işlev 39. son gelişmeler rağmen bir meydan okuma, bir etkili ve doku özel teslimat miRNA-türev kalır. Bu hedef kapalı etkileri, doğuştan gelen bağışıklık yanıtı tetikleme ve en önemlisi, hedeflenen organ/dokuların hücreleri belirli bir teslim alma olasılığını içerir.
Ayrıca, miRNA ifade düzeyleri çeşitli olmak büyük bağlı olarak hücre ve doku40yazın. Ayrıca, miRNA ifade artırılması veya azaltılması hastalığı. Sünger inhibe miRNA ifade ile cep ve doku fonksiyonları üzerine etkisi ve değiştirilmiş miRNA ifade sonucu onaylanmıştır ve ampirik olarak belirlenen gerekiyor. Hayvan hastalıkları modellerinde geniş preklinik çalışmalar inhibisyon verilen miRNA hedef için en uygun düzeyini belirlemek için ihtiyaç vardır.
İlginçtir, miR - 181c miRNA hücre altı bölünebilme3,4,5sergiler. Özellikle, beklendiği gibi miR-181s çekirdeğinde kodlanmış ve hangi sitoplazma içinde küp şeklinde makine tarafından işlenir ve RISC dahil uzun-pri-miRNA transkript olarak transkripsiyonu. Ancak, sitoplazma içinde işlev kurallı miRNAs, mitokondri ve işlevler özel mitokondriyal genlerinin3tür ile içine olgun formu miR - 181c translocates. Biz miR-181-sünger olgun formu miR - 181 c sitoplazmik kesir bağlayabilirsiniz böylece translocation mitokondri için önleme gösterdi. Sonuç olarak, bir upregulation mt-COX1 mitokondri miR - 181 c ifadenin bir downregülasyon koşullar altında görülebilir.
Biz herhangi bir miRNA ifade vurmak için bir miRNA sünger tasarlamak için gerekli metodoloji bildirdi ve miRNA-sünger vivo içinde uygulanması için bir protokol sıraladı. Doku özgü miRNA inhibisyon Şu anda miRNA alanında gelişmiş bir tekniktir. Downregülasyon önemi veya fonksiyonel upregulated miRNAs insan hastalığında inhibisyonu miRNA biyoloji terapötik müdahale için yararlanmak mümkün olabileceğini düşündürmektedir.
Bu çalışmada başarıyla içinde doku özgü şekilde içinde vivoistihdam edilecek bir miRNA düşürmek için bir strateji vurgulanır. MiRNA-sünger miRNA "tohum" sıra antianlamlı sırasını kullanır. Bu nedenle, öncelikle miRNA-sünger olabilir tüm aynı paylaşmak miRNAs "tohum" dizisi, sırasıyla, tüm miRNA aile. Bu çalışmada, biz tüm miR-181 ailesi (miR-181a, miR-181b, miR - 181 c ve miR - 181 d) önemli bir downregülasyon miR-181-sünger, ifade ile gözlemledim vitro ve içinde vivo. Başka bir aile üyesi aynı organ içinde zararlı etkileri varken bir aile üyesi koruma confers miRNA-sünger teknolojisini kullanarak ideal yaklaşım olurdu değil.

Son yirmi yılda insan hastalığında miRNAs önemli rol işaret çok sayıda çalışma yapılmıştır. Edebiyatı büyük gövdeli bulgular miRNAs kanser1 ve kardiyovasküler hastalık2,3,4,5gibi hastalıkların Patofizyoloji yadsınamaz önemini göstermek. Örneğin, miR-21 upregulated birçok kanserleri, sonuçlanan bir artan hücre döngüsü ve hücre proliferasyonu6' dir. Hepatit C enfeksiyonu, miR-122 virüs7çoğaltma içinde önemli bir rol oynar ve miR-122 inhibisyonu viral yük8azalır kanıtlanmıştır. İçinde kalp hipertrofisi, miR-212/132 upregulated ' kalbinde ve patolojik fenotip9' ilgilenmektedir. Bariz önemini downregülasyon ya da işlevsel bir upregulated miRNA inhibisyonu tedavi amaçlı hemen hemen tüm hastalıklar miRNA biyolojide istismar için fırsatlar öneriyor.
Dört miR-181 aile üyeleri, miR-181a/b/c/d, insan genomu üç genomik konumlarda bulunur. Kümenin miR-181-a/b-1'in bir kodlamayan RNA ana bilgisayar gen (MIR181A1-HG) intronic bölge kodlar. NR6A1 gen intronic bölge miR-181-a/b-2 kodlar. MiR-181-c/d küme uncharacterized bir transkript kromozom 19 üzerinde yer alır. Tüm miR-181 aile üyeleri aynı "tohum" sıra paylaşmak ve tüm dört miR-181 aile üyeleri büyük olasılıkla aynı mRNA hedefleri düzenleyen.
Biz3,4 ve diğerleri10 önemini miR-181 aile fertleri sırasında son aşama kalp yetmezliği parlak nokta. MiR - 181 c upregulation bir tip II diyabet gibi kalp hastalığı riski, obezite ve yaşlanma3,4,5ile ilişkili patolojik şartlar altında gerçekleşir de tanımış. Overexpression miR - 181 c kardiyak disfonksiyon4' e uzanan oksidatif stres nedenleri öne.
Çeşitli gruplar miRNA mitokondri11,12,13,14' te var, ama o miR - 181 c işlenen, nükleer genom türetilmiştir göstermek için ilk tavsiye ettiler ve sonradan mitokondri RISC3için translocated. Ayrıca, kalp5mitokondrial kompartımanda miR-181a ve miR-181b düşük bir ifade tespit etti. Da önemlisi, o miR - 181 c mt-COX1 mRNA ifade represses böylece miRNAs mitokondrial gen düzenlemesi katılmak ve mitokondriyal işlev3,4alter gösteren bulduk.
Bu makalede cardiomyocytes tüm miR-181 ailesinde aşağı vurmak için bir miRNA sünger tasarlamak için gerekli yöntemi anlatılmaktadır. Ayrıca, bir protokol miR-181-sünger vivo içinde uygulanması için anahat.

<table><tbody><tr><td>pEGFP-C1 vector</td><td>Addgene</td><td>6084-1</td><td></td></tr><tr><td>In-fusion</td><td>Clontech</td><td>121416</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Miniprep</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Gel Extraction Kit</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>miR-181-sponge synthesis</td><td>Introgen GeneArt</td><td>custome made</td><td></td></tr><tr><td>PCR primers</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>custome</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI enzymes</td><td>New Endland Biolabs</td><td>R0101S</td><td></td></tr><tr><td>KpnI enzymes</td><td>New Endland Biolabs</td><td>R0142S</td><td></td></tr><tr><td>Rapid DNA Ligation Kit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11635379001</td><td></td></tr><tr><td>H9c2 cells</td><td>ATCC</td><td>CRL-1446</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Media</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10082139</td><td></td></tr><tr><td>Nucleofector 2b Device</td><td>Lonza</td><td>AAB-1001</td><td></td></tr><tr><td>Nucleofector Kits for H9c2 (2-1)</td><td>Lonza</td><td>VCA-1005</td><td></td></tr><tr><td>G418, Geneticin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11811023</td><td></td></tr><tr><td>FACSAria II Flow cytometer</td><td>BD Bioscience</td><td>644832</td><td></td></tr><tr><td>Branson 450 sonifier</td><td>Marshall Scientific</td><td>EDP 100-214-239</td><td></td></tr><tr><td>The Xenogen IVIS Spectrum optical imaging device</td><td>Caliper Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-MTCO1 antibody</td><td>Abcam</td><td>ab14705</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-tubulin antibody</td><td>Abcam</td><td>ab7291</td><td></td></tr><tr><td>Sequoia C256 ultrasound system</td><td>Siemens</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo nanovector delivery of a heart-specific microrna-sponge

MikroRNA (miRNA) küçük çoğu mesajcı RNA (mRNA) ifade inhibe RNA kodlamayan. İnsan hastalıkları, kanser ve kardiyovasküler hastalık, gibi doku ve/veya hastalık ilerlemesi ile ilişkili hücre özgü miRNA ifade etkinleştirmek gösterilmiştir. MiRNA ifade inhibisyonu bir terapötik müdahale için potansiyel sunmaktadır. Ancak, miRNAs, antagomir oligonucleotides, istihdam etkisizleştirmek için geleneksel yaklaşımlar belirli miRNA işlevleri küresel teslim üzerine etkiler. Burada, bir sıçan modelinde bir protokol miR-181 aile içinde vivo kardiyo özgü inhibisyonu için mevcut. MiRNA-sünger yapı 10 tekrarlanan miR-181 bağlayıcı sıraları içerecek şekilde tasarlanmıştır. Kardiyo özgü α-MHC organizatörü kardiyo özgü miR-181 miRNA-sünger ifade sürmeyi pEGFP omurga klonlanmış. İstikrarlı bir hücre oluşturmak için ifade miR-181-sünger, myoblast H9c2 hücre satırı sahip α-MHC-EGFP-miR-181-sponge yapı transfected ve floresan aktif hücre paromisin ile kültürlü GFP olumlu H9c2 hücre içine (FACs) sıralama göre sıralanmış (G418). Paromisin istikrarlı büyüme, monoklonal hücre popülasyonlarının ek FACs ve tek hücre klonlama tarafından oluşturulur. Elde edilen myoblast H9c2-miR-181-sünger-GFP hücreleri yoluyla miR-181 hedef proteinlerin ifade artan değerlendirildi gibi miR-181 aile üyelerinin fonksiyon kaybı sergi ve kapış işlevsel olmayan sünger ifade H9c2 hücrelere kıyasla. Buna ek olarak, tarafından olumlu liposomal nano tanecikleri kullanılıyorsa ve olumsuz miR-181-sünger plazmid tahsil kompleks bir nanovector miR-181-sünger yapı sistemik teslim etmek için geliştirmek. GFP in vivo görüntüleme bir nanovector, üç haftalık süre içinde birden fazla kuyruk ven enjeksiyonları miR-181-sünger önemli bir ifade bir kardiyo özgü şekilde tanıtmak mümkün olduğunu ortaya koymaktadır. Önemlisi, miR-181 fonksiyon kaybı kalp doku ama böbrek veya karaciğer içinde görülmektedir. MiRNA-sünger doku özgü miRNA ifade etkisizleştirmek için güçlü bir yöntemdir. MiRNA-sünger ifade bir doku özgü organizatörü sürüş özgüllük bir hedef organ veya doku binayla miRNA inhibisyonu için sağlar. Ayrıca, nanovector ve miRNA-sünger teknolojileri birleştirerek bir etkili teslim ve doku özgü miRNA inhibisyon vivo içindeverir.

Stabil transfected pEGFP-miR-181-sünger-ifade H9c2 hücrelerinde (Kimden adım 4.2), tüm miR-181 ailesi (miR-181a, miR-181b, miR - 181c ve miR - 181d) ifade orta pEGFP-şifreli-ifade H9c2 hücreleri göre azalma. MiR-181-sünger hizmet veren tüm miR-181 Aile, rekabetçi bir inhibitörü olarak düşündüğümüz bu yüzden ifade miR - 181 c mitokondrial gen hedef, mt-COX1, artırmak. Western blot verileri mt-COX1 ifade pEGFP kapış ifade H9c2 hücrelere kıyasla pEGFP-miR-181-sünger-ifade H9c2 hücrelerinde artış göstermektedir. Ayrıca, herhangi bir ifade değişiklik mt-COX2 veya mt-COX3 için algılanan üzerinden immunoblot pEGFP-miR-181-sünger-ifade H9c2 hücrelerdeki vardı. İmmunoblotting analiz için normalleştirme denetimi olarak α-tübülin kullandık. GFP sinyalleri esas olarak karaciğer ve böbrek kadar 2 hafta sonrası sistemik miR-sünger nanovector (Şekil 1A) teslim tespit edildi. Ancak, GFP ifade miR-181-sünger nanovector teslim (Şekil 1A ve 1B) 3 hafta sonra kalp dokusunda anlamlı olarak daha yüksek. Belirtmek gerekirse bazı hayvanlarda karaciğer dokusunda sistemik doğumdan sonra 3 hafta tespit GFP sinyal vardı; Ancak, miR-181-sünger, o zaman noktasında karaciğerde fonksiyonel hiçbir etkisi vardı.
Western blot kapış nanovector gruplar (Şekil 2) göre miR-181-sünger nanovector enjeksiyonlu fareler mt-COX1 ifadede önemli bir artış gösterdi. MT-COX1 doğrudan hedef için miR - 181 c olduğu gibi daha yüksek mt-COX1 miR-181-sünger nanovector teslim 3 hafta sonra bir daha düşük miR - 181 c ifadesi kalbinde olduğunu göstermektedir. α-tübülin normalleştirme denetimi olarak immunoblots için kullanılır.
Ekokardiyografi öncesinde, sırasında ve hayvanlar kapış nanovector grubuna göre tedavi rejimi sonunda miR-181-sünger nanovector enjeksiyonlu fareler kardiyak fonksiyon içinde herhangi bir değişiklik gösterdi.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57845/57845fig1.jpg"> Şekil 1. Vivo analiz miR-181-sünger nanovector teslim. (A) Bu panel gösterir en uygun 3 haftalık tedavi protokolleri ile 6 İntravenöz enjeksiyonlar kuyruk ven yoluyla. Epifluorescence görüntü sarı renklendirme pEGFP vektör ifade gösterir. Sarı renklendirme maksimum yoğunluğu hafta 3 saat noktası görülmektedir. (B) α-MHC organizatörü pEGFP vektör sırayla gün 21 saat seçmeli olarak miR-181-sünger veya kalp şifreli sırayla ifade eder. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57845/57845fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57845/57845fig2.jpg"> Şekil 2. MiR-181-sünger nanovector etkisi miR - 181c ifade doğrulanmasını. PEGFP-scramble ve pEGFP-miR-181-sünger nanovector enjeksiyonlu fareler elde kalp lysates mt-COX1 ifadede western blot analizidir. Bütün kalp homogenates ile belirtilen antikorlar probed. Yükleme denetimi olarak α-tübülin kullanılır. Grup Dansitometresi bar grafikte gösterilir. Öğrenci t-testi gerçekleştirilen ve standart hata hata çubukları çubuk grafiği çizildi. p < 0,05 vs pEGFP-kapış grup. n = 4.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Astar adı</td>
			<td colspan="2">Sıra</td>
			<td>TM</td>
			<td>Notlar</td>
			<td>Kullanım</td>
			<td>Hedef</td>
		</tr>
<tr>
<td>SAM3-1F</td>
			<td colspan="2">ATGCATTAGTTATTAATGCTT GACACACTTGACAATTTCT</td>
			<td>58.4</td>
			<td>EGFP Clone sıçan MHC organizatörü</td>
			<td>PCR</td>
			<td>MHC organizatörü</td>
		</tr>
<tr>
<td>SAM3-2R</td>
			<td colspan="2">GACCGGTAGCGCTAGCTG ACTCACTGGGAGATTGCTT</td>
			<td>59.8</td>
			<td>EGFP Clone sıçan MHC organizatörü</td>
			<td>PCR</td>
			<td>MHC organizatörü</td>
		</tr>
<tr>
<td>SAM3-3F</td>
			<td colspan="2">CGAACGACCTACACCGAACT</td>
			<td>64</td>
			<td>Ekran EGFP-F</td>
			<td>Koloni PCR</td>
			<td>Pozitif organizatörü klonlar</td>
		</tr>
<tr>
<td>SAM3-4R</td>
			<td colspan="2">CGCTAGTCCTTGACCCTCTG</td>
			<td>63.9</td>
			<td>Ekran MHC-R</td>
			<td>Koloni PCR</td>
			<td>Pozitif organizatörü klonlar</td>
		</tr>
<tr>
<td>SAM5-1F</td>
			<td colspan="2">CCTGTCTCCAACACACAAGC</td>
			<td>59.3</td>
			<td>Sıra MHC organizatörü</td>
			<td>Sıralama</td>
			<td>MHC organizatörü</td>
		</tr>
<tr>
<td>SAM5-2R</td>
			<td colspan="2">CAGACTGCAGGGCTGGTT</td>
			<td>60</td>
			<td>Sıra MHC organizatörü</td>
			<td>Sıralama</td>
			<td>MHC organizatörü</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1. Astar dizileri.

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Nanovector Delivery of a Heart-specific MicroRNA-sponge at JoVE.com

In Vivo Nanovector Delivery of a Heart-specific MicroRNA-sponge

Vivo Nanovector teslim kalp özel mikroRNA-sünger

Doku özel mikroRNA inhibisyon mikroRNA alanında az gelişmiş bir teknolojidir. Burada, biz başarılı bir şekilde myoblast hücreleri miR-181 mikroRNA ailesinde kalp etkisizleştirmek için bir protokol tanımlamak. Nanovector teknoloji önemli vivo kardiyo özgü miR-181 aile inhibisyon gösteren sünger bir mikroRNA amacıyla kullanılabilir.

MicroRNA (miRNA) is small non-coding RNA which inhibits post-transcriptional messenger RNA (mRNA) expression. Human diseases, such as cancer and ...

in-vivo-nanovector-delivery-of-a-heart-specific-microrna-sponge

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

In Vivo Nanovector Delivery of a Heart-specific MicroRNA-sponge

7.3K Görüntüleme.  University of Toronto. Doku özel mikroRNA inhibisyon mikroRNA alanında az gelişmiş bir teknolojidir. Burada, biz başarılı bir şekilde myoblast hücreleri miR-181 mikroRNA ailesinde kalp etkisizleştirmek için bir protokol tanımlamak. Nanovector teknoloji önemli vivo kardiyo özgü miR-181 aile inhibisyon gösteren sünger bir mikroRNA amacıyla kullanılabilir.

Video: In Vivo Nanovector Delivery of a Heart-specific MicroRNA-sponge

Delivery of Modified mRNA in a Myocardial Infarction Mouse Model

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality in the Western world. In the past decade, gene therapy has become a promising treatment option for heart disease, owing to its efficiency and exceptional therapeutic effects. In an effort to repair the damaged tissue post-MI, various studies have employed DNA-based or viral gene therapy but have faced considerable hurdles due to the poor and uncontrolled expression of the delivered genes, edema, arrhythmia, and cardiac hypertrophy. Synthetic modified mRNA (modRNA) presents a novel gene therapy approach that offers high, transient, safe, nonimmunogenic, and controlled mRNA delivery to the heart tissue without any risk of genomic integration. Due to these remarkable characteristics combined with its bell-shaped pharmacokinetics in the heart, modRNA has become an attractive approach for the treatment of heart disease. However, to increase its effectiveness in vivo, a consistent and reliable delivery method needs to be followed. Hence, to maximize modRNA delivery efficiency and yield consistency in modRNA use for in vivo applications, an optimized method of preparation and delivery of modRNA intracardiac injection in a mouse MI model is presented. This protocol will make modRNA delivery more accessible for basic and translational research.

This protocol presents a simple and coherent way to transiently upregulate a gene of interest using modRNA after myocardial infarction in mice.

Miyokard Enfarktüsü Fare Modelinde Modifiye mRNA Teslimi

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality in the Western world. In the past decade, gene therapy has become a promising ...

Genetik

Nanoparticle-mediated siRNA Gene-silencing in Adult Zebrafish Heart

Mammals have a very limited capacity to regenerate the heart after myocardial infarction. On the other hand, the adult zebrafish regenerates its heart after apex resection or cryoinjury, making it an important model organism for heart regeneration study. However, the lack of loss-of-function methods for adult organs has restricted insights into the mechanisms underlying heart regeneration. RNA interference via different delivery systems is a powerful tool for silencing genes in mammalian cells and model organisms. We have previously reported that siRNA-encapsulated nanoparticles successfully enter cells and result in a remarkable gene-specific knockdown in the regenerating adult zebrafish heart. Here, we present a simple, rapid, and efficient protocol for the dendrimer-mediated siRNA delivery and gene-silencing in the regenerating adult zebrafish heart. This method provides an alternative approach for determining gene functions in adult organs in zebrafish and can be extended to other model organisms as well.

It remains a major challenge to develop conditional gene-knockout or effective gene-knockdown in adult zebrafish organs. Here we report a protocol for performing nanoparticle-mediated siRNA gene-silencing in adult zebrafish heart, thus providing a new loss-of-function method for studying adult organs in zebrafish and other model organisms.

Nanopartikül aracılı siRNA Gene susturmak yetişkin zebra balığı kalbinde

Mammals have a very limited capacity to regenerate the heart after myocardial infarction. On the other hand, the adult zebrafish regenerates its heart ...

Gelişim Biyolojisi

<meta charset="utf8"></head><body>Metastatik Meme Kanserini Tedavi Etmek için Onkojenik miRNA-10b'yi Hedefleyen Nano İlaç

Monitoring of Nanodrug Accumulation in Murine Breast Cancer Metastases

Metastatic breast cancer is a devastating disease with very limited therapeutic options, calling for new therapeutic strategies. Oncogenic miRNAs have been shown to be associated with the metastatic potential of breast cancer and are implicated in tumor cell migration, invasion, and viability. However, it can be difficult to deliver an inhibitory RNA molecule to the tissue of interest. To overcome this challenge and deliver active antisense oligonucleotides to tumors, we utilized magnetic iron oxide nanoparticles as a delivery platform. These nanoparticles target tissues with increased vascular permeability, such as sites of inflammation or cancer. Delivery of these nanoparticles can be monitored in vivo by magnetic resonance imaging (MRI) due to their magnetic properties. Translation of this therapeutic approach into the clinic will be more accessible because of its compatibility with this relevant imaging modality. They can also be labeled with other imaging reporters such as a Cy5.5 near-infrared optical dye for correlative optical imaging and fluorescence microscopy. Here, we demonstrate that nanoparticles labeled with Cy5.5 and conjugated to therapeutic oligomers targeting oncogenic miRNA-10b (termed MN-anti-miR10b, or &#34;nanodrug&#34;) administered intravenously accumulate in metastatic sites, opening a possibility for therapeutic intervention of metastatic breast cancer.

<meta charset="utf8"></head><body>Murin Meme Kanseri Metastazlarında Nanoilaç Birikiminin İzlenmesi

Here, we describe the protocol for in vivo delivery of magnetic iron oxide nanoparticles carrying RNA oligomers to metastatic breast cancer in animal models, providing a clinically viable approach for the therapeutic silencing of oncogenic nucleic acids.

Murin Meme Kanseri Metastazlarında Nanoilaç Birikiminin İzlenmesi

Metastatic breast cancer is a devastating disease with very limited therapeutic options, calling for new therapeutic strategies. Oncogenic miRNAs have ...

Kanser Araştırmaları

A Simple Alternative to Stereotactic Injection for Brain Specific Knockdown of miRNA

MicroRNAs (miRNAs) are key regulators of gene expression. In the brain, vital processes like neurodevelopment and neuronal functions depend on the correct expression of microRNAs. Perturbation of microRNAs in the brain can be used to model neurodegenerative diseases by modulating neuronal cell death. Currently, stereotactic injection is used to deliver miRNA knockdown agents to specific location in the brain. Here, we discuss strategies to design antagomirs against miRNA with locked nucleotide modifications (LNA). Subsequently describe a method for brain specific delivery of antagomirs, uniformly across different regions of the brain. This method is simple and widely applicable since it overcomes the surgery, associated injury and limitation of local delivery in stereotactic injections. We prepared a complex of neurotropic, cell-penetrating peptide Rabies Virus Glycoprotein (RVG) with antagomir against miRNA-29 and injected through tail vein, to specifically deliver in the brain. The antagomir design incorporated features that allow specific targeting of the miRNA and formation of non-covalent complexes with the peptide. The knock-down of the miRNA in neuronal cells, resulted in apoptotic cell death and associated behavioural defects. Thus, the method can be used for acute models of neuro-degeneration through the perturbation of miRNAs.

MicroRNAs play crucial roles in the brain and are potential targets for modeling neuro-degeneration. However, perturbing miRNA levels is challenging due to the short length of miRNA and inaccessibility of the brain tissue. This video presents a method for antagomir design and brain specific delivery using a neuropeptide in mice.

MiRNA Beyin Özgül demonte için Stereotaktik Injection Basit Alternatif

MicroRNAs (miRNAs) are key regulators of gene expression.  In the brain, vital processes like neurodevelopment and neuronal functions depend on the ...

Nörobilim

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

To date, the available surgical and pharmacological treatments for cardiovascular diseases (CVD) are limited and often palliative. At the same time, gene and cell therapies are highly promising alternative approaches for CVD treatment. However, the broad clinical application of gene therapy is greatly limited by the lack of suitable gene delivery systems. The development of appropriate gene delivery vectors can provide a solution to current challenges in cell therapy. In particular, existing drawbacks, such as limited efficiency and low cell retention in the injured organ, could be overcome by appropriate cell engineering (i.e., genetic) prior to transplantation. The presented protocol describes the efficient and safe transient modification of endothelial cells using a polyethyleneimine superparamagnetic magnetic nanoparticle (PEI/MNP)-based delivery vector. Also, the algorithm and methods for cell characterization are defined. The successful intracellular delivery of microRNA (miR) into human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) has been achieved without affecting cell viability, functionality, or intercellular communication. Moreover, this approach was proven to cause a strong functional effect in introduced exogenous miR. Importantly, the application of this MNP-based vector ensures cell magnetization, with accompanying possibilities of magnetic targeting and non-invasive MRI tracing. This may provide a basis for magnetically guided, genetically engineered cell therapeutics that can be monitored non-invasively with MRI.

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

This manuscript describes the efficient, non-viral delivery of miR to endothelial cells by a PEI/MNP vector and their magnetization. Thus, in addition to genetic modification, this approach allows for magnetic cell guidance and MRI detectability. The technique can be used to improve the characteristics of therapeutic cell products.

Hazırlık ve<em&gt; İn Vitro</em&gt; Mıknatıslanmış karakterizasyonu Endotel Hücreleri miR-modifiye

To date, the available surgical and pharmacological treatments for cardiovascular diseases (CVD) are limited and often palliative. At the same time, gene ...

Tıp

Long-term Silencing of Intersectin-1s in Mouse Lungs by Repeated Delivery of a Specific siRNA via Cationic Liposomes. Evaluation of Knockdown Effects by Electron Microscopy

Previous studies showed that knockdown of ITSN-1s (KDITSN), an endocytic protein involved in regulating lung vascular permeability and endothelial cells (ECs) survival, induced apoptotic cell death, a major obstacle in developing a cell culture system with prolonged ITSN-1s inhibition1. Using cationic liposomes as carriers, we explored the silencing of ITSN-1s gene in mouse lungs by systemic administration of siRNA targeting ITSN-1 gene (siRNAITSN). Cationic liposomes offer several advantages for siRNA delivery: safe with repeated dosing, nonimmunogenic, nontoxic, and easy to produce2. Liposomes performance and biological activity depend on their size, charge, lipid composition, stability, dose and route of administration3Here, efficient and specific KDITSN in mouse lungs has been obtained using a cholesterol and dimethyl dioctadecyl ammonium bromide combination. Intravenous delivery of siRNAITSN/cationic liposome complexes transiently knocked down ITSN-1s protein and mRNA in mouse lungs at day 3, which recovered after additional 3 days. Taking advantage of the cationic liposomes as a repeatable safe carrier, the study extended for 24 days. Thus, retro-orbital treatment with freshly generated complexes was administered every 3rd day, inducing sustained KDITSN throughout the study4. Mouse tissues collected at several time points post-siRNAITSN were subjected to electron microscopy (EM) analyses to evaluate the effects of chronic KDITSN, in lung endothelium. High-resolution EM imaging allowed us to evaluate the morphological changes caused by KDITSN in the lung vascular bed (i.e. disruption of the endothelial barrier, decreased number of caveolae and upregulation of alternative transport pathways), characteristics non-detectable by light microscopy. Overall these findings established an important role of ITSN-1s in the ECs function and lung homeostasis, while illustrating the effectiveness of siRNA-liposomes delivery in vivo.

Repeated retro-orbital injections of cationic liposomes/siRNA/ITSN-1s complexes in mice, every 72 hours for 24 days, efficiently deliver the siRNA duplex to the mouse lung microvasculature reducing ITSN-1s mRNA and protein expression by 75%. This technique is highly reproducible in an animal model, has no adverse effects and avoids fatalities.

Katyonik lipozomlar üzeri özel siRNA tekrar teslim ile Fare Akciğerler Intersectin-1s uzun süreli suskunluğu. Elektron Mikroskobu ile demonte Etkilerinin Değerlendirilmesi

Previous  studies showed that knockdown of ITSN-1s (KDITSN), an endocytic  protein involved in regulating lung vascular permeability and endothelial cells ...

Biyoloji

<meta charset="utf8"></head><body>In Vivo Gen Modülasyonu için Lentiviral Vektör Hazırlama

Lentiviral Vector Preparation for Efficient Gene and MicroRNA Modulation of Peritoneal Cavity Tissue&#45;Resident Macrophages In Vivo in Mice

Peritoneal tissue-resident macrophages have broad functions in the maintenance of homeostasis and are involved in pathologies within local and neighboring tissues. Their functions are dictated by microenvironmental cues; thus, it is essential to investigate their behavior in an in vivo physiological niche. Currently, specific peritoneal macrophage-targeting methodologies employ whole-mouse transgenic models. Here, a protocol for effective in vivo modulation of mRNA and small RNA species (e.g., microRNA) expression in peritoneal macrophages using lentivirus particles is described. Lentivirus preparations were made in HEK293T cells and purified on a single sucrose layer. In vivo validation of lentivirus effectivity following intraperitoneal injection revealed predominant infection of macrophages restricted to local tissue. Targeting of peritoneal macrophages was successful during homeostasis and thioglycolate-induced peritonitis. The limitations of the protocol, including low-level inflammation induced by intraperitoneal delivery of lentivirus and time restrictions for potential experiments, are discussed. Overall, this study presents a quick and accessible protocol for the rapid assessment of gene function in peritoneal macrophages in vivo.

<meta charset="utf8"></head><body>Yazar Spotlight: Lentiviral Vektör Aracılı Gen Manipülasyonu Yoluyla Makrofaj İmmünometabolizmasını Keşfetmek

We demonstrate a step-by-step protocol for the investigation of gene function in peritoneal tissue-resident macrophages in vivo, using lentiviral vectors.

Farelerde İn Vivo Periton Boşluğu Dokusunda Yerleşik Makrofajların Verimli Gen ve MikroRNA Modülasyonu için Lentiviral Vektör Hazırlığı

Peritoneal tissue-resident macrophages have broad functions in the maintenance of homeostasis and are involved in pathologies within local and neighboring ...

Vivo Nanovector teslim kalp özel mikroRNA-sünger

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Miyokard Enfarktüsü Fare Modelinde Modifiye mRNA Teslimi

Nanopartikül aracılı siRNA Gene susturmak yetişkin zebra balığı kalbinde

Murin Meme Kanseri Metastazlarında Nanoilaç Birikiminin İzlenmesi

Murin Meme Kanseri Metastazlarında Nanoilaç Birikiminin İzlenmesi

Murin Meme Kanseri Metastazlarında Nanoilaç Birikiminin İzlenmesi

MiRNA Beyin Özgül demonte için Stereotaktik Injection Basit Alternatif

Hazırlık ve

Katyonik lipozomlar üzeri özel siRNA tekrar teslim ile Fare Akciğerler Intersectin-1s uzun süreli suskunluğu. Elektron Mikroskobu ile demonte Etkilerinin Değerlendirilmesi

Farelerde İn Vivo Periton Boşluğu Dokusunda Yerleşik Makrofajların Verimli Gen ve MikroRNA Modülasyonu için Lentiviral Vektör Hazırlığı

Farelerde İn Vivo Periton Boşluğu Dokusunda Yerleşik Makrofajların Verimli Gen ve MikroRNA Modülasyonu için Lentiviral Vektör Hazırlığı